Разработки южного научного центра ран в области криоконсервации репродуктивных клеток рыб

Работы выполнены в рамках реализации Гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых МК-159.2017.11 и ГЗ ЮНЦ РАН «Оценка современного состояния, анализ процессов формирования водных биоресурсов южных морей России в условиях антропогенного стресса и разработка научных основ технологии реставрации ихтиофауны, сохранения и восстановления хозяйственно ценных видов рыб»,

№ госрегистрации 01201354245» c использованием

Биоресурсной коллекции редких и исчезающих видов рыб ЮНЦ РАН № 73602.

Сохранение биоразнообразия естественных популяций рыб является неотъемлемой частью современной науки. В условиях катастрофического снижения численности большого количества ценных промысловых рыб в последние годы, а также в связи с нарушением видового и популяционного баланса, этот вопрос становится особенно актуальным.

В настоящее время гидрология ряда рек изменена настолько, что многие виды рыб не имеют возможности воспроизводства естественным путем [1].

Для сохранения и восполнения численности отдельных популяций рыб разработаны биотехнологии искусственного воспроизводства на различных рыбоводных предприятиях. В их основу положены принципы содержания и использования производителей из маточных стад, содержащихся на предприятии, что, в свою оче-

редь, ограничивает число особей, скрещивающихся между собой, и приводит впоследствии к инбридингу. Кроме того, в формировании маточных стад на рыбоводных заводах, особенно осетровых, отсутствуют какие-либо принципы и, зачастую, оно носит стихийный характер, что связано с нехваткой производителей.

Все это отражается на качестве (физиологическая, генетическая полноценность) молоди, выпускаемой с рыбоводных заводов [2-5]. Отмечено, что выпуск «заводской» молоди осетровых в водоемы увеличивает долю гетерозигот в популяции, а это приводит к сокращению численности и постепенной деградации потомства [6-9].

Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на рыбоводных заводах позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие ценных промысловых объектов [10].

В настоящее время имеются данные о сохранении живых органелл, клеток, тканей, органов и целых организмов при сверхнизких температурах в течение длительного периода времени. Криоконсервацию широко используют для хранения спермы и эмбрионов млекопитающих, но исследований по криосохранению клеток морских гидробионтов немного.

Полученные результаты по дефростирован-ной сперме, а также по оплодотворяемости ею икры различных видов рыб нестабильны и варьируют в широких пределах (10-90 %). Тем не менее, для сохранения редких и исчезающих видов существующие методы криоконсервации их спермы пригодны для замораживания биоматериала, хранения в коллекционных банках и восстановления гидробионтов.

Однако проблема создания криотехнологий для больших объемов спермы, необходимых для формирования производственных криобанков, внедрения криотехнологий в производство решается очень медленно. Можно повысить эффективность существующей системы селекционно-племенных хозяйств и рыбоводных заводов, если использовать криотехнологии в процессе воспроизводства промысловых и заводских популяций.

Вопросами сохранения редких и исчезающих видов рыб методами низкотемпературного консервирования занимаются ученые Южного научного центра Российской академии наук (ЮНЦ РАН) с 2004 г. Разработки и достижения подтверждены патентами, ноу-хау, публикациями в ведущих российских и зарубежных изданиях [10-29].

До настоящего времени нет универсальной методики криоконсервации репродуктивных клеток рыб, что связано с их видоспецифич-ностью, обусловленной различным строением спермиев и яйцеклеток у разных видов рыб.

Способы криоконсервации различаются обычно: по составу основного криозащитного раствора и наличию дополнительных компонентов (сахара, белки, яичный желток, липиды); по скоростям охлаждения; используемому криопротектору; объему замораживаемого материала [30, 31].

Считается, что существенную роль в криоповреждении могут играть кристаллы льда, формирующиеся при замерзании криозащит-ных растворов.

