Реакция тучных клеток различных зон печени в условиях моделирования физической нагрузки

(4).930

Физическая активность является одним из ключевых аспектов здорового образа жизни [1–3]. Однако чрезмерное физическое перенапряжение может увеличивать риск развития патологических состояний, включая случаи внезапной сердечной смерти у лиц, занимающихся высокоинтенсивными тренировками, и профессиональных спортсменов. Неблагоприятный исход возможен как при нарушении режима выполнения физической нагрузки, так и при наличии субклинически протекающих патологических процессов.

Печень, являясь центральным органом метаболизма, активно участвует в адаптации организма к физическим нагрузкам, обеспечивая энергетический гомеостаз, детоксикацию и регуляцию иммунных реакций. Паренхима печени представляет собой сложную структуру с различными типами клеток, к которым относятся: клетки Купфера, звёздчатые клетки печени, синусоидальные и сосудистые эндотелиальные клетки, фибробласты. Все эти клетки играют роль в патофизиологии печени и определяют сложные взаимодействия с тканевыми клетками миелоидного ряда, в частности, с тучными клетками (ТК).

ТК занимают уникальное звено среди клеток иммунного ответа и образуют кооперационные связи с нервной, эндокринной и иммунной системами. Они способны быстро высвобождать биологически активные вещества из своих гранул, инициируя как немедленные, так и отсроченные воспалительные реакции. Однако роль ТК печени в развитии адаптационных и патологических процессов при физических нагрузках различной интенсивности остаётся недостаточно изученной.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ – оценить реакцию тучных клеток различных зон печени и уровень IL-6, ФНО- α в плазме крови в условиях моделирования физической нагрузки разной степени интенсивности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты основывались на принципах гуманности, изложенных в Директиве Совета Европейского Союза (86/609/ЕЭС), а также в ГОСТ Р 53434-2009 от 1 марта 2010 г. «Принципы надлежащей лабораторной практики» (идентичен GLP OECD). Проведение эксперимента одобрено этическим комитетом Марийского государственного университета (протокол №1 от 28.04.2023 г.).

Манипуляции с лабораторными крысами проводили в соответствии с Хельсинкской декларацией (2000), правилами проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации (утверждены МЗ РФ 29.12.98), ГОСТ №33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными», ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Экспериментальные животные и дизайн исследования

Эксперименты проведены на самцах крыс линии Wistar массой 240 г (n=32), разделённых на 4 группы по 8 животных в каждой:

• •    Контрольная группа (n=8) – животные содержались в стандартных условиях вивария без физической нагрузки;

• •    Группа лёгкой физической нагрузки (n=8);

• •    Группа средней физической нагрузки (n=8);

• •    Группа тяжёлой физической нагрузки (n=8).

Опытные животные содержались в одинаковых условиях и получали корм и воду в свободном доступе.

Моделирование физической нагрузки

Физическую нагрузку воспроизводили методом принудительного плавания в ванне с водой температурой 29–32°С [4]. Животные первой опытной группы плавали 15 минут (лёгкая физическая нагрузка). Крысы второй опытной группы находились в ванне 30 минут; эту нагрузку расценивали как среднюю. Для воспроизведения тяжёлой физической нагрузки (третья опытная группа) животные плавали до момента выраженного утомления, который определяли по потере координации движений и началу погружения в воду. Обычно это наступало через 55–59 минут после начала нагрузки. После извлечения из ванны животные были вялыми, некоторое время лежали неподвижно, не принимали пищу. Животными всех групп было выполнено 10 сеансов водной нагрузки, после чего их выводили из эксперимента путём декапитации на гильотине сразу после последнего сеанса.

Гистологические исследования

Для гистологических исследований образцы тканей печени фиксировали в 10% нейтральном формалине (ООО «БиоВитрум», Санкт-Петербург). Обезвоживали и заливали в гомогенизированную парафиновую среду для заливки BioPlast («BioOptica», Италия). Парафиновые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Тучные клетки выявляли окраской толуидиновым синим («BioVitrum», Россия).

