Реакции дыхания на активацию ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов парафациальной респираторной группы специфическими агонистами

Введение. В последние годы главным объектом при изучении центральных механизмов регуляции дыхания является ростральная вентролатеральная медуллярная область, в частности парафациальная респираторная группа (пФРГ), нейроны которой обеспечивают различные аспекты деятельности дыхательного центра [1–3]. В пределах пФРГ локализованы преинспираторные ней- роны [4], участвующие в центральной хеморецепции [5] и совместно с нейронами комплекса пре-Бетцингера генерирующие инспираторную активность [6]. Также в пФРГ имеются экспираторные нейроны Е2-типа, обеспечивающие активную экспирацию [7]. Активность дыхательных нейронов пФРГ контролируется тормозными и возбуждающими нейромедиаторами, например ацетил- холином [8], ГАМК [9, 10], глутаматом [11], глицином [12] и нейромодуляторами, такими как гастрин-рилизинг пептид и нейромедин В [13]. Среди перечисленных регуляторов наибольший интерес вызывают тормозные нейроактивные аминокислоты, особенно ГАМК, которая имеется во всех отделах дыхательного центра и принимает участие в формировании ритма и паттерна дыхания. В исследованиях на взрослых животных показано, что на уровне пФРГ влияние ГАМК на дыхание реализуется с участием ГАМКА-рецепторов [9, 12]. Что касается ГАМКВ-рецепторов, то вопрос об их участии в формировании респираторной активности ранее не изучался.

Цель исследования. Сравнительный анализ роли ГАМК А - и ГАМК В -рецепторов парафациальной респираторной группы в центральных механизмах регуляции дыхания у взрослых крыс.

Материалы и методы. Поставлены две серии острых экспериментов на половозрелых беспородных крысах массой 250–300 г, наркотизированных уретаном (1,5 г/кг, внутрибрюшинно) в строгом соответствии с этическими правилами использования лабораторных животных в научно-исследовательских целях. В ходе операции проводили трахеостомию, обнажали крышу черепа и открывали подход к диафрагмальной мышце через разрез на левом боку животного. Затем крыс переносили в стереотаксический прибор СЭЖ-3, фиксировали голову и высверливали трепанационное отверстие в окципитальной кости для доступа к пФРГ. В первой серии опытов (n=8) осуществляли микроинъекции в пФРГ раствора специфического агониста ГАМК_А-рецепторов мусцимола, во второй (n=9) – специфического агониста ГАМК B -рецепторов баклофена (Sigma Aldrich). Растворы с концентрацией 10^-6 М готовили разведением в искусственной спинномозговой жидкости ex tempore и вводили в пФРГ уни-латерально в объеме 200 нл через стеклянную канюлю с диаметром кончика 20–25 мкм при помощи микрошприца МШ-1. Стереотаксические координаты пФРГ: 11,3 мм каудаль-нее bregma ; 2,3 мм латеральнее срединного шва; 9,4 мм вглубь от дорсальной поверхности мозжечка [9].

Регистрировали внешнее дыхание с помощью электронного спирографа, подсоединенного к трахеотомической трубке, и электромиограмму (ЭМГ) диафрагмальной мышцы, которую отводили стальными биполярными электродами, соединенными с усилителем электромиографа. Выходные сигналы от спирографа и электромиографа подавались на аналогово-цифровой преобразователь, затем на компьютер и записывались в программе PowerGraph 3.2 Professoinal (ООО «Интероптика-С»). Запись велась непрерывно в исходном состоянии и в течение 60 мин после микроинъекции. По спиро-граммам оценивали минутный объем дыхания (МОД, мл-1), дыхательный объем (ДО, мл), длительность вдоха (Ti, с), объемную скорость инспираторного потока (Vi, мл/c), длительность выдоха (Te, с), частоту дыхания (ЧД, мин-1). На ЭМГ диафрагмы определяли длительность инспираторных залпов (ДЗ, с), межзалповые интервалы (МЗИ, с), амплитуду осцилляций (отн. ед.).

