Разработка технологии использования биопрепарата для ремедиации почв, загрязненных пестицидом прометрин, в лабораторных и полевых условиях

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является создание биопрепаратов на основе штаммов-деструкторов, выделенных из аборигенной микрофлоры, для решения комплекса задач, связанных с реабилитацией почв, загрязненных ксенобиотиками. Особенно сильному разрушающему влиянию подвергаются почвы вследствие интенсивного применения пестицидов с нарушением норм и правил их использования, что приводит к их значительному накоплению в почвах. Также особую опасность представляют полигоны захоронения неиспользованных или запрещенных химикатов. Естественные процессы самоочищения почв не способны справиться с такими объемами загрязнений [1,2].

Известно, что плодородие и самоочищение почв напрямую зависят от активности микробиологических процессов, однако в результате высокой интоксикации почвы автохтонная микрофлора ингибируется [3]. Поэтому разработка комплексных технологий, направленных на восстановление основных функций почв и повышение их плодородия представляет значительный научный интерес, как для теоретической, так и для прикладной микробиологии. В настоящее время для решения проблем очистки загрязненных почв в качестве приоритетных рассматриваются методы биологической ремедиации [4-

Васнецова Елена Владимировна, аспирантка

• 6]. Биодеструкция считается наиболее перспективным направлением в технологиях рекультивации почвенных систем, зараженных органическими поллютантами, в том числе и пестицидами. На настоящий момент выделено и депонировано большое количество штаммов пестицид-деструкторов, как в виде монокультур, так и в консорциумах [7-9], однако практическое их применение в целях биоремедиации почв возможно только после изготовления из них биопрепаратов и разработки технологии применения.

Цель исследования: разработка технологии использования биопрепарата для ремедиации почв, загрязненных пестицидом прометри-ном, в лабораторных и полевых условиях на примере чернозема южного.

Материалы и методы.

Объекты исследования: прометрин [N2,N4 -ди-изопропил-6-метилтио-1,3,5-триа-зин-2,4-диамин] - высокоэффективный гербицид с однолетними двудольными и злаковыми сорняками. «Гезагард» - препаративная форма пестицида с действующим веществом промет-рин. Штамм бактерий, выделенный из почвы, экспериментально загрязненной пестицидом прометрин, Pseudomonas putida П2, депонированный в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН в качестве прометрин-деструктора (свидетельство о депонировании №12310/02-1-4-940 от 28.03.2013). Биопрепарат на основе данного штамма [10]. Почва - чернозем южный, среднесуглинистый, мощность 0,8 м, содержание гумуса по ГОСТ 26213 - 2,8%, содержание общего азота по ГОСТ 26107 - 0,15%, содержание аммонийного азота -1,3 мг/кг, содержание нитратного азота -89,1 мг/кг, объемная масса почвы - 1,43 см3, общая пористость почвы- 46%, соотношение С:N – 9,1, кислотность водного раствора почвы 7,79, емкость катионного обмена по ГОСТ 17.4.4.01 – 30,0, насыщенность основаниями – 90%, содержание подвижного фосфора по ГОСТ 26205 – 407 мг/кг, подвижного калия – 407 мг/кг, сумма анионов и катионов – 0,079%.

Методы исследования. Индикацию штамма-деструктора в составе общей микробиоты почвы проводили на твердой среде М9 (состав среды, г/л: Na2HPO4•Н2O – 6,0; КН2PO4 – 3,0; NaCl – 0,5; NH4Cl – 1,0, вода дистиллированная – до 1000 мл; рН среды до стерилизации – 6,8–7,0) с добавлением в нее пестицида в качестве источника углерода 0,01% 2,3,5–трифенил-тетразолия хлорида (ТТХ) в качестве индикатора дегидрогеназной активности бактерий [11]. Выращивание биомассы прометрин-деструктора Pseudomonas putida П2 проводили методом глубинного культивирования в лабораторном ферментере в модифицированной среде КГКДЭ (состав среды, г/л: кислотный гидролизат казеина (КГК) (производство HighMedia, Индия) – 10; дрожжевой экстракт (ДЭ) (производство High-Media, Индия) –5; глюкоза – 25; (NH4)2SO4 – 4,0; MgSO4•7H2O – 0,3; K2HPO4 – 2,0; пеногаситель «Пента–474» (производство ООО «Пента–91») – 0,3 мл, вода дистиллированная – до 1000 мл, рН – 6,8–7,0. Процесс ферментации проводили в 3 цикла в лабораторном ферментере с общим объемом 1 л. Рабочий объем среды составлял 600 мл (60% от общего объема). Параметры культивирования подбирались экспериментально.