Микроскопическое исследование проводилось на микроскопе Leica DM 2500 (Leica, Germany) с видеокамерой Leica DFC420. Анализ изображений выполняли в программе Leica Application Suite (V4) (Leica, Germany). Плотность распределения ТК подсчитывали в программе ImageTool 3. Вычисляли индекс дегрануляции ТК (ИДТК) как процент клеток в состоянии дегрануляции от общего числа ТК.

Определение цитокинов

Уровень IL-6 и ФНО- α в плазме крови опытных животных определяли методом иммуно-ферментного анализа с помощью прибора Lazurite Automated Elisa System (Dynex Technologies Inc., США) согласно инструкции производителя.

Статистическая обработка

Описательная статистическая обработка проводилась в программе Statistica 10 (США). Для проверки равенства медиан нескольких выборок рассчитывался критерий Краскела– Уоллиса. Данные по каждой группе животных усредняли и вычисляли стандартную ошибку среднего (M±m). Применялся корреляционный анализ (коэффициент ранговой корреляции Спирмена). Результаты считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологическая характеристика тучных клеток при различной физической нагрузке

При лёгкой физической нагрузке ТК не изменяли своей формы, были округлой конфигурации, с гранулами, которые плотно располагались в цитоплазме клеток. ТК встречались в портальной зоне и вдоль сосудов. Преобладали компактные формы ТК, клетки с признаками дегрануляции были незначительны. Плотность распределения ТК и ИДТК статистически значимо не изменились в сравнении с контрольной группой (табл. 1).

При средней физической нагрузке ТК формировали скопления, локализовались в портальных трактах, около сосудов. В ряде полей зрения встречались ТК в виде прерывистой цепочки, чаще вдоль сосудов (рис. 1). Изменялась форма клеток: помимо округлых ТК встречались клетки вытянутой конфигурации. Возрастало число ТК в 1,6 раза с одновременным снижением доли компактных форм в 1,1 раза и увеличением ИДТК в 1,4 раза. Незначительно увеличилась площадь ТК (табл. 1).

При тяжёлой физической нагрузке ТК отличались выраженным полиморфизмом: встречались как крупные, так и более мелкие клетки, разнилась их форма от округлой до вытянутой, встречались дегранулированные формы ТК. ТК располагались вдоль сосудов (рис. 1), около дистрофически изменённых гепатоцитов и около зон некрозов. ТК были как одиночными, так и встречались группами по несколько клеток.

Распределение ТК статистически значимо изменялось: возросло число ТК в 2,8 раза, уменьшился процент компактных форм ТК в 1,2 раза, увеличился ИДТК в 1,9 раза и площадь клеток в 1,6 раза в сравнении с контрольными животными (табл. 1). Гистологически выявлялись дистрофические изменения гепатоцитов и воспалительные клеточные инфильтраты в ткани печени.

Таблица 1. Сравнительные данные ТК при моделировании физической нагрузки разной степени (М±m)
Группы	Распределение тучных клеток
	Число ТК	Компактные ТК (%)	ИДТК	Площадь ТК (мкм2)
ИГ	8,2±1,8	82,7±0,8	17,3±0,4	35,1±4,9
ЛФА	8,3±2,3	82,9±1,1	17,1±0,9	35,3±5,3
СФА	13,6±1,9	75,7±0,9	24,3±2,3	40,6±5,8
ТФА	22,7±0,8*	66,8±1,7*	33,2±0,3*	56,2±6,9

Примечание: ЛФА – легкая физическая активность; СФА – средняя физическая активность; ТФА – тяжелая физическая активность; * – уровень статистической значимости различий.

А                             Б                             В

Рис. 1. Распределение тучных клеток в печени при средней (А) и тяжёлой (Б) физической нагрузке. Окраска толуидиновым синим. Ув. ×400

Цитокиновый профиль при различной физической нагрузке

Уровень провоспалительных цитокинов при лёгкой физической нагрузке статистически значимо не изменился (табл. 2). При средней физической активности незначительно увеличились ФНО- α и IL-6. При выполнении животными тяжёлой нагрузки произошло статистически значимое повышение показателя ФНО- α в 4,4 раза и IL-6 в 2,6 раза (р<0,001) в сравнении с контрольными животными.