Результаты экспериментов обрабатывали в программе SigmaPlot 12.5 (Systat Software Inc.). Использовали Normality Test Shapiro– Wilk и Paired t-test, статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Основным эффектом микроинъекций в пФРГ крыс раствора селективного агониста ГАМКА-ре-цепторов мусцимола было угнетение легочной вентиляции, на что указывало снижение МОД в течение всего срока наблюдений (табл. 1). Следует отметить, что вклад частотных и объемных параметров спирограммы в данную реакцию был неоднозначным. Характерно, что на 1-10-й мин активации ГАМКА-рецепторов снижение МОД имело наибольшую выраженность (26,0 % от исходного уровня; p<0,01) и было обусловлено существенным уменьшением ДО (на 23,5 %; p<0,01). Однако эффект уменьшения ДО отличался кратковременностью, и в последующие сроки экспозиции изменения МОД начинали определяться преимущественным вкладом ЧД. Так, на 40-й мин действия ГАМКА-агониста МОД уменьшался по сравнению с исходным уровнем на 17,9 % (p<0,05), что было связано с ростом общей продолжительности дыхательного цикла и снижением ЧД на 9,5 % (p<0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что на фоне активации ГАМКА-рецепторов в области пФРГ динамика ЧД определялась изменением длительности не только экспираторной, но и инспираторной фазы. На 1-й мин после микро- инъекции мусцимола ЧД незначительно увеличивалась, что обеспечивалось укорочением Ti на 14,9 % (p<0,01), в более поздние сроки действия мусцимола ЧД закономерно уменьшалась за счет пролонгации как Te, так и Ti на 10,2 (p<0,05) и 12,3 % (p<0,01) соответственно.

Таблица 1

Изменение параметров паттерна внешнего дыхания и ЭМГ диафрагмы у крыс после микроинъекций мусцимола (10-6 М) в пФРГ

Параметр	Исх.	1-я мин	5-я мин	10-я мин	20-я мин	30-я мин	40-я мин	50-я мин	60-я мин
Ti, c	0,33±	0,27±	0,34±	0,35±	0,35±	0,35±	0,37±	0,35±	0,35±
	0,02	0,02**	0,02**	0,02*	0,02	0,01	0,01**	0,01	0,01
Te, с	0,51±	0,51±	0,50±	0,48±	0,51±	0,50±	0,54±	0,56±	0,57±
	0,04	0,04	0,04*	0,04	0,04	0,05	0,03*	0,04*	0,05
Vi, мл/с	1,90±	2,02±	1,34±	1,28±	1,49±	1,40±	1,53±	1,75±	1,74±
	0,14	0,21	0,12*	0,13**	0,21*	0,17*	0,11	0,13	0,16
ЧД, мин-1	74,01±	77,81±	73,13±	74,35±	71,50±	72,54±	66,97±	67,27±	66,10±
	5,20	4,63*	3,74	4,65	4,61	5,49	3,31*	3,42*	3,83*
ДО, мл	0,61±	0,54±	0,45±	0,44±	0,51±	0,48±	0,55±	0,60±	0,61±
	0,05	0,04*	0,04*	0,04**	0,06	0,05	0,04	0,04	0,04
МОД, мл-1	44,85±	41,93±	32,63±	32,07±	36,80±	35,09±	37,29±	40,46±	40,34±
	3,92	3,38	2,14*	2,84**	5,99*	5,00	3,41*	3,34	4,39
МЗИ, с	0,51±	0,51±	0,49±	0,48±	0,51±0,04	0,50±	0,54±	0,56±	0,57±
	0,04	0,04	0,04	0,04*		0,05	0,03	0,04*	0,05*
ДЗ, с	0,35± 0,03	0,28± 0,02**	0,37± 0,03	0,37± 0,02	0,37± 0,03	0,38± 0,03	0,41± 0,03*	0,39± 0,03	0,38± 0,03
Амплитуда осцилляций,	0,21± 0,02	0,21± 0,02	0,19± 0,02	0,19± 0,02*	0,19± 0,02	0,18± 0,02*	0,18± 0,02	0,19± 0,02	0,18± 0,02
отн. ед.

Примечание. * – p<0,05; ** – p<0,01 (достоверные различия с исходным уровнем).

Важным показателем, подтверждающим вклад ГАМКергических структур пФРГ в деятельность инспираторных механизмов дыхательного центра, является изменение объемной скорости инспираторного потока (Vi). Достаточно быстро, уже на 5-й мин после микроинъекции мусцимола, Vi уменьшалась на 29,3 % (p<0,05) от исходного уровня, и данная тенденция сохранялась до 40-й мин наблюдений (табл. 1, рис. 1а).

Реакциям внешнего дыхания соответствовали изменения ЭМГ диафрагмы (табл. 1, рис. 1б). На первых минутах после микроинъекции мусцимола на ЭМГ отмечалось уменьшение длительности инспираторных залпов и амплитуды их осцилляций в сочетании с укорочением межзалповых интервалов. По мере действия мусцимола частота залпов диафрагмальной активности уменьшалась, а сами залпы и интервалы между ними увеличивались, что является электрофизиологическим коррелятом ослабления ритмики дыхания на фоне активации ГАМКА-рецепторов пФРГ.

i, мл/с

Рис. 1. Респираторные реакции на микроинъекции раствора мусцимола (10^-6 М) в пФРГ: а – объемная скорость инспираторного потока; б – суммарная ЭМГ диафрагмы.

Достоверные различия с исходным уровнем при: * – р<0,05; ** – р<0,01

Микроинъекции раствора специфического агониста ГАМК В -рецепторов баклофена в пФРГ крыс также оказывали выраженное угнетающее влияние на легочную вентиляцию (табл. 2). Изменения отдельных параметров паттерна внешнего дыхания, отмеченные в экспериментах с баклофеном, совпадали по направленности с эффектами мусцимола, однако имели место некоторые различия. Во-первых, латентные периоды респираторных эффектов баклофена были более продолжительными, при этом максимальные изменения спирограммы, как и ЭМГ диафрагмы, наблюдались после 30-й мин экспозиции. Одним из объяснений такой растянутой во времени динамики реакций может быть механизм активации метаботропных ГАМК_В-ре-цепторов, включающий в себя сложный каскад обменных процессов и путей передачи сигнала в постсинаптических структурах [15].

Во-вторых, изменения МОД после микроинъекции баклофена в пФРГ, в отличие от мусцимола, в течение всего времени наблюдений определялись отклонением амплитудных параметров спирограммы, а именно ДО, уровень которого закономерно уменьшался (рис. 2а). Так, в конце экспозиции баклофена МОД у крыс снижался на 28,6 % (p<0,01) от исходного уровня (49,12±2,68 мл-1) и составлял 35,08±4,87 мл-1. В это же время достигалось минимальное значение ДО (0,49±0,07 мл), что соответствовало его уменьшению на 24,0 %

(p<0,05) от исходного уровня (0,65±0,05 мл). С этим коррелировало снижение амплитуды осцилляций диафрагмальной активности в среднем на 21,6 % (p<0,05), что хорошо видно на интегрированной ЭМГ (рис. 2б). Что касается временных параметров спирограм-мы, то при активации ГАМК В -рецепторов пФРГ значимо изменялась только величина Ti, которая наиболее выраженно (на 16,8 %; p<0,001) увеличивалась с 30-й по 60-ю мин регистрации. На ЭМГ диафрагмы в эти сроки наблюдалась пролонгация инспираторных залпов на 17,3 % (p<0,05), что совпадало с динамикой Ti. Значения ЧД и Te при воздействии баклофена на пФРГ достоверно не менялись (табл. 2). Величина Vi при этом закономерно уменьшалась в течение всего эксперимента с наибольшим эффектом во второй половине экспозиции. Минимальное значение Vi (1,43±0,24 мл/c; p<0,01) отмечалось на 60-й мин и было на 33,7 % ниже исходного уровня (рис. 2в).

Полученные экспериментальные данные в целом согласуются с современными представлениями о важной роли ГАМКергиче-ских механизмов парафациального региона в регуляции ритма и паттерна дыхания [9, 10]. В настоящей работе выявлено, что в регуляции дыхания нейронами пФРГ участвуют два класса ГАМК-рецепторов – ГАМК А и ГАМК В , которые вносят неоднозначный вклад в формирование респираторных реакций.

Таблица 2

Изменение параметров паттерна внешнего дыхания и ЭМГ диафрагмы у крыс после микроинъекций баклофена (10-6 М) в пФРГ

Параметр	Исх.	1-я мин	5-я мин	10-я мин	20-я мин	30-я мин	40-я мин	50-я мин	60-я мин
Ti, c	0,31±	0,31±	0,31±	0,34±	0,33±	0,36±	0,35±	0,36±	0,36±
	0,01	0,02	0,01	0,01*	0,01*	0,01*	0,01**	0,01***	0,02**
Te, с	0,49±	0,49±	0,44±	0,47±	0,46±	0,48±	0,50±	0,49±	0,50±
	0,05	0,06	0,06	0,06	0,05	0,07	0,05	0,06	0,05
Vi, мл/с	2,15±	1,94±	1,78±	1,77±	1,74±	1,55±	1,56±	1,43±0,	1,43±0,
	0,22	0,19	0,15*	0,19*	0,22**	0,17*	0,18**	19**	23**
ЧД, мин-1	76,19± 4,33	76,94± 5,49	81,64± 6,51	75,91± 4,68	77,47± 5,14	73,60± 4,87	71,88± 3,74	72,37± 4,38	71,21± 4,28
ДО, мл	0,65± 0,05	0,59± 0,04	0,56± 0,04**	0,59± 0,05*	0,56± 0,06*	0,55± 0,05*	0,54± 0,05*	0,51± 0,06*	0,50± 0,07*
МОД, мл-1	49,12±	45,50±	45,35±	44,89±	43,32±	40,24±	38,54±	36,40±	35,08±
	2,68	3,36*	3,95	4,35	4,16**	4,21*	3,65**	3,91**	4,87**
МЗИ, с	0,31±	0,48±	0,45±	0,47±	0,46±	0,48±	0,49±	0,49±	0,50±
	0,05	0,06	0,06	0,06	0,05	0,07	0,05	0,06	0,05
ДЗ, с	0,49± 0,01	0,32± 0,02	0,32± 0,01	0,34± 0,01**	0,33± 0,01*	0,36± 0,01*	0,35± 0,01**	0,36± 0,01***	0,36± 0,01**
Амплитуда	0,29±	0,27±	0,27±	0,26±	0,25±	0,23±	0,23±	0,23±	0,23±
осцилляций, отн. ед.	0,03	0,03	0,03	0,03*	0,02*	0,02*	0,02*	0,02**	0,02*

