Редокс-зависимые процессы в опухолевой ткани рака шейки матки при воздействии фемтосекундного лазерного излучения

Аляпышев Григорий Сергеевич, студент.

ствие данных об изменении биологического портрета опухолей различной тканевой организации при воздействии ЛИ с различными параметрами. Основными преимуществами фемтосекундных (ФС) лазеров является малая длительность импульса, высокая пиковая (кВт) и малая средняя (мВт) мощности, что позволяет предполагать отсутствие выраженных термических эффектов. В медицине сегодня эти лазеры используются в качестве голографического пинцета и оптического скальпеля. Использование фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) в терапии поверхностно локализованных опухолей позволило бы существенно снизить лучевую нагрузку на пациента.

В соответствии свышеизложенным, целью исследования было изучение влияния ФСЛИ на показатели оксидативного стресса в опухолевой ткани при экспериментальном раке шейки матки (РШМ).

Материалы и методы исследования. Модель РШМ была воспроизведена на белых инбредных мышах массой не менее 20 г путем перевивки опухолевого штамма РШМ-5 (НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва).

Использовали фемтосекундный волоконный эрбиевый лазер, который является совместной разработкой Научного центра волоконной оптики Российской Академии наук и Ульяновского государственного университета, со следующими характеристиками: длительность импульса 100*10-15с, пиковая мощность 6 кВт, средняя мощность 1,26 мВт ±2%, X =1,55 мкм. При облучении ФС лазером средняя плотность энергии на ткань (энергетическая доза) за одну процедуру составляла 0,24 Дж/см2 за 10 минут и 0,36 Дж/см2 за 15 минут, но при этом облучение проходило в импульсном ре- жиме при огромной пиковой интенсивности, равной 1910,8 Вт/см2. При 10-ти процедурах 10-ти минутного лазерного облучения суммарная энергетическая доза ЛИ за курс составила 2,4 Дж/см2. При 10-кратном облучении в режиме 15-ти минут на расстоянии 10 см суммарная плотность энергии на ткань составила 3,6 Дж/см2.

Биохимические методы исследования. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по уровню вторичного продукта – малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой [3]. Активность су-пероксид-дисмутазы (СОД) определяли по методу Nishikimi M. в модификации Дубининой Е.Е. [4, 5], каталазы и глутатион-редуктазы (ГР) по Карпищенко А.И. [6], глутатион-S-трансфе-разы (ГТ) по Habig W.H.[7]. Активность антиоксидантных ферментов и уровень МДА пересчитывались на 1 мг белка, который определяли по методу Брэдфорда [8].

Морфологические методы исследования. Опухолевый материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заключали в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозиноном. Для морфометрического исследования применялась компьютерная видео-тест-система с программой денситофотометрии «Mecos C1». При анализе гистологических срезов производился расчет удельного объема опухолевой паренхимы, удельного объема опухолевой стромы, удельного объема участков некроза, митотического и апоптоти-ческого индексов. Апоптотические клетки определяли по уровню маргинации хроматина, неровным контурам ядра, наличию кариопикно-за и кариорексиса, а также по некоторым изменениям в цитоплазме (изменение окрашивания цитоплазмы, вакуолизация цитоплазмы, изменение контуров и фрагментация клеток) [9].

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и корреляционного критерия значимости (Т) по Стьюденту. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования. Опухолевая трансформация сопровождается изменением внутриклеточного метаболизма, в частности, изменением образования и утилизации различных форм активного кислорода.

Наши исследования показали достоверное увеличение показателей уровня МДА с ростом опухоли (27,94±1,60; 36,3±1,22; 58,55±6,51 мкмоль/мг белка на 20-ые, 30-ые, 40-ые сутки после трансплантации, соответственно) (рис. 1), что не противоречит данным литературы об усилении ПОЛ при прогрессировании неоплазмы, хотя существует мнение, согласно которому активность процессов ПОЛ в опухолевых клетках может быть снижена [10].

Активность антиоксидантных ферментов (АОФ) в неоплазме в процессе развития РШМ-5 (табл. 1) зависела от стадии развития опухоли.

Как следует из представленных данных, при прогрессировании РШМ-5 в неоплазме достоверно возрастает активность СОД и ГТ (табл. 1). Уровень каталазы, напротив, снижается с увеличением сроков роста опухоли, количество ГР значимо не изменяется . Таким образом, в динамике прогрессирования РШМ-5 имеет место возрастание уровня МДА в неоплазме при разнонаправленном изменении активности ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ), что позволяет предполагать возникновение в опухолевой ткани оксидативного стресса.