Образование кристаллов льда наряду с другими негативными факторами (осмотический шок, латеральная диффузия липидов и белков, рекристаллизация при оттаивании, токсичность растворов криопротекторов) значительно снижает выживаемость клеток после процедуры замораживания-оттаивания при криоконсервации живых клеток и, в частности, сперматозоидов [32].

При поиске эффективных криозащитных составов надо учитывать не только размер и периметр кристаллов льда, образующихся при замерзании криозащитного раствора, но и форму кристаллов. Наиболее эффективны криозащит-ные растворы, при замерзании которых образуются кристаллы округлой формы, или наблюдается картина, близкая к стеклованию [33].

Сотрудниками ЮНЦ РАН разработаны оптимальные составы криосред для осетровых, карповых, белорыбицы [16, 17, 20, 22], обеспечивающие высокий уровень выживаемости дефро-стированных сперматозоидов (60-85 %) [34].

При охлаждении клеток важно избежать образования внутриклеточного льда или минимизировать процесс. При быстром замораживании (выше 100 °C/мин) внутриклеточная вода не успевает выйти из клеток, переохлаждается, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клеток [35]. При медленном замораживании (менее 0,1 °C/мин) клетки теряют много воды, а это ведет к сжатию и лизису клеток. Поэтому для успешной криоконсервации необходим баланс между двумя негативными факторами: образованием внутриклеточного льда и осмотическими эффектами [36].

По результатам работ сотрудников ЮНЦ РАН определены оптимальные скорости замораживания для разных видов рыб. Так установлено, что для русского осетра оптимальная скорость замораживания 3 °C/мин [17], для белорыбицы – сверхскоростное замораживание на тефлоновой пластине [20], для карповых – ступенчатый режим замораживания (6 ºС/мин в течение 6 минут, 10 ºС/мин, в течение 4 минут, затем погружение в жидкий азот) [14, 37, 38, 39].

Для улучшения проникновения криораствора в клетки научные сотрудники ЮНЦ РАН разработали методику электростимуляции спермы рыб перед эквилибрацией. Так, установлено, что при воздействии прямоугольного низкочастотного сигнала на семенную жидкость, увеличивается процент живых клеток после дефростации [10, 15, 17-19].

Однако все криопротекторы оказывают токсическое воздействие на сперму рыб при длительном контакте [34, 40-43]. После размораживания часто отмечаются живые сперматозоиды, которым не хватает энергии для активации движения. Также установлено, что дефростирован-ные спермии начинают двигаться не сразу после активации водой, а спустя некоторое время [44]. Для снижения негативного влияния криопротекторов создан метод выведения токсических веществ из репродуктивных клеток [10, 17, 21].

На основе проведенных исследований сотрудниками ЮНЦ РАН усовершенствована технология криоконсервации спермы рыб (Рис. 1) [10, 17].

Из рисунка 1 видно, что качество дефрости-рованной спермы, замороженной по усовершенствованной схеме, значительно выше, чем по традиционной схеме. Сперму такого высокого качества целесообразно использовать для оплодотворения икры, а также для формирования криобанка.

Применение электростимуляции и выведения криопротектора из половых клеток после

Разбавление спермы криозащитной средой

Разбавление спермы криозащитной средой

Эквилибрация

Эл ектро стимуляция

Замораживание

Эквилибрация

Дефростирование

Замораживание

Выживаемость

50 – 60 %

Дефростирование

Выведение протектора раствором NaCl

+

Эл ектростимуляция

Выживаемость

80 – 90 %

Рис. 1. Качество спермы рыб в процессе криоконсервации с использованием усовершенствованной схемы дефростации увеличивает репродуктивные качества спермы рыб. Каждое из новых звеньев процесса криоконсервации способствует улучшению качества спермы, однако применение их в совокупности дает наилучший эффект (Рис. 2).

Однако активность и время жизни сперматозоидов являются субъективными показателями качества. Наиболее убедительными тестами успешности криоконсервации служат оплодотворение размороженными сперматозоидами и последующий анализ полученных эмбрионов.