Примечание. * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001 (достоверные различия с исходным уровнем).

Рис. 2. Респираторные реакции на микроинъекции раствора баклофена (10^-6 М) в пФРГ: а – спирограммы; б – интегрированные ЭМГ диафрагмы; в – объемная скорость инспираторного потока. Достоверные различия с исходным уровнем при: * – р<0,05; ** – р<0,01

Во-первых, эффекты активации этих рецепторов различаются по влиянию на дыхательный цикл. При действии агониста ГАМК А -рецепторов мусцимола наблюдалась пролонгация обеих фаз дыхания, тогда как при активации ГАМК В -рецепторов баклофеном удлинялся только вдох. Изменение вдоха в обоих случаях можно объяснить ГАМКер-гическим торможением преинспираторных нейронов пФРГ, которые совместно с аналогичными клетками комплекса пре-Бетцингера составляют основной респираторный ритмо-генератор [2]. Характерное для микроинъекций мусцимола увеличение фазы выдоха, вероятно, обусловлено торможением Е2 экспираторных нейронов, наличие которых в пФРГ описано в ряде работ [7, 11].

Во-вторых, различия в действии агонистов ГАМК А - и ГАМК В -рецепторов касаются скорости формирования респираторных реакций, которая при микроинъекциях мусцимола была больше. Скорее всего это связано с тем, что ГАМК А -рецепторы являются ионотропными и составляют единый комплекс с ионофором, поэтому вызываемое лигандом изменение конформации рецептора ведет к быстрому открыванию каналов для ионов Cl^- и моментальной гиперполяризации постсинаптической мембраны [15]. Метаботропные ГАМК B -ре-цепторы имеют иную кинетику мембранных процессов. Их активация ведет к развивающемуся с задержкой слабому, но длительному торможению, тормозной постсинаптический потенциал в этом случае длится несколько сотен миллисекунд [16]. Этот механизм объясняет более позднее развитие ответов системы дыхания на введение в пФРГ баклофена.

При наличии различий в изменениях временных показателей дыхания, микроинъекции ГАМКА- и ГАМКВ-агонистов оказывали сходное влияние на амплитудные параметры спирограммы и ЭМГ диафрагмы. При активации обоих классов ГАМК-рецепторов происходило уменьшение дыхательного объема и амплитуды осцилляций в залпах диафрагмальной активности. Оценивая эти изменения, необходимо напомнить, что во многих публикациях отмечается особая роль пФРГ в регуляции экспираторной фазы дыхательного цикла, в частности в формировании активной экспирации [1, 3]. Что касается участия парафациального региона в регуляции инспирации, то обычно его объясняют активацией хеморецепторов ретротрапециевидно-го ядра [4], нейроны которого переслаиваются с нейронами пФРГ [12]. Наши данные об изменении дыхательного объема и продолжительности вдоха при микроинъекциях агонистов ГАМК в пФРГ свидетельствуют об участии этой области мозгового ствола посредством ГАМКА- и ГАМКВ-рецепторов в модуляции активности механизмов, обеспечивающих процессы формирования не только экспираторного, но и инспираторного моторного выхода. Морфологической основой этих процессов могут быть связи пФРГ с комплексом пре-Бетцингера [17], являющимся основным генератором инспираторного ритма, а также с комплексом Бетцингера [11, 18] и каудальной вентральной респираторной группой [5], которые содержат проприобульбарные и бульбоспинальные экспираторные нейроны.

Заключение. Таким образом, участие пФРГ в регуляции дыхания опосредуется ионотропными ГАМК_А- и метаботропными ГАМК_В-рецепторами, которые включены в процессы торможения нейронных структур, контролирующих как временные, так и объемные характеристики паттерна дыхания. При этом ГАМК А -рецепторы в области пФРГ вносят вклад в регуляцию экспирации и инспирации, тогда как ГАМК_В-рецепторы преимущественно участвуют в модуляции инспираторной активности дыхательного центра.