Разрушение биопленок коагулазонегативных стафилококков катионным пептидом варнерином

В лунки планшета вносили по 100 мкл исследуемого стерильного препарата низкомолекулярного пептида варнерина и готовили ряд последовательных двукратных разведений, после чего в каждую лунку добавляли по 10 мкл суспензии клеток S.epidermidis 33, содержащей в 1 мл 1.5-2.0х10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Планшеты инкубировали в течение 16-18 ч при 37^оС. МПК варнерина определяли путем сравнения со значением МПК референс-образца с известным количеством пептида.

Для исследования влияния пептида варнерина на формирование биопленок в планшеты для ИФА вносили одновременно суспензию клеток индикаторной культуры (107 КОЕ/мл) и варнерин в концентрациях от 0.25 до 256 мкг/мл. После инкубирования при 37оС в течение 24 ч планктонные клетки из лунок удаляли осторожным пипетированием, планшеты трижды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.2) и окрашивали тетразолием MTS [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметокси-фенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий, внутренняя соль] для определения количества живых клеток с использованием системы Cell Proliferation Assay (Promega, США) в соответствии с инструкцией фирмы. Детекцию интенсивности окраски проводили на микропланшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при длине волны 490 нм.

Общую биомассу сформировавшихся биопленок определяли окрашиванием 0.1% раствором генци-анвиолета в течение 20 мин, после однократной отмывки не связавшегося красителя 10 мМ фосфатным буфером планшеты высушивали. Экстракцию связавшегося с биопленками красителя проводили этанолом. Количественную оценку этанольных экстрактов осуществляли на микропланшет-ном спектрофотометре при длине волны 570 нм.

Для получения больших количеств биопленок применяли полистироловые вентилируемые чашки Петри (Meus, Piove di Sacco, Италия). Использовали среду LB, содержащую 10⁷ КОЕ/мл бактерий S.epidermidis 33 с логарифмической фазы роста в качестве инокулума. Чашки выдерживали в термостате при 37^оС в течение 24 ч.

Для изучения действия низкомолекулярного катионного пептида варнерина на сформированные в течение 24 ч биопленки в контрольные чашки вносили 10 мМ Трис-HCl (рН 7.2), в опытные – препарат варнерина в указанном выше буфере и инкубировали в течение 4 ч и 24 ч. После окончания инкубации среду удаляли и весь объем ее подвергали центрифугированию при 3000g в течение 15 мин. Супернатант использовали для анализа спектра аутолизинов в ренатурируемом ПААГе [17].

Оставшиеся после инкубации с варнерином и буфером (контроль) биопленки для оценки их биомассы окрашивали генцианвиолетом, а для определения количества живых клеток использовали Cell Proliferation Assay, как указано выше.

Для сравнения действия низкомолекулярного пептида варнерина на биопленки и клетки планктонной культуры S.epidermidis 33 последние выращивали на среде LB при 37^оС на шейкере Сertomat (Sartorius, Германия) до середины логарифмической фазы роста. Бактерии осаждали (10000 g, 10 мин) на центрифуге 3K30 (“Sigma”, Германия), дважды отмывали в том же режиме 0.01 М Трис - HCl буфером (рН 7.2) и ресуспендировали в буфере до плотности OD 600 = 0.5, используя для измерений кюветы с длиной оптического пути 1 см. Для активации неспецифических аутолитических процессов к препаратам бактерий добавляли низкомолекулярный пептид варнерин. Инкубацию проб проводили на шейкере Sertomat (“Sartorius”, Германия) при 150 об/мин и 37°С в течение 4 ч с измерением оптической плотности ежечасно на спектрофотометре PD-303 (APEL, Япония) при 600 нм. Для получения растворимой части бактериальных препаратов аликвоты сред культивирования центрифугировали, как указано выше.

Полученные супернатанты опытных и контрольных проб планктонных клеток и биопленок концентрировали на центрифужном концентраторе (Eppendorf, США) в 20 раз для биопленок и в 5 раз для планктонной культуры. В концентратах определяли содержание белка [4] и анализировали содержание в них бактериолитических компонентов, используя ренатурируемый электрофорез в 9% ПААГе, содержащем убитые автоклавированием (0.5 атм, 30 мин) и отмытые дистиллированной водой бактерии S.epidermidis 33 (1.6 мг сухого ве-са/мл геля).

