Регенерация кровеносного сосуда на основе графта из поликапролактона в экспериментальном исследовании

Традиционным способом лечения заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и периферических артерий, является хирургическое вмешательство с имплантацией биологических или синтетических протезов [1]. В качестве “золотого стандарта” для проведения данных операций используют аутотрансплантаты, такие как подкожная вена, а также грудная и лучевая артерии. Однако применение аутологичных вен и артерий в большинстве случаев приводит к повторным опе- рациям, связанным с деструктивными изменениями и окклюзией шунтов. Кроме того, около 30% пациентов не обладают подходящими для трансплантации венами или артериями в результате уже перенесенных операций либо других заболеваний [2].

Существует несколько подходов к созданию альтернативных сосудистых графтов малого диаметра. Первый подход основан на использовании синтетических полимеров. Наиболее известными являются трансплантаты из полиэтилентерефталата (polyethylene terephthalate, PET

– Dacron) и политетрафторэтилена (polytetrafluoroethylene, ePTFE – Teflon) [3]. Однако данные графты не эффективны в реконструкции артерий малого диаметра (<5 мм) в результате низкой скорости кровотока, что приводит к тромбозу и гиперплазии неоинтимы в зоне анастомоза [4].

Существенные успехи были достигнуты в тканевой инженерии кровеносных сосудов с использованием биодеградируемых природных и синтетических полимеров [5]. Графты, изготовленные из природных полимеров, наиболее биосовместимы, а также способны поддерживать прикрепление клеток, их рост, дифференцировку и жизнеспособность [5, 6]. Тем не менее, данные материалы имеют недостатки, связанные с невозможностью контролировать их деградацию, а также с недостаточной прочностью и эластичностью [6].

Одним из перспективных синтетических полимеров для изготовления сосудистых графтов является поликапролактон (polycaprolactone, PCL), поскольку он обладает высокой прочностью и эластичностью, медленной скоростью биодеградации и хорошей биосовместимостью [7–9]. Ранее нами были получены результаты по имплантации PCL графтов в брюшную часть аорты крыс сроком на 6 недель, свидетельствующие о проходимости графтов и клеточной инфильтрации его стенок [10]. Тем не менее, интерес вызывает функционирование сосудистого PCL графта в долгосрочных исследованиях. Цель исследования: изучение особенностей регенерации кровеносного сосуда в разные сроки имплантации графта в кровеносное русло в эксперименте на животных.

Материал и методы

Изготовление графтов. Сосудистые графты диаметром 2 мм изготавливали методом электроспиннинга на приборе Nanon-01A (MECC CO, Япония) из 14%-го раствора PCL, M=80000 (Sigma-Aldrich Co. LLC, США) в хлороформе при подаваемом напряжении 15 кВ и скорости подачи раствора – 0,5 мл/ч, расстоянии до коллектора – 15 см, в качестве коллектора использовали вращающиеся штифты диаметром 2 мм.

Оценка поверхности графтов. Образцы PCL графтов (0,5х0,5 мм) покрывали золотым токопроводящим напылением толщиной в 30 нм и изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония). Размер волокон и пор, а также пористость материала определяли с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health, США).

Механические свойства графтов. Исследование осуществляли с использованием универсальной испытательной машины “Zwick/roell”-2.5Н (Германия). Прочность PCL графтов оценивали по максимальному напряжению при растяжении, упруго-деформативные свойства – по удлинению до нарушения целостности образца и модулю упругости.

Определение комплаентности стенки графта осуществляли на базе лаборатории NanoRegMed (Лондон, Англия) под руководством проф. А.M. Сейфалиана. Исследование проводили с помощью установки артериального пульсирующего потока с физиологическими параметра-

Таблица 1

Гемодинамические значения пульсирующего тока

Физические параметры	Переменная
Среднее давление (мм рт. ст.)*	30–90
Пульсовое давление (мм рт. ст.)	62
Частота пульсирующего цикла (Гц)	1
Средняя скорость потока (мл/мин)	100
Температура перфузата (°С)	37

Примечание: * – с шагом в 30 мм рт. ст.