Установлено, что молекулы кислорода, находящегося в межлипидном пространстве мембран клеток, являются основным акцептором ЛИ. Возникающие при этом гидроперекиси липидов в при-

Сутки после перевивки

Рис. 1. Уровень МДА в неоплазме мышей на разных сроках после трансплантации РШМ-5

Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных контроля, р < 0,05

Таблица 1. Показатели ферментов АОЗ в неоплазме мышей в динамике прогрессирования РШМ-5

Антиоксидант, ед. изм. Сроки после перевивки опухоли	СОД, у.е./мг белка (n=18)	Каталаза, ммоль/с/мг белка (n=18)	ГР, ммоль/мин/м г белка (n=18)	ГТ, ммоль/мин/м г белка (n=18)
20 сутки	9,23±0,93	0,747±0,345	0,235±0,008	0,465±0,076
30 сутки	26,57±6,00*	0,537±0,100*	0,212±0,016	1,502±0,292*
40 сутки	27,10±4,70*	0,592±0,160*	0,218±0,018	1,603±0,152*

Примечание: * – данные, достоверно отличающиеся от данных на 20-ые сутки после трансплантации опухоли, р <  0,05

сутствии восстановленных форм железа инициируют цепную реакцию окисления полиненасы-щенных жирных кислот клеточных мембран и плазмы крови. Синглетный кислород, образующийся в результате фотохимических реакций, в частности, может повреждать цитоплазматические мембраны, что сопровождается соответствующими физиологическими реакциями на уровне целостного организма . Корси Л.В. с соавт. (2009) показали, что облучение клеток опухоли на длине волны 1268 нм приводит к образованию синглетного кислорода и индуцируемых им реакций окисления, так как ближний инфракрасный диапазон является спектром поглощения кислорода [11].

Изменение уровня МДА в неоплазме под влиянием ФСЛИ представлено в табл. 2

Воздействие ФСЛИ в дозах 2,4 Дж/см2и 3,6 Дж/см2 статистически значимо увеличивает количество МДА в неоплазме на 20-ые и снижает на 30-ые сутки после трансплантации опухоли.

Результаты изучения активности ферментов АОЗ в неоплазме после ФСЛИ представлены в табл. 3.

ФСЛИ на 20-ые сутки после трансплантации РШМ-5 не влияет на активность ГР и каталазы, одновременно увеличивая активность СОД. Уровень ГТ изменяется волнообразно в зависимости от дозы облучения (табл. 3). На 30ые сутки после перевивки опухоли активность ГР и СОД снижается при возрастании активности каталазы (табл. 3).

Морфологическая характеристика опухолевой ткани при прогрессировании РШМ-5

При оценке морфометрических показателей опухолевой ткани в динамике прогрессирования РШМ-5 установлено, что имеет место достоверное снижение удельного объема опухолевой паренхимы с 76,81±2,01% на 20-ые сутки, до 65,34±2,78% на 30-ые и 43,09±7,58% на 40-ые сутки после трансплантации опухоли. Одновременно снижается и удельный объем опухолевой стромы с 1,207±0,158% на 20-ые сутки после перевивки до 0,200±0,036% на 30-ые и 0,070±0,025% на 40-ые сутки. Уменьшение площади паренхимы, вероятно, обусловлено увеличением зон некроза (21,99±2,05%; 34,64±2,76%; 53,35±11,06% на 20-ые, 30-ые и 40-ые сутки, соответственно). С ростом опухоли возрастает число и размеры участков некроза, выявляемых как в центральных, так и в периферических отделах опухолевой ткани. Апоптотический и митотический индексы достоверно не изменяются в динамике прогрессирования опухоли. При этом апоптотический индекс составляет на 30-ые сутки 67,00±4,25‰, на 40-ые сутки 82,25±9,74‰ относительно 20-х суток (87,00±3,76‰). Митотический индекс значимо не изменяется на всех сутках после трансплантации опухоли (87,00±3,76; 67,00±4,25; 82,25±9,74% на 20-ые, 30-ые, 40-ые сутки после трансплантации опухоли, соответственно).