После окончания процедуры разделения гели отмывали дистиллированной водой в течение 30 мин, помещали в ренатурирующий буфер (50 мМ MES-NaOH, pH 6.0 и тритон Х-100 0.1%) и инкубировали в течение 16 ч при 37°С. После ренатура-ции гели промывали водой, окрашивали 0.1% метиленовым синим в 0.01% КОН в течение 1 ч и отмывали от красителя водой до проявления прозрачных зон лизиса импрегнированных в гель бактериальных клеток на синем фоне связавших краситель не лизированных бактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В предварительных экспериментах было проведено сравнение антибактериального действия низкомолекулярного катионного пептида варнерина на клетки планктонной культуры S.epidermidis 33 и образованную ими в течение 24 ч биопленку.

Как видно из рис. 1, варнерин в концентрации 4 мкг/мл проявляет выраженное бактериолитическое действие в отношении планктонных клеток индикаторной культуры уже через 2 ч и лишь через 24 ч снижает количество биомассы и живых клеток в биопленках при одновременном внесении пептида и инокулума на 38 и 36.5% соответственно (рис. 2А,Б).

Рис. 1. Лизис планктонной культуры S.epidermidis 33 низкомолекулярным пептидом варнерином (4 мкг/мл).

Действия низкомолекулярного пептида варне-рина при концентрации 4 мкг/мл на сформированную в течение 24 ч биопленку не обнаружено. Однако при увеличении концентрации пептида от 16 до 128 мкг/мл отмечается снижение уровня биомассы и количества живых клеток в образованных в течение суток биопленках (рис. 3).

Полученные нами результаты согласуются с многочисленными литературными данными о значительной резистентности клеток в биопленках к антибактериальным агентам по сравнению с планктонными формами аналогичных бактерий.[5, 7, 1113, 15].

В дальнейших экспериментах на биопленках низкомолекулярный пептид варнерин использовался в концентрации 128 мкг/мл.

При сравнении лизирующего действия пептида на планктонные клетки и биопленку отмечено, что через 4 ч контакта с варнерином (4 мкг/мл) количество жизнеспособных клеток в планктонной культуре падает практически до нуля (рис. 4А), тогда как в биопленке в три раза. Причем, число живых клеток в биопленке остается достаточно высоким даже при 24 ч воздействии варнерина (рис. 5Б).

Сравнение энзимограмм после воздействия вар-нерина на планктонные клетки и биопленки (рис. 4Б и рис. 5В) позволяет обнаружить значительные различия.

Рис. 2. Действие варнерина на накопление биомассы (А) и жизнеспособность клеточных компонентов (Б) при формировании биопленок S.epidermidis 33 (1 - контроль, 2 - варнерин).

Рис. 3. Действие варнерина на сформированную пленку S.epidermidis 33. А - накопление биомассы, Б - жизнеспособность клеточных компонентов (1 - контроль, 2 - варнерин).

108 КОЕ/мл

Рис. 4. Действие низкомолекулярного пептида варнерина (4 мкг/мл) на планктонную культуру S. epidermidis 33. А -КОЕ/мл, Б - энзимограмма аутолитических ферментов после 4 ч действия пептида варнерина

Важно отметить, что сам варнерин не обладает какой-либо ферментативной активностью, и это позволяет предположить опосредованность его действия за счет проявления им детергентных свойств и активации аутолитических систем бактериальных клеток [2].

Действительно, как показал энзимографический анализ, супернатанты препаратов планктонных клеток и биопленок S.epidermidis 33, обработанных варнерином, характеризуются гетерогенными спектрами аутолизинов, в составе которых обнаружи- ваются общие группы расщепляющих бактериальные стенки ферментов.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что низкомолекулярный катионный пептид варнерин обладает выраженным активирующим действием на аутолитические системы как планктонных клеток, так и биопленок бактерий S.epidermidis 33. Это является подтверждением перспектив использования пептида для разработки новых антибактериальных препаратов против стафилококковых инфекций, в том числе, обусловленных образованием биопленок.

Рис. 5. Действие низкомолекулярного пептида варнерина (128 мкг/мл) на биопленки S.epidermidis 33, сформировавшиеся в течение 24 ч: А – биомасса, Б – жизнеспособные клетки, В – выход аутолизинов (1 – 10 мМ Трис-НС1, 2 – варнерин).