Разработка вакцины против птичьего гриппа на основе структурно модифицированных вирусов растений

Грипп относится к наиболее заразным и быстро распространяющимся инфекционным заболеваниям (1). Его возбудители — РНК-содер-жащие вирусы семейства Orthomyxoviridaе . Хотя природным резервуаром вируса гриппа А служат дикие птицы, эти вирусы могут заражать также домашнюю птицу и несколько видов млекопитающих, включая человека. Эпизоотии, этиологический связанные с вирусом гриппа А, наносят заметный ущерб сельскому хозяйству. В настоящее время борьба с гриппом птиц предполагает введение карантинов, а также забой инфицированных и контактировавших с ними особей, что приводит к значительным экономическим потерям. Из всех вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц, наибольшую опасность для человека представляет штамм H5N1 в связи с большим числом случаев заражения людей при контакте с инфицированными птицами и самым высоким процентом смертельных исходов (2).

Наиболее эффективным способом профилактики эпидемий и панзоотий гриппа считается вакцинация. Для получения современных лицензированных вакцин против вирусов гриппа используют куриные эмбрионы, и производство таких вакцин для каждого штамма занимает до 6-9 мес, что в случае появления нового пандемического штамма может иметь не-

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда в рамках приоритетного направления деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)» (грант ¹ 14-24-00007).

предсказуемые последствия. Кроме того, применение традиционных методов ограничено высокой вирулентностью штамма H5N1 для цыплят, куриных эмбрионов и потенциальной опасностью для человека.

Конструирование рекомбинантных белков рассматривается как альтернативный подход для создания универсальных, безопасных и эффективных вакцин против вируса птичьего гриппа (3). Однако в ряде работ сообщается, что наиболее перспективные для включения в вакцину вирусные белки (поверхностный белок гемагглютинин HA, который служит основной мишенью для нейтрализующих антител, и консервативный матрикс-ный белок М2) имеют низкую иммуногенность и не могут стимулировать эффективный иммунный ответ (4-7). Одно из решений проблемы — использование вирусов растений (8-10) и вирусоподобных частиц на их основе для презентации эпитопов протективных антигенов и усиления иммунного ответа (11-15).

Ранее мы показали, что при нагревании спирального вириона вируса табачной мозаики (ВТМ) до 94 °С происходит структурная перестройка вирусного белка и формируются сферические частицы (СЧ) контролируемого размера. Такие СЧ биодеградируемы, не содержат РНК и обладают высокой стабильностью. Кроме того, СЧ безопасны для человека, так как растения и животные не имеют общих патогенов (16-19). В то же время СЧ — эффективные иммуностимуляторы (11).

В настоящем исследовании для создания ветеринарной кандидат-ной вакцины использованы уникальные, не имеющие аналогов частицы — СЧ. Впервые получены комплексы СЧ—HA62/284-М2е, содержащие сферические частицы, образованные при термической перестройке ВТМ, и адсорбированные на их поверхности рекомбинантные антигены HA62/284 и М2е вируса гриппа А, и продемонстрировано сохранение антигенной специфичности рекомбинантных белков. Такие комплексы оказались высокоиммуногенными: при иммунизации лабораторных животных показана выработка специфических антител к обеим антигенным детерминантам вируса гриппа А птиц.

Цель представляемой работы заключалась в разработке рекомбинантной кандидатной вакцины нового поколения против вируса птичьего гриппа, полученной посредством сборки in vitro комплексов, включающих иммуногенные эпитопы белков НА и М2 вируса гриппа А на поверхности сферических частиц на основе вириона вируса табачной мозаики.

Методика . Вирионы ВТМ (штамм U1) выделяли из инфицированных растений Nicotiana tabacum L. сорта Samsun, как описано ранее (20). СЧ получали из очищенного препарата ВТМ (5 мг/мл) при 94 °С согласно протоколу (18).

Рекомбинантный белок, содержащий фрагмент молекулы НА вируса гриппа А (16 кДа), был сконструирован на основе штамма A/Kurgan/5/05. Синтез соответствующего фрагмента кДНК гена гемагглютинина осуществляли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с праймерами H562-284-P (5‘-GCGGATCCGGAGTGAAGCCTCTAATTTTA-AGAGATT-3’) и H562-284-M (5'-CGTCTAGATTATTCACTTTTCATAATTA-TTGTTGAGTCCCCT-3'). Амплифицированный фрагмент клонировали по сайтам рестрикции BamHI и XbaI в вектор pQE30 («Qiagen N.V.», Германия). Рекомбинантный белок HA62/284 был экспрессирован в клетках Escherichia coli штамма M15 и очищен по стандартной методике (21). Рекомбинантный белок массой 26 кДа, содержащий эпитоп М2е (23 а.о.) белка М2 вируса гриппа А, слитый с белком дегидрофолатредуктазой, экспрессировали и очищали согласно описанию (11). Комплексы СЧ—

HA62/284-М2е получали in vitro при инкубации белков HA62/284, M2e и СЧ в массовом соотношении 5:5:100 при 25 °С в течение 20 мин.

Образцы для электронной микроскопии готовили в соответствии с ранее описанным протоколом (22). Препараты изучали с помощью электронного микроскопа JEM-1011 («JEOL», Япония), оснащенного цифровой фотокамерой ES500W Erlangshen («Gatan», Япония). Микрофотографии анализировали в программе ImageJ (National Institutes of Health, США).

Антигенную специфичность комплекса СЧ—HA62/284-М2е исследовали методом иммунофлуоресцентной микроскопии (23). В качестве первичных антител использовали антисыворотку кролика, полученную к белку HA62/284, и мышиную антисыворотку к белку М2е вируса гриппа в разведении 1:100. В контрольных образцах стадия добавления первичных антител отсутствовала. Связывание первичных антител с комплексами детектировали при помощи вторичных ослиных антикроличьих антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor® 546 («Invitrogen», США), или вторичных куриных антимышиных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor® 488 («Invitrogen», США). Анализ проводили с применением флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M («Carl Zeiss», Германия) с интегрированной камерой ORCAII-ERG2 («Hamamatsu», Япония).

Иммуногенность комплексов СЧ—HA62/284-М2е изучали на самках лабораторных беспородных белых мышей в возрасте 6-8 нед массой 15-18 г, разделенных на 4 группы по 5 животных в каждой. Мышей внутрибрюшинно иммунизировали PBS (натрий-фосфатный буфер, phosphate-buffered saline; отрицательный контроль, I группа), свободными рекомбинантными белками HA62/284 и М2е (II группа), белками в смеси с адъювантом Фрейнда (III группа), комплексами СЧ—HA62/284-М2е (IV группа). Доза на одну инъекцию составляла 5 мкг HA62/284, 5 мкг М2е, 100 мкг СЧ; объем смеси, инъецируемой животному, — 0,2 мл. Всего провели 3 иммунизации с 2-недельным интервалом. Кровь для анализа брали через 1 нед после последней иммунизации.

Титр пула антисывороток определяли методом непрямого иммуно-ферментного анализа с помощью Multiscan FC («Thermo Scientific», США), как описано ранее (12). В качестве антигенов использовали белки HA62/284 и М2е в концентрации 10 мкг/мл. Титром антисыворотки считали разведение, в котором оптическая плотность продукта ферментативной реакции вдвое превышала соответствующее значение в отрицательном контроле (неиммунная мышиная сыворотка).

Результаты . Для создания кандидатной вакцины из очищенного препарата ВТМ посредством термической денатурации при 94 °С были получены частицы сферической формы. Для контроля их характеристик использовали просвечивающую электронную микроскопию (рис. 1). Размер полученных СЧ составил 612±41 нм.

А                       Б

Рис. 1. Электронные микрофотографии сферических частиц, полученных при термической денатурации вируса табачной мозаики. Просвечивающая электронная микроскопия (JEM-1011, «JEOL», Япония); контрастирование 2 % уранилацетатом. Увеличение ½10 000 (А) и ½200 000 (Б).

А

Б

В

В качестве антигенов вируса гриппа А выбрали участок молекулы гемагглютинина (62-284-й а.о.) штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), содержащий основные вируснейтрализу-ющие эпитопы, и консервативный N-терминальный внеклеточный домен мат-риксного белка М2 (пептид M2e длиной 23 а.о). Гемагглютинин — один из двух основных поверхностных белков вируса гриппа. Этот белок отвечает за связывание вириона с клеточными рецепторами и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. НА представляет собой главный поверхностный антиген вируса гриппа и служит основной мишенью для нейтрализующих антител. Исследования показали, что район молекулы с 62-го по 284-й а.о. содержит большинство нейтрализующих эпитопов, а также структурные элементы, необходимые для эффективного фолдинга рекомбинантного белка (24). Мембранный белок М2 формирует ионные каналы в липопротеидной оболочке вириона. Фрагмент этого белка длиной 22 а.о. (внеклеточный домен М2 — M2e) экспонируется на внешней поверхности вирусной частицы. Пептид M2e эволюционно консервативен и практически идентичен для всех вирусов гриппа, циркулировавших в популяциях животных, включая пандемические вирусы. В связи с этим он может рассматриваться как перспективный эпитоп для разработки универсальной вакцины против гриппа (25).

Рис. 2. Иммунофлуоресцентная микроскопия комплексов сферических частиц (СЧ) , полученных при термической денатурации вируса табачной мозаики, с белками HA62/284 и М2е вируса гриппа, одновременно адсорбированными на поверхности СЧ: А — белок M2е, выявленный с помощью первичных мышиных антител и вторичных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor^® 488; Б — белок HA62/284, выявленный в том же образце с помощью первичных кроличьих антител и вторичных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor^® 546; В — соответствующее изображение образца, полученное в режиме фазового контраста. Флуоресцентный микроскоп Axiovert 200M («Carl Zeiss», Германия).

В полученных in vitro комплексах СЧ—HA62/284-М2е, содержащих СЧ и рекомбинантные антигены HA62/284 и М2е вируса гриппа, белки на поверхности СЧ сохранили способность связываться со специфическими антителами к рекомбинантным белкам, что было подтверждено с помощью непрямой иммуннофлуоресцентной микроскопии с двумя различными флуорофорами. Флуоресценция на поверхности СЧ свидетельствовала о том, что оба антигена (HA62/284 и М2е) адсорбировались на одних и тех же сферических частицах и сохраняли антигенную активность в составе комплекса СЧ—HA62/284-М2е (рис. 2, А, Б). Срав нение полученных изображений в режиме флуоресценции (см. рис. 2, А, Б) и фазового контраста (см. рис. 2, В) показало, что все СЧ связаны с молекулами целевого белка, при этом агрегаты антигенных комплексов, не ассоциированные с СЧ, отсутствуют. Следовательно, в анализируемом препарате не были обнаружены СЧ, свободные от антигена. В отрицательном контроле, когда рекомбинантные белки или первичные антитела к ним не использовались, флуоресценцию не наблюдали (данные не приведены), что свидетельствовало об отсутствии неспецифического взаимодействия антивидовых антител, конъюгированных с флуорофором, с поверхностью СЧ. Таким образом, было показано, что адсорбция белков НА и М2е на поверхности СЧ не препятствует их связыванию со специфическими антителами к рекомбинантным белкам вируса гриппа А.

Оценивая способность комплексов СЧ с белками НА и М2e гриппа А птиц стимулировать специфический иммунный ответ, лабораторных мышей иммунизировали свободными белками HA62/284 и М2е или комплексом СЧ—HA62/284-М2е. В сыворотках крови мышей, иммунизированных комплексом СЧ—HA62/284-М2е, наблюдалось значительное увеличение титра антител к вирусным антигенам по сравнению с таковым при введении свободных антигенов (в отсутствие СЧ). Так, при использовании СЧ, на поверхности которых одновременно адсорбированы белки М2е и HA62/284, титр антител к белку М2е составил 2,0½105 (рис. 3, А), к белку HA62/284 — 2,4½105 (см. рис. 3, Б). В отсутствие СЧ в группах мышей, иммунизированных смесью HA62/284 и М2е, титр антисывороток был менее 4,0½104. Титры антисывороток, полученные при иммунизации мышей смесью белков HA62/284 и М2е с использованием адъюванта Фрейнда (одного из самых сильных стимуляторов иммунного ответа, применяемого только в лабораторной практике), составляли 3,0½105 и 3,6½105 (см. рис. 3, А, Б). Таким образом, адсорбция HA62/284 и М2е на поверхности СЧ значительно усиливала иммуногенность рекомбинантных белков при внутрибрюшинных инъекциях: она приводила почти к 10-кратному увеличению концентрации антител к белкам HA62/284 и М2е в сыворотке крови иммунизированных животных по сравнению с показателем при иммунизации свободными белками, что по эффективности сопоставимо с использованием адъюванта Фрейнда.

А

Б

Рис. 3. Адъювантные свойства сферических частиц (СЧ) , полученных при термической денатурации вируса табачной мозаики, в составе кандидатной вакцины — комплекса с антигенными детерминантами вируса гриппа А птиц HA62/284 и М2е (СЧ—HA62/284-М2е) (иммунофермент-ный анализ). На микропланшете иммобилизованы антигены М2е (А) и HA62/284 (Б) в концентрации 10 мкг/мл. Приведены кривые титрования антисывороток при иммунизации лабораторных мышей смесью свободных антигенов ( ♦ ), их смесью с добавлением адъюванта Фрейнда ( ■ ) и комплексом с СЧ ( ▲ ); контроль — неиммунная сыворотка (иммунизация раствором PBS (натрий-фосфатный буфер, phosphate-buffered saline) ( • ).

Важно отметить, что получение ветеринарных вакцин на основе структурно модифицированных вирусов растений (СЧ) позволяет создать отечественные маркерные ветеринарные вакцины: сферические частицы, на которые вырабатывается определенная часть антител при вакцинации комплексом СЧ—патоген (26), могут выступать и в роли маркера, что в дальнейшем позволит отличить вакцинированных птиц от носителей полевого вируса.

Итак, полученные комплексы СЧ—HA62/284-М2е могут быть основой для создания современной рекомбинантной вакцины против вируса гриппа птиц. Преимущество подобного подхода при создании вакцинных препаратов заключается в их высокой эффективности, основанной на стабильности и адъювантной активности сферических частиц, а также безопасности и низкой себестоимости использования вирусов растений. Включение в состав разработанного вакцинного препарата консервативного пептида М2е должно обеспечить защиту как от сезонных, так и от вероятных пандемических вирусов. Кроме того, это маркерная вакцина, позволяющая различать вакцинированных и невакцинированных особей, что важно для оздоровления промышленных популяций птицы.