Определение концентрации бактериальных клеток в культуральной жидкости проводили на спектрофотометре СФ–102 (НПО «ИНТЕРФОТО-ФИЗИКА») при постоянных параметрах: длина волны λ=630 нм, длина кюветы l=10 мм (ОП630). Количество клеток определяли по калибровочному графику, выражающему зависимость оптической плотности ОП630 культуральной жидкости от количества клеток, определенного по стандарту мутности БАК–10 (производство ООО «ОРМЕТ»). Внесение пестицида и биопрепарата в почву: при загрязнении почвы использовали промышленный препарат «Гезагард» с действующим веществом (ДВ) прометрином, который вносили в почву с таким расчетом, чтобы конечная концентрация ДВ в почве соответствовала 100 ПДК (50 мг/кг). Концентрация и объем вносимой бактериальной суспензии был рассчитан так, чтобы конечная концентрация микроорганизмов была порядка 108 клеток на 1 г воздушно-сухой почвы, а увлажненность почвы составляла не более 60% от ПВ. В качестве жидкой фазы суспензии использовали минеральную среду М9 с 0,1% сахарозой. Отбор проб и определение концентрации пестицидов проводили на 7-е, 14-е и 30-е сутки. Определение концентрации пестицидов проводили на хромато- масс-спектрометре Agilent Technologies (GH 7820A,MS 5975) с низкополярной колонкой HP– 5MS. Условия программы и режима прибора подбирали для каждого из веществ индивидуально в соответствии с данными библиотеки спектров MS Search v.2.0. Пробоподготовку и экстракцию проводили в соответствии со стандартными методиками (РД 52.18.188–2001; РД 52.24.411– 2009). Токсичность почвы определяли с использованием стандартных тест–объектов Daphnia magna Straus и Chlorella vulgaris Beijer в соответствии с ПНД Ф Т 14.1:2:4.12–06 (Т16.1:2:3:3.9–06, ФР.1.31.2009.066410) и ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.10–04 (16.1:2.3.7–04). Отбор образцов почв на все виды исследований проводили согласно нормативным документам (ГОСТ 28168– 89; ГОСТ 17.4.3.01–83; ГОСТ 17.4.4.02–84). Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам с использованием программ статистического пакета Excel (MS Office 2007). Повторность всех экспериментов трехкратная.

Результаты исследований и их обсуждение. Разработка технологии использования биопрепарата на основе штамма-деструктора проводилась в 2 этапа:

• 1    – изучение процесса деструкции пестицида прометрина штаммом Pseudomonas putida П2 в лабораторных условиях;

• 2    – испытание деструктивных свойств биопрепарата на основе модельного биодеструктора на экспериментально загрязненных почвенных системах в полевых условиях.

На 2 этапе представляло интерес оценить эффективность ремедиации экспериментально загрязненной почвы в естественных климатических условиях при использовании агротехнических приемов и внесении штамма деструктора по данным химико-аналитических и токсикологических исследований.

Изучение процесса деструкции пестицида в лабораторных условиях. Для определения разрушения пестицида под действием аборигенной микрофлоры или интродуцированного биодеструктора совместно с аборигенной микрофлорой нами были проведены лабораторные исследования деградации пестицида в стерильной и нестерильной почве, а также нестерильной почве с внесение биодеструктора в течение 30 суток. Анализ полученных результатов в стерильной почве не выявил снижения концентрации пестицида. В результате применения технологии активизации аборигенной почвенной микрофлоры классическими агротехническими приемами (внесение минерально-углеводных добавок, увлажнение, рыхление) степень деструкции к 30-м суткам составила только 16%. А в почве, инокулированной биодеструктором деградация прометрина была значительно выше и составила 70% (рис. 1).