ми. Для перфузии в установке применяли гепаринизированную (Heparin sodium, CP Pharmaceuticals Ltd., Англия) цельную кровь, смешанную с физиологическим раствором (Baxter Healthcare Ltd., Англия) в соотношении 2:1. PCL графты диаметром 2 мм, длиной 50 мм (n=6) подвергали 3%-му продольному растяжению для воспроизведения характеристик in vivo . Диаметры просвета определяли посредством системы отслеживания движений сосудистой стенки (Pie Medical Wall Track Version 2, Pie Medical Systems, Нидерланды). Данные по гемодинамике представлены в таблице 1.

После сбора данных комплаентность (С) рассчитывали по формуле:

С (%mmHg–1 x 10–2) = [(Ds – Dd) / Dd(Ps – Pd)] x 104, где P, D, s и d – давление, диаметр, систола и диастола соответственно.

В качестве контроля использовали синтетические сосудистые протезы Dacron и ePTFE, а также участки внутренних грудных артерий (A. thoracica interna) и подкожных вен (V. saphena), которые забирали при проведении операции аортокоронарного шунтирования у пациентов, подписавших Договор информированного согласия на забор биоматериала.

Имплантация in vivo. Сосудистые графты с внутренним диаметром 2 мм и длиной 10 мм после стерилизации этилен оксидом имплантировали в брюшную часть аорты крыс самцов линии Wistar массой 400–450 г (n=10). Животных вводили в наркоз 3%-м изофлураном, операцию проводили с ингаляционным наркозом 1,5%-го изофлурана. Графт имплантировали ниже почечной артерии и выше уровня бифуркации с использованием шовного материала 9-0. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания. Опыты проводили, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986).

Спустя 2 недели, 1 и 10 мес. зону анастомоза и сам PCL графт оценивали гистологически с окрашиванием гематоксилин-эозином и по Ван Гизону.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия считали статис- тически значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде среднее±стандартное отклонение (M±SD) и как медиана и 25 и 75-й процентили Мe (25; 75%).

Результаты и обсуждение

Характеристика поверхности графтов . Изготовленные PCL графты состояли из волокон и имели высокопористую структуру. Средний диаметр PCL волокон составил 2,05±0,69 мкм, средний диаметр пор – 23,58 мкм, пористость – 49,7%. Такая морфология способна имитировать структуры внеклеточного матрикса, состоящего из фибриллярных белков. Тонкие полимерные волокна обеспечивают б о льшую площадь доступной поверхности для взаимодействия, что способствует лучшему прикреплению клеток, а также обеспечивает транспорт питательных веществ и удаление продуктов метаболизма [11, 12].

Механические свойства. При изучении механических свойств PCL графтов было обнаружено, что их прочность в 2,7 раза ниже прочности нативных вен человека (табл. 2). При этом эластичность полимерного материала в 10 раз превышала эластичность кровеносных сосудов. Кроме того, PCL графты обладали большей жесткостью. При этом зависимость “напряжение – удлинение” для PCL графтов имела форму, характерную для многих других синтетических полимеров. Отличия кривой “напряжение – удлинение” для PCL графтов от данной зависимости для нативных сосудов обусловлены в первую очередь наличием в тканях коллагена, эластина и гликозаминогликанов, обеспечивающих основную часть механической прочности сосудов [13].

При изучении свойств артерий наблюдали экспоненциальное снижение комплаентности при повышении среднего давления (табл. 3). Графты Dancron и ePTFE демонстрировали среднюю комплаентность в 1,8–2% на мм рт. ст. *10–2, и этот параметр не изменялся значительно на всем диапазоне давления, что отличалось от компла-ентности артерий. Графты из PCL показали снижение комплаентности с увеличением среднего давления крови, но с очень высоким стандартным отклонением.

При деформации артерