Реактивные изменения ткани печени крыс в результате нагрузки шротами семян винограда и кунжута

Супильников Алексей Александрович, кандидат медицинских наук, доцент, проректор по научной деятельности и организационным вопросам детоксикации и антимикробной защиты организма [2, 6, 10]. Многообразие нарушений функций печени существенно осложняет задачу медикаментозной коррекции патологических состояний органа и требует применения фармакологических средств широкого спектра действия. Сложившаяся ситуация требует все более частого назначения гепато-протекторов, действие которых направлено на восстановление гомеостаза печени, повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени [2, 8, 10]. В связи с этим в настоящее время в практической медицине отмечается дефицит гепатопротекторов, к тому же, в лечении заболеваний печени преимущество отдается препаратам природного происхождения, сочетающих мягкое терапевтическое действие с минимумом побочных эффектов [3, 10].

На наш взгляд, этим требованиям отвечают шроты семян винограда и кунжута, получаемые компанией ООО «Золотой корень» (г. Самара). Шрот семян винограда и кунжута – это побочные продукты маслоэкстракционного производства, получаемые после извлечения масла из семян экстрагированием органическими растворителями, они представляет собой обезжиренные порошки, отличающиеся повышенным содержанием белка, богатым минеральным составом, а также ценным набором биологически активных соединений [4, 5, 7,]. По мнению исследователей [1-3, 10] при некоторых поражениях печени и дополнительных сопутствующих заболеваниях наиболее эффективно применять гепатопротекторы на основе растительного сырья в виде шротов, так как они, по сути, являются концентрированными экстрактами поли-фенольных соединений и практически не содержат масла, которое препятствует высвобождению водорастворимых биофлавоноидов в желудочнокишечном тракте [5, 10].

Цель исследования: изучение реактивных изменений ткани печени крыс на фоне нагрузки шротами семян винограда и кунжута как потенциальных гепатопротекторных средств.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: провести гистологический анализ ткани печени в эмбриогенезе и онтогенезе крыс на фоне дополнительной нагрузки внутрижелудочно шротами семян винограда и кунжута в виде суспензий. Исследования проводили на 30 (21 самка, 9 самцов) белых беспородных крысах массой 190-210 г, которые были поделены поровну на контрольную (интактную) и две опытные группы. Животные первой опытной группы в качестве дополнительной нагрузки получали внут-рижелудочно суспензию шрота семян винограда в виде суспензии в дозе 10 мг/100 г веса тела объемом 1 мл, а второй – суспензию шрота семян кунжута аналогичной дозы и объема согласно схеме опыта. Суспензии шротов готовили на дистиллированной воде [9]

Материалом для гистологического анализа тканей печени послужили эмбрионы на 15 и 21 сутки развития, а также печень взрослых половозрелых крыс, которым в течение 30 дней до наступления беременности и до родов в качестве дополнительной нагрузки внутрижелудочно согласно группе вводили суспензии шротов семян винограда и кунжута. Контролем послужил мАтериал от интактных крыс аналогичных сроков развития. Для получения самок с датированным сроком беременности использовали 4-4,5 месячных крыс, которым, с учетом эстрального цикла, вечером подсаживали самцов, а утром брали влагалищные мазки. Так как у крыс покрытие происходит в 1-2 часа ночи, считали день обнаружения спермы в мазке первым днем беременности.

По окончанию эксперимента животных подвергали декапитации после ночного голодания, а затем извлекали печень. Фиксацию печени взрослых крыс и эмбрионов проводили в 10% забуфе-ренном формалине, затем осуществляли проводку гистологического материала с помощью аппарата гистологической проводки замкнутого типа Tissue-Tek® Vip 5 junior, а после заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 6-7 мкм. Срезы ткани печени окрашивали гематоксилином и эозином. Также проведено иммуногистохимическое исследование печени с применением набора моноклональных антител к ингибитору апоптоза (Bcl-2) и антигену пролиферации (Ki-67). Типирование проводили с использованием антител фирмы DACO. Экспериментальные исследования выполнено в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Фотографическую съемку образцов ткани печени осуществляли с помощью светового микроскопа «Микромед» при увеличении х40, х100 и х200. Визуализацию препаратов проводили при помощи светового микроскопа «Микромед» и цифровой фотовидеокамеры.

Исследование реакции ткани печени на введение суспензий шротов семян винограда и кунжута показало, что на 15 сутки эмбриогенеза балочное строение печени крыс находится в стадии формирования (рис. 1). Дольчатое строение печени у животных всех экспериментальных групп на 15 сутки эмбриогенеза не развито. В формировании печеночных балок наблюдается более плотное скопление клеток по периферии в подкапсулярной зоне и рыхлое расположение к центру за счет расширенных синусоидных пространств в глубине органа.

а

в

Рис. 1. Печень на 15 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилин – эозин. Увеличение х40: а – печень интактных крыс; б – печень на фоне нагрузки шротом семян винограда; в – печень на фоне нагрузки шротом семян кунжута

Капилляры синусоидного типа имеют расширения, которые заполнены дифференцирующимися клетками эритроцитарного ряда. Имеются участки эритропоэза и лимфопоэза, но в печени животных опытных групп, получавших шроты, эритропоэз выражен сильнее, островков кроветворения больше, в отличие от печени животных контрольной группы, в которой встречаются только единичные эритробласты (рис. 2).

В целом развитие печени в эмбриогенезе на 15 сутки у крыс, получавших, в качестве дополнительной нагрузки, суспензии шротов семян винограда и кунжута, не отличается от контрольной группы. К 21 суткам эмбриогенеза наблюдается сформированное балочное строение печени у всех животных, находящихся в эксперименте (рис. 3).

а

б

в

Рис. 2. Ткань печени крыс на 15 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилин – эозин. Увеличение х200: а – печень интактных крыс; б – печень на фоне нагрузки шротом семян винограда; в – печень на фоне нагрузки шротом семян кунжута

Наблюдается развитое радиальное строение печени. Расширенные перисинусоидальные пространства заполнены участками эритро- и лимфопоэза, междольковая соединительная ткань и портальные тракты не развиты. Наблюдается развитое радиальное строение печени. Расширенные перисинусоидальные пространства заполнены участками эритро- и лимфопоэза, междольковая соединительная ткань и портальные тракты не развиты. Также в ткани печени животных опытных групп на 21 сутки эмбриогенеза обнаружены некоторые особенности, по сравнению с печенью животных контрольной группы.

б

в

Рис. 3. Ткань печени опытных крыс на 21 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилин – эозин. а – печень интактных крыс. х40: б – печень интактных крыс; х40. в – печень на фоне нагрузки шротом семян кунжута. х200

В структуре органа крыс, получавших дополнительно суспензию шрота семян винограда, наблюдается формирование соединительной ткани по ходу междолевых и сегментарных желчных протоков, вокруг вен отмечается более плотное скопление гепатоцитов (рис. 4). В структуре органа крыс, получавших дополнительно суспензию шрота семян кунжута, наблюдаются несколько увеличенные желчные протоки и расширенные желчные капилляры (рис. 5). В целом развитие печени в эмбриогенезе на 21 сутки у крыс всех опытных групп соответствует печени интакных животных.

Рис. 4. Ткань печени опытных крыс на 21 сутки эмбриогенеза. Дольки печени. Окраска гематоксилином и эозином. х100

Рис. 5. Расширенные желчные протоки на 21 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилин – эозин. х200

К четырем месяцем онтогенеза в структуре печени крыс контрольной и обеих опытных групп портальные тракты сформированы, между дольками соединительная ткань отсутствует, структура долек четко определяется, желчные капилляры не видны, гемопоэз отсутствует (рис. 6). В печени животных, получавших шрот семян кунжута, наблюдается мелкокапельная и среднекапельная жировая дистрофия, которая отсутствует у животных интактной и второй экспериментальной группы.

а

б

в

Рис. 6. Ткань печени опытных крыс на 4 месяц онтогенеза. Окраска гематоксилин – эозин. а – печень интактных крыс. х100. б – печень на фоне нагрузки шротом семян винограда. х40. б – печень на фоне нагрузки шротом семян винограда. х40

Проведенные иммуногистохимические исследования печени интактных крыс в изучаемые периоды развития с применением набора моноклональных антител к ингибитору апоптоза (Bcl-2) показали, что на 100 клеток положительная экспрессия антигена в ядрах выявляется в 8,7±0,29 гепатоцитах, а к антигену пролиферации (Ki-67) положительная экспрессия антигена в ядрах выявляется в 10,3±0,35 гепатоцитах в эмбриональные периоды развития. К четвертому месяцу онтогенеза отмечается выравнивание показателей пролиферации и апоптоза: на 100 клеток положительная экспрессия антигена к ингибитору апоптоза (Bcl-2) в ядрах выявляется в 7,1±0,26 гепатоцитах, а к антигену пролиферации (Ki-67) – 7,7±0,25 гепатоцитах. Иммуногистохимические исследования тканей печени на 15 и 21 сутки эмбриогенеза с применением моноклональных антител к антигену пролиферации (Ki-67) у крыс, получавших шрот семян винограда, не выявили достоверно значимых отличий от экспрессии антигена у животных контрольной группы. Но в тканях печени 4-х месячных крыс опытной группы наблюдалась пролиферация эндотелия сосудов и пролиферация гепатоцитов (на 100 клеток 15,6±0,55 пролиферируют) в отличие от интактных животных (рис. 7).

Рис. 7. Печень экспериментальной крысы, получавшей шрот семян винограда на 4 месяц онтогенеза. Положительная экспрессия маркера в ядрах отдельных гепатоцитов и ядрах эндотелия сосудов. Иммуногистохимическое исследование экспрессии антигена пролиферации Ki-67. х100

Рис. 9. Печень экспериментальной крысы, получавшей шрот семян винограда, на 4 месяц онтогенеза. В гепатоцитах по периферии печени выраженная экспрессия антигена. Иммуногистохимическое исследование антител к ингибитору апоптоза Bcl-2. х200

В результате иммуногистохимического исследования тканей печени крыс, на фоне нагрузки шротом семян винограда, на 15 и 21 сутки эмбриогенеза, а также печени 4-хмесячных крыс с применением набора моноклональных антител к ингибитору апоптоза (Bcl-2) было выявлено, что на 15 сутки эмбриогенеза показатели частоты экспрессии антигена соответствуют интактным животным. На 21 сутки эмбриогенеза заметно увеличение частоты экспрессии антигена (Bcl-2) в клетках лимфоидного ряда и в эндотелиоцитах синусоидных капилляров (рис. 8).

Рис. 8. Печень экспериментальной крысы, получавшей шрот семян винограда, на 4 месяц онтогенеза. В клетках лимфоидного ряда выраженная экспрессия антигена.

Иммуногистохимическое исследование антител к ингибитору апоптоза Bcl-2. Увеличение х200

В тканях печени 4-х месячных крыс, получавших шрот семян винограда, имеет место выраженная экспрессия антигена, наблюдается ингибирование апоптоза в гепатоцитах по периферии долек печени (рис. 9). Иммуногистохимические исследования тканей печени крыс, получавших шрот семян кунжута, на 15 и 21 сутки эмбриогенеза и 4 месяц онтогенеза с применением моноклональных антител к ингибитору апоптоза (Bcl-2) не вывили особенностей.

Иммуногистохимическое исследование тканей печени крыс, получавших шрот семян кунжута, на 15 и 21 сутки эмбриогенеза и 4 месяц онтогенеза с применением моноклональных антител к маркеру пролиферации (Ki-67) показало, что наиболее значимые отличия от печени крыс интактной группы выявляются в органе на 15 и 21 сутки эмбриогенеза и свидетельствуют об увеличении частоты экспрессии антигена в эпителии желчевыводящих протоков.

Выводы:

• 1.    На нагрузку суспензией шрота семян винограда организм крыс отвечает отсутствием апоптоза в гепатоцитах периферической части долек печени, повышенной синтетической активностью клеток, синтезирующих альбумины и белки плазмы крови. В тоже время, усиленная пролиферация клеток центральной части печени является фактором повышения дезинтоксикационной функции органа.

• 2.    На нагрузку суспензией шрота семян кунжута ткань печени эмбрионов и взрослых половозрелых крыс не отвечает патологическими изменениями, но на 15 и 21 сутки эмбриогенеза отмечается усиленная пролиферация клеток желчевыводящих протоков, что подтверждают данные иммуногистохимического исследования. Также на фоне нагрузки шротом семян кунжута, у эмбрионов пролонгируется эритропоэз до момента рождения (по сравнению с животными контрольной группы).

• 3.    Реактивные изменения ткани печени крыс в результате нагрузки шротом семян винограда на клеточном уровне подтвердили гепатопротектор-ный эффект шрота, обнаруженный нами в предыдущих исследованиях ферментов системы перекисного окисления липидов-антиоксидантов печени на экспериментальной модели токсического гепатита [3,5]. Однако на основании проведенного эксперимента достоверных данных о гепатопро-текторном действии шрота семян кунжута не получено, но, вероятно, на фоне нагрузки шротом изменяется экзокринная функция печени, проявляющаяся в образовании желчи и секреции белков плазмы крови.