Сначала проводят оплодотворение икры в лабораторных условиях в небольших количествах, а затем в производственных условиях на крупных партиях икры.

В лабораторных условиях получены стабильно высокие показатели оплодотворения икры дефростированной спермой осетровых рыб – 80-90 %. Показатели оплодотворения икры тех же партий нативной спермой в условиях рыбоводного завода составили 70-75 %.

Это объясняется тем, что для каждой партии спермы свойственна гетерогенность структуры. Наиболее активные спермии, способные к высокому проценту оплодотворения составляют, как правило, 25%; 60% партии – сперма среднего качества, спермии которой способны к оплодотворению, и третья составляющая 15% – нежизнеспособная сперма [45].

В процессе низкотемпературного консервирования в первую очередь гибели подвержены слабые спермии, после дефростации живыми остаются более сильные, способные к высокому уровню оплодотворения спермии. Таким образом, криоконсервация может служить способом получения элитных сперматозоидов, дающих мощное, физиологически полноценное потомство.

Это подтверждается исследованиями по оплодотворению икры в условиях рыбоводных заводов, проведенными с использованием деф-ростированной спермы русского осетра и белорыбицы [10, 20]. Отмечено, что полученное потомство по морфометрическим и физиологическим показателям не уступает нативному, а зачастую и превосходит его [10, 26, 28].

На основе усовершенствованной методики низкотемпературного консервирования половых клеток рыб начато формирование криобанка-репродуктора, основной целью которого является сохранение генетического разнообразия рыб и обеспечение рыбоводных предприятий репродуктивными клетками в необходимом количестве.

Криобанк ежегодно пополняется образцами спермы различных видов рыб. В настоящее время на долгосрочное хранение заложено более 12 л спермы ценных видов рыб (русский осетр, белуга, севрюга, стерлядь, веслонос, шип, белорыбица).

A

Б

Рис. 2. Изменение качества дефростированной спермы при использовании разных способов криоконсервации: А – активность дефростированной спермы, с; Б – время жизни спермиев, с;

ОП – применение оптимальных протекторов, ЭС – электростимуляция, ВП – выведение протектора из клеток

Ведется систематическая проверка качества спермы, хранящейся в криобанке. Установлено, что за это время сперма не утрачивает оплодотворяющей способности (Табл. 1).

Полученные данные сопоставимы с теоретическими расчетами времени хранения спермы, при котором не изменяется качество спермы. По мнению некоторых авторов [32] хранить образцы спермы можно сотни лет без утраты их функций.

Также сотрудники ЮНЦ РАН проводят исследования по замораживанию яйцеклеток рыб. Получены стабильные результаты по сохранению целостности оболочек икры после дефростации, а также проведены работы по оплодотворению дефростированной икры спермой [46, 47].

Сохранение репродуктивных клеток в криобанке позволяет получать необходимое количество дефростированных половых продуктов рыб в любое удобное время вне зависимости от внешних факторов. Получение свежей (нативной) спермы и икры может растягиваться на неопределенное время из-за долгого созревания производителей, также есть риск, что сперма или икра будет низкого качества или не будет получена вовсе. Криоконсервированную сперму

Таблица 1. Качество спермы стерляди после долгосрочного хранения в жидком азоте

Срок хранения, год	Активность дефростированной спермы, %	Процент оплодотворения
1	92±2,3	67±3,3
2	90±2,0	69±2,7
3	90±1,9	70±2,8
4	90±1,8	67±1,9
5	90±2,4	69±2,2
6	90±2,1	70±1,7

можно хранить десятилетиями в жидком азоте без изменения репродуктивных показателей, в то время как нативная сохраняет свои качества в течение 3-4 суток. Ежегодное пополнение и обновление коллекции образцов репродуктивных клеток позволяет расширить генофонд воспроизводимых видов рыб; дает возможность выбора половых клеток с высокими репродуктивными качествами для проведения селекционных работ и товарного выращивания рыб.