Таблица 2. Уровень МДА (мкмоль/мг белка) в неоплазме РШМ-5 при воздействии разных доз ФСЛИ

Доза ФСЛИ Эксперимент. группа	Без облучения n=18	Э сред .=2,4 Дж/см2 n=18	Э сред .=3,6 Дж/см2 n=18
20 сутки РШМ -5	27,94±1,600	32,17±1,150*	33,92±2,780*
30 сутки РШМ -5	36,30±1,220	32,44±0,960*	33,81±1,490

Примечание: * - данные статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, p<0,05

Таблица 3. Активность ферментов АОЗ в опухолевой ткани РШМ-5 в разные сроки после трансплантации опухоли при воздействии ФСЛИ

Группы Показатели	20-е сутки роста РШМ			30-е сутки роста РШМ
	Без облучения n= 20	Э =2 4 сред. , Дж/см2 n= 12	Э сред .=3,6 Дж/см2 n= 12	Без облучения n= 20	Э =2 4 ср ед. , Дж/см2 n= 12	Э сред .=3,6 Дж/см2 n= 12
ГР,ммоль/ми н/мг	0,24±0,008	0,240±0,009	0,250±0,006	0,210±0,016	0,170±0,004*	0,140±0,005*
ГТ,ммоль/ми н/мг	0,470±0,076	0,750±0,070*	0,560±0,077	1,50±0,292	1,74±0,120	0,64±0,065*
СОД, у.е./мг	9,23±0,93	12,92±1,92*	17,10±1,40*	26,57±2,00	8,15±0,20*	14,86±3,41*
Каталаза, ммоль/с/мг	0,750±0,345	0,530±0,110	1,050±0,169	0,540±0,100	0,450±0,073	0,810±0,019*

Примечание: * - данные статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, p<0,05

Воздействие ФСЛИ в обеих использованных дозах на разные сутки после трансплантации опухоли вызывает достоверные изменения в морфометрических показателях опухолевой ткани (табл. 4).

На 20-е сутки после трансплантации опухоли ФСЛИ приводит к уменьшению удельного объема опухолевой паренхимы (рис.2), стромы, митотического и апоптотического индексов (‰). Однако, при облучении мышей ФС лазером вдвое возрастает удельный объем участков некроза, что позволяет предполагать о том, что ФСЛИ является активатором некротических процессов в опухолевой ткани экспериментального РШМ (рис.34). На 30-е сутки после трансплантации опухоли воздействие ФС лазером вызывает те же изменения, что и на 20-е сутки после перевивки, за исключением изменений в удельном объеме опухолевой стромы: на 30-е сутки облучение ФС-лазе-ром дозозависимо увеличивает объем опухолевой стромы (рис.2).

Результаты данного исследования позволяют предполагать, что ФСЛИ в исследуемых дозах стимулирует некроз опухолей.

ВЫВОДЫ

• 1.    ФСЛИ в неоплазме на 20-е сутки после трансплантации РШМ-5 повышает уровень функциональной активности системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты». На 30-е сутки после трансплантации РШМ-5 опухоли ФСЛИ стимулирует в неоплазме оксидативный стресс.

• 2.    Под влиянием ФСЛИ в опухолевой ткани РШМ-5 возрастает объем участков некроза при одновременном снижении удельного объема паренхимы, митотического и апоптотического индексов.

Работа выполнена при поддержке грантов гос-задания Минобрнауки РФ и гранта Президента РФ.

Таблица 4. Морфологические показатели опухолевой ткани при РШМ-5 мышей

Группа Показатели	20-е сутки роста РШМ			30-е сутки роста РШМ
	Без облучения	Э сред .=2,4 Дж/см2	Э сред .=3,6 Дж/см2	Без облучения	Э =2 4 сред. , Дж/см2	Э сред .=3,6 Дж/см2
Удельный объем опухолевой паренхимы (%)	76,81±2,01	57,39±0,41*	53,59±3,73*	65,34±2,78	41,22±3,22*	56,02±5,34*
Удельный объем опухолевой стромы (%)	1,21±0,16	0,49±0,04*	0,25±0,01*	0,2±0,036	0,38±0,01*	0,50±0,21*
Удельный объем участков некроза (%)	21,99±2,05	42,12±0,37*	46,17±3,73*	34,64±2,76	58,41±3,22*	43,50±5,14*
Митотический индекс, (‰)	18,00±1,40	15,63±5,63	9,38±3,13*	18,00±3,18	6,25±2,50*	5,00±0,01*
Апоптотический индекс, (‰)	87,00±3,76	33,75±6,25*	23,13±1,88*	67,00±4,25	26,25±10,00*	23,13±1,88*

Примечание: * - данные, значимо отличающиеся от показателей без облучения

Рис. 2. Опухоль РШМ-5 до и после воздействия ФСЛИ на разные сутки после трансплантации опухоли. Окраска гематоксилин-эозином. Микрофото х100