стерильная почва нестерильная почва +агротех. приемы нестерильная почва+биодеструктор +агротех. приемы

Рис. 1. Динамика деградации прометрина в почве в различных условиях

Внесение штамма P. putida П2 в стерильную и нестерильную почву с последующими периодическими высевами на два варианта сред (питательную МПА и элективную М9) показало его конкурентоспособность и сохранение деструктивных свойств в присутствии аборигенной микрофлоры. Концентрация интродуцированного штамма P. putida П2 на протяжении 30 суток оставалась стабильно высокой.

Изучение деградации пестицида про-метрина в полевых условиях. Для проведения полевого эксперимента были подготовлены 3 экспериментальных участка площадью по 20 м2, оборудованные тентованными навесами для укрытия от дождя, изолированные от прилегающей территории и друг от друга. При помощи специально оснащенной агротехники почва была окультурена на глубину 10-12 см, на все участки был внесен агрохимикат «Гезагард» в количестве 50 мг/кг (100 ПДК) ДВ (прометрина) в почве. В соответствии с задачами эксперимента на участках оценивали эффективность технологий ремедиации земель, загрязненных «Гезагардом». Назначение участков и приемы ремедиации приведены в табл. 1. На протяжении всего экспери -мента влажность полевой почвы поддерживали на уровне около 40% от ПВ. Эффективность проведенных технологических агроприемов оценивали по снижению концентрации пестицида (рис. 2) и показателям токсичности почвы.

Таблица 1. Назначение участков для проведения полевого эксперимента по оценке эффективности применяемых технологических агроприемов и внесения разработанного биопрепарата

№ уч-ка	Задачи эксперимента	Приемы ремедиации загрязненной почвы	Внесенные компоненты
1	деструкция пестицида под воздействием естественных факторов окружающей среды. Загрязненный контроль	агроприемы не проводились	«Гезагард», вода водопроводная
2	деструкция пестицида в почве под воздействием естественных факторов окружающей среды с применением агротехнических приемов	агротехнические приемы (полив и аэрация почвы рыхлением), стимулирование автохтонной микрофлоры	«Гезагард», вода водопроводная, углеводноминеральные добавки
3	деструкция пестицида в почве под воздействием естественных факторов окружающей среды с применением агротехнических приемов и влиянием внесенного деструктора в виде водной суспензии	агротехнические приемы (полив и аэрация почвы рыхлением), стимулирование автохтонной микрофлоры, внесение суспензии деструктора	«Гезагард», вода водопроводная, углеводноминеральные добавки, водная суспензия биомассы штамма-деструктора P. putida П2 (10 8 кл/г почвы)

Установлено, что при внесении в загрязненную почву соответствующего биодеструктора степень деградации пестицида в течение 30 суток возрастает до 70%. Внесение биодеструктора оказалось наиболее эффективным, чем использование только технологии активизации почвен-ной микрофлоры агротехническими приемами, где степень деструкции прометрина составила 13,5% (участок № 2). На участке № 1 и концентрация прометрина снизилась незначительно. Сразу после загрязнения почвы «Гезагардом», но до внесения биопрепаратов, с каждого участка были отобраны обобщенные образцы почв для определения исходной токсичности. Через 30 суток для определения остаточной токсичности также были отобраны обобщенные образцы почв индии-видуально с каждого участка. Токсичность экспериментальных почв, загрязненных прометрином определяли биотестированием. Установлено острое токсическое действие вытяжек почв на биотест-объекты Daphnia magna Straus и Chlorella vulgaris Beijer сразу после загрязнения пестицидом. В результате проведенных мероприятий по биоремедиации токсичность почвы участка № 3 значительно снизилась по сравнению с контрольным участком № 1.

№Ы

□ Участок 1

□ Участок 2

□ Участок 3

7 суток 14 суток 21 сутки 30 сутки

Рис. 3. Динамика изменения концентрации прометрина в почве экспериментальных участков

Выводы: при анализе химических и токсикологических показателей выявлено, что под воздействием биотических и абиотических 6. факторов в полевых условиях, но без проведения агротехнических и биоремедиационных мероприятий, концентрация прометрина в почве практически не изменяется. Применение технологических агроприемов без проведения биоремедиации незначительно стимулирует активность аборигенной микрофлоры к деструкции 7. пестицида. Использование технологических агроприемов в сочетании с внесением штамма-биодеструктора в почву оказало значительное влияние на активность и скорость процессов биоремедиации почвы, загрязненной прометри-ном.                                                    .