Таблица 2. Цитокиновый профиль в плазме крови опытных животных

Опытные животные	ФНО- α , пг/мл	IL-6, пг/мл
Интактная группа	4,2±0,7	38,07±6,7
Легкая физическая активность	4,3±0,5	38,3±5,3
Средняя физическая активность	8,4±3,2	48,9±7,6
Тяжелая физическая	18,6±3,8*	97,3±5,1*
активность	р=0,001	р=0,001

Примечание: * – уровень статистической значимости различий тяжелой физической нагрузки с интактными живот-нымиПримечание: * – уровень статистической значимости различий с контрольной группой (p<0,001).

При изучении корреляционных взаимодействий при тяжёлой физической нагрузке выявлены сильные корреляционные связи между ФНО- α , IL-6 и ИДТК (r=0,9, р<0,05), а также сильная положительная связь между ФНО- α , IL-6 и уровнем ТК (r=0,8, р<0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

ТК являются первичной клеточной популяцией, участвующей в воспалении. За счёт быстрого высвобождения своих провоспалительных гранул ТК определяют механизмы, которые развиваются как немедленно, так и формируют поздний ответ. В экспериментальных исследованиях показано, что при токсическом повреждении печени CCl₄ плотность ТК увеличивается уже через два часа после воздействия, что свидетельствует о раннем рекрутировании ТК в повреждённые ткани, и это увеличение становится ещё более очевидным через 24 часа [6, 7]. Авторы установили, что данный феномен является важным маркером острой воспалительной реакции печени на токсическое повреждение.

В представленном исследовании выявлено возрастание количества ТК в различных зонах ткани печени при средней и, особенно, тяжёлой физической нагрузках. Механизмы увеличения числа ТК могут включать как их миграцию из других органов и тканей, так и пролиферацию резидентных клеток-предшественников в печени [1, 2].

Повышение ИДТК свидетельствует об активации дегрануляции ТК. Известно, что при дегрануляции ТК происходит высвобождение эйкозаноидов (лейкотриен C₄ и простагландин E₂) и цитокинов, которые стимулируют ответ Th2-клеток: IL-4, IL-13, GM-CSF, а также цитокинов, способствующих воспалительной реакции: ФНО- α и IL-6. Большинство цитокинов ТК синтезируют под влиянием внешних стимулов, и лишь IL-4, IL-13, GM-CSF выделяются постоянно [6–8].

При тяжёлой физической нагрузке происходило статистически значимое увеличение в плазме крови ФНО-α и IL-6. Иммунный ответ в этом случае обусловлен повышением уровня провоспалительных цитокинов. Помимо ТК, IL-6 синтезируется активированными моноцита-ми/макрофагами, фибробластами, эндотелиальными клетками. IL-6 опосредует иммунные реакции, воспаление, реакции острой фазы. ФНО-α вырабатывается клетками иммунной системы, помимо ТК – моноцитами и макрофагами [9]. ФНО-α способен взаимодействовать с другими цитокинами и стимулировать секрецию интерлейкинов (IL-1, IL-6, IL-8), интерфе- рона γ, хемокинов, выполняя провоспалитель-ную роль.

Выявленные сильные корреляционные связи между уровнем ТК, степенью их дегрануляции и концентрацией провоспалительных цитокинов в крови указывают на важную роль ТК в развитии системного воспалительного ответа при интенсивных физических нагрузках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реакция тучных клеток различных зон печени в условиях моделирования физической нагрузки сопровождалась изменением распределения тучных клеток, увеличением их морфофункциональной активности и повышением уровня провоспалительных цитокинов в плазме крови. При тяжёлой физической нагрузке выявлены сильные корреляционные взаимодействия между ФНО- α , IL-6 и индексом дегрануляции тучных клеток (r=0,9, р<0,05), а также между ФНО- α , IL-6 и уровнем тучных клеток (r=0,8, р<0,05).

Тучные клетки являются одним из ключевых патогенетических звеньев в развитии воспалительной реакции печени при интенсивных физических нагрузках, выступая важными эффекторами в сложном спектре иммунных реакций.