Реакции нормальных и опухолевых клеток и тканей на гипертермию в сочетании с ионизирующей радиацией. Обзор

Радиочувствительность опухоли зависит от множества факторов: гистологического типа, скорости репопуляции клеток, количества гипоксических клеток, их микроокружения, а также взаимоотношения паренхимы и стромы. Ведущим является число гипоксических и непролиферирующих клеток. При падении рО 2 ниже 15-20 мм рт. ст. опухоль становится более радиорези-стентной. Причина хронической гипоксии вызвана быстрым неконтролируемым делением её клеток и медленным развитием капилляров в этих участках. По мере отдаления опухолевых клеток от капилляра концентрация кислорода падает и на расстоянии 150 мкм (10-15 рядов клеток) сводится к нулю, что приводит к возникновению гипоксических и аноксических зон, вплоть до развития некроза [1]. В этой связи для повышения эффективности лучевой терапии (ЛТ) опухолей перспективным является поиск путей управления радиочувствительностью тканей. По данным экспериментальных и клинических исследований гипертермия (ГТ) является сильнейшим модификатором радио- и химиочувствительности опухолевых клеток [2-4]. Исполь-

Кабаков А.Е. – зав. лаб., к.б.н.; Лебедева Т.В. – вед. научн. сотр., к.б.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Анохин Ю.Н.* – зав. кафедрой, к.м.н. ИАТЭ НИЯУ МИФИ.

зование её в клинической онкологии позволило значительно повысить результаты лучевой и химиолучевой терапии опухолей [5-10].

Для дальнейшего улучшения эффективности ГТ в комбинированном лечении опухолей необходимо изучение различных сторон её биологического действия на нормальные и опухолевые ткани в экспериментальных и клинических исследованиях. Установлено, что биологическое действие ГТ проявляется ингибированием синтеза нуклеиновых кислот, белков, их агрегацией и денатурацией, нарушением репарации ДНК, трансмембранного переноса, ингибированием дыхания клеток, подавлением активности лизосом, ферментов репарации, модификацией митотического цикла и т.д. Интенсивность протекания этих процессов зависит от уровня температуры и продолжительности нагревания. Все эти изменения приводят к повреждению клеток или повышению их чувствительности к действию ионизирующей радиации и лекарственных препаратов [11-14]. Следует отметить, что разрывы ДНК происходят при жёстких условиях гипертермии [15], тогда как радиосенсибилизирующее её действие проявляется при более мягкой (42-43 ^оС) тепловой обработке и в основном обусловлено её протеотоксичностью, т.е. повреждением клеточных белков. В условиях in vivo большинство нативных белков имеет трёхмерную глобулярную структуру, которая стабильна при нормальных физиологических условиях благодаря многочисленным водородным связям, электростатическим и гидрофобным взаимодействиям между различными доменами белковой макромолекулы. Эти связи и взаимодействия обеспечивают правильную укладку законченной полипептидной цепи и допустимые (регулируемые) переходы между детерминированными конформациями трёхмерной глобулы. Находясь в физиологических диапазонах температуры, ионной силы и рН, такие глобулярные белки обычно не склонны к агрегации, поскольку все их «липкие» сайты упрятаны внутрь глобулы, экранированы или замкнуты друг на друга. Во время гипертермии поглощение белковыми молекулами квантов энергии приводит к «расплавлению» глобулярных структур, когда разрушаются внутримолекулярные водородные связи, гидрофобные домены экспонируются наружу, а глобулы постепенно разворачиваются, превращаясь в гибкие (термодинамически нестабильные) полипеп-тидные нити. Такая тепловая денатурация внутриклеточных белков, как правило, сопровождается их агрегацией и потерей нормальной функциональной активности; впоследствии многие денатурированные белки подвергаются протеолизу и деградируют. Агрегация, инактивация и деградация термолабильных белков в прогретых клетках приводят к угнетению метаболизма, дисфункции мембранных помп и ионному дисбалансу, разборке цитоскелета и другим нарушениям клеточного гомеостаза, характерным для теплового стресса [16].

Очевидно, что в случае комбинирования лучевой терапии и гипертермии протеотоксич-ность теплового стресса будет усиливать генотоксичность радиационного воздействия, тем самым способствуя радиосенсибилизации опухоли-мишени. Действительно, чтобы выжить и восстановить пролиферативную активность, облучённая раковая клетка должна вовремя репари-ровать радиационные повреждения своего генома (прежде всего двойные разрывы ДНК [17]), что затруднительно осуществить после теплового стресса, когда внутриклеточные системы коммуникаций и регуляторных сигналов не работают из-за инактивации или деградации их функционально важных белковых компонентов. Известно, что гипертермия серьёзно изменяет специфическую реакцию облучённых злокачественных клеток на разрывы ядерной ДНК, нарушая работу киназы АТМ [15] и вызывая деградацию и падение экспрессии BRCA2 – ключевого фермента репарации разрывов ДНК, основанной на гомологической рекомбинации [18, 19]. Если, благодаря всем этим эффектам, репарация радиационных повреждений ДНК не завершается в срок, такая раковая клетка обречена – она либо погибает в результате апоптоза, некроза или митотической катастрофы, либо переходит в необратимое состояние репликативной сенесцен-ции (т.е. утрачивает способность к делению) [20]. Так на молекулярно-клеточном уровне реализуется феномен радиосенсибилизации опухолей посредством их гипертермической обработки.

Взаимодействие гипертермии с ионизирующим излучением

Биологический эффект ГТ при слабых и умеренных температурных режимах (39-42(43) оС) в основном проявляется сенсибилизирующим (сенситизирующим) действием, при высоких (>42(43) oC) – повреждающим. В отличие от действия ионизирующего излучения при ГТ наблюдается другая зависимость чувствительности клеток от стадии клеточного цикла. Клетки в позднем S-периоде характеризуются наибольшей радиорезистентностью и высокой термочувствительностью. Низкий внеклеточный рН опухоли и значительная разница между вне- и внутриклеточными его значениями заметно влияют на реакцию новообразования при различных видах лечения. В кислой среде подавляется радиационно-индуцированный апоптоз, а индуцированная гипертермией гибель клеток усиливается [21]. Выраженный радиосенсибилизирующий эффект ГТ при низких значениях рН особенно выражен для гипоксических клеток [22]. Из этого следует, что при лучевой терапии опухолей ГТ выступает как фактор, сглаживающий колебания в выживаемости клеток в зависимости от различных условий их пребывания (стадии клеточного цикла, уровней рО2, pH). Взаимодействие радиации с гипертермией может проявляться аддитивным или синергетическим (потенцирующим) эффектами. Выраженность проявления этих эффектов определяется уровнем нагрева, дозой радиации, последовательностью применения двух повреждающих факторов и интервалом времени между воздействиями, типом опухоли [23-25].

На рис. 1 представлены кривые выживаемости клеток V79 при нагревании до 42 оС в течение 1,5-11 ч и последующем воздействии ионизирующей радиацией [25]. В этих опытах авторы наблюдали синергизм действия двух повреждающих факторов при всех режимах ГТ, а суммарный эффект зависел от продолжительности нагревания и дозы радиации.

О IOO 200   300  400   500 | 600  700

DOSE (R»d)

Рис. 1. Кривые выживаемости клеток V79 после нагревания при 42 ^оС с продолжительностью от 1,5 до 11 часов и облучения в различных дозах [25].

По оси абсцисс – доза ионизирующей радиации (рад), по оси ординат – выживаемость клеток.

Синергизм действия ГТ и ЛТ был получен для многих опухолей и в условиях in vivo . Частота регрессии саркомы-180 при одной ГТ составила 10%, облучении – 20%, комбинации ГТ с ЛТ – 70-80% [26]. При раздельном нагревании и облучении (16 Гр) карциномы молочной железы мышей не было отмечено полной регрессии, при комбинации их – она наступила у 77% животных [27]. В опытах Robinson J.E. et al. [23] одно нагревание не приводило к полному рассасыванию карциномы молочной железы мышей, в то время как при одной ЛТ значение ТД 50 (доза радиации, приводящая к рассасыванию опухоли у 50% животных) равнялась 52,5 Гр. При комбинации ЛТ и ГТ с продолжительностью 60 мин, величина ТД 50 уменьшалась: при 41 ^оС – до 38 Гр, 42 ^оС – 19,2 Гр, 43 ^оС – 12,3 Гр. Коэффициент термического усиления (КТУ) составил 1,4 при 41 ^оС, 2,7 – при 42 ^оС и 4,3 – при 43 ^оС. Схожие результаты авторами были получены в опытах на меланоме, рабдомиосаркоме, остеосаркоме, аденокарциноме молочной железы мышей. Было также показано, что значение КТУ гипертермии зависит не только от уровня температуры, но и от величины разовой дозы ЛТ. Нагревание фибросаркомы мышей до 41 ^оС сразу после облучения не повышало повреждаемость опухоли, в то время как при 42,5 или 43,5 ^оС и ЛТ в дозе до 20 Гр КТУ составил 1,1-1,3, а в дозах 20-30 Гр – 1,4-1,5 [24].

Радиосенсибилизирующий эффект ГТ обнаружен не только для опухолевых, но и нормальных тканей. Было показано, что с увеличением уровня температуры и дозы радиации КТУ больше при применении ГТ до облучения, чем после. КТУ, оцененный по повреждению кишечника мышей при ГТ до облучения составил 1,25 для 41,3 оС, 1,5 – для 41,8 оС, а при нагревании после облучения равнялся 1,1 и 1,3 соответственно. Это различие более чётко проявлялось с увеличением уровня температуры и дозы радиации [28].

На рис. 2 представлен диапазон изменения КТУ в зависимости от уровня температуры для нормальных тканей, полученный при изучении реакции кожи уха, стопы, кишечника и хряща хвоста мышей и крыс [29].

Рис. 2. КТУ гипертермии в зависимости от уровня температуры для нормальных тканей [29].

Из рисунка следует, что КТУ для нормальных тканей в среднем возрастает от 1,2 при 41 оС и почти до 2 при 43 оС. В этой связи важным является оценка фактора терапевтического выигрыша (ФТВ) при использовании ГТ в комбинации с ЛТ. Количественно ФТВ определяется отношением КТУ для опухолевых и нормальных тканей. О преимуществе применения различных комбинаций ГТ с ЛТ можно говорить, если величина ФТВ значимо больше единицы.

Stewart F.A., Denekamp J. [24] при изучении реакции фибросаркомы и кожи мышей на облучение и ГТ (41,5-43,5 оС, 60 мин) при различных последовательностях и интервалах воздействия (0-6 ч) обнаружили повышение ФТВ до 1,2-1,5 только при нагревании за 3 часа до или через 2-6 ч после облучения. При остальных схемах он был близок к единице. Hill S.A., Denekamp J. [30] на 6 опухолях мышей (карциномы D, NT, RH, саркомы S, F и MT2) изучили зависимости величины ФТВ от последовательности и интервала времени между ГТ и ЛТ. В этих опытах значения ФТВ в меньшей степени зависели от последовательности применения двух факторов: для интервалов времени не более 1 часа он не превышал 1,0, а в некоторых случаях был даже ниже. Для интервала 2-6 часов, за исключением саркомы S, значение ФТВ составляло 1,1-1,3, а иногда достигало 1,4-1,5.

Overgaard J. [31, 32] на карциноме молочной железы и кожи мышей изучил величину ФТВ при различных режимах ГТ (41,5-43,5 оС) и последовательностях применения её с облучением. Наилучшее значение ФТВ (1,67-2,09) он получил при нагревании через 4 ч после облучения. Однако по данным Jansen W. et al. [33], величина ФТВ на карциноме молочной железы мышей была выше 1,0 только при облучении сразу после ГТ, а при интервалах 1-4 часа она снижалась до 1,0. Robinson J.E. et al. [23] при облучении этой же опухоли в середине одночасового нагревания также обнаружили большее повреждение опухоли, чем кожи, т.е. величину ФТВ выше 1,0. Величина ФТВ возрастала с повышением температуры: при 41 оС составляла 1,2; 42 оС – 1,8; 42,5 оС – 1,9; 43 оС – 2,1. Overgaard J. [31, 32] тенденцию к повышению величины ФТВ с увеличением интервала между воздействиями наблюдал на мышах с аденокарциномой молочной железы при фракционированной термолучевой терапии (ТЛТ). Однако Stewart, Deneкamp [34] при облучении фибросаркомы мышей в 1, 2 или 5 фракций и последующем нагревании сразу или через 3 ч выявили, что с увеличением фракции величина КТУ для опухоли снижается, а для кожи остаётся без изменении. Поэтому значение ФТВ выше единицы они получили только при однократном термолучевом воздействии с нагреванием через 3 ч после облучения.

Белки теплового шока и термотолерантность

В клеточных реакциях на гипертермию и радиационное воздействие участвуют так называемые белки теплового шока (БТШ), которые конститутивно экспрессируются в злокачественных клетках и являются одним из факторов устойчивости опухолей к термо-, химио- и радиотерапии [35]. Показано, что функционирование БТШ90 необходимо для пост-радиационной репарации ядерной ДНК [36]. Кроме того, БТШ90, БТШ70 и БТШ27 являются мощными супрессорами апоптоза [37] и помогают стрессированной клетке реактивировать или деградировать денатурированные белки [38]. В случае комбинации гипертермии и облучения эти БТШ образуют комплексы с денатурированными внутриклеточными белками, включаются в состав белковых агрегатов и при этом, вероятно, уже не могут действовать как радиопротекторы и блокаторы апоптоза. Таким образом, рекрутирование БТШ для защиты от протеотоксических эффектов гипертермии происходит в ущерб БТШ-опосредованной радиорезистентности раковых клеток и, следовательно, способствует их радиосенсибилизации. С другой стороны, тепловая денатурация клеточных белков провоцирует характерный стресс-ответ, который заключается в актива- ции транскрипционного фактора HSF1 и последующей HSF1-зависимой индукции дополнительных БТШ [38]. Индукция и временное накопление БТШ90, БТШ70 и БТШ27 в переживших гипертермическую обработку клетках может сделать их на какой-то период термотолерантными и даже более устойчивыми к облучению [35, 39]. Эту информацию следует учитывать при фракционированном воздействии ионизирующей радиации и гипертермии. Это важно понимать, чтобы очередная обработка не приходилась на пик экспрессии индуцированных гипертермией БТШ, когда обогащённые БТШ опухолевые клетки легче переносят и тепловое и радиационное воздействие.

В основе развития ТТ лежит экспрессия белков теплового шока (БТШ) с различными молекулярными массами, в основном 70 кДа [47, 48]. Максимального значения БТШ, как и ТТ достигают через 2-4 часа после первого теплового воздействия, через 6-24 часа скорость синтеза уменьшается до исходного уровня.

Интересным представляется исследование Eng et al. [49], которые выявили, что уровень БТШ в крови у мышей при общей гипертермии (39,5 ^оС) зависит от условий температурного содержания их до нагревания. У животных, находившихся в помещении с температурой 22 ^оС, уровень белков БТШ70, БТШ90, БТШ110 был выше, чем у мышей, содержавшихся при температуре 30 ^оС. Все вышеуказанные процессы, которые происходят в опухоли и в её клетках под действием гипертермии, приводят к изменению их радиочувствительности. С другой стороны, есть возможность менять термочувствительность опухолевых клеток ингибиторами активности и экспрессии шаперонов [50].

Заключение

Взаимодействие ионизирующей радиации с гипертермией может проявляться аддитивным или синергетическим усилением радиационного ответа в облучённых клетках и тканях. Степень этого усиления зависит от многих факторов, таких как условия ГТ, доза радиации, последовательность применения двух повреждающих воздействий и интервал времени между воздействиями, тип опухоли и пр. Радиосенсибилизирующий эффект ГТ обнаружен не только для опухолевых, но и для нормальных тканей, что требует изучения фактора терапевтического выигрыша при лучевой терапии различных типов опухолей. В клеточных реакциях на ГТ и облуче- ние активно участвуют БТШ, которые конститутивно экспрессируются в злокачественных клетках и вносят вклад в устойчивость опухолей к термо-, химио- и радиотерапии. Показано, что функционирование БТШ90 необходимо для пост-радиационной репарации разрывов ядерной ДНК. Кроме того, БТШ90, БТШ70 и БТШ27 являются мощными супрессорами апоптоза и помогают стрессированной клетке реактивировать или деградировать денатурированные белки. В случае комбинации ГТ и облучения эти БТШ образуют комплексы с денатурированными внутриклеточными белками и уже не могут действовать как радиопротекторы и блокаторы апоптоза. Таким образом, рекрутирование БТШ для защиты от протеотоксических эффектов ГТ происходит в ущерб БТШ-опосредованной радиорезистентности раковых клеток и, следовательно, способствует их радиосенсибилизации. С другой стороны, тепловая денатурация клеточных белков провоцирует HSF1-зависимую индукцию дополнительных БТШ в клетках-мишенях, что может повысить их термо- и радиорезистентность. Необходимо дальнейшее изучение биологических эффектов ГТ, чтобы сделать её радиосенсибилизирующее действие более селективным в отношении злокачественных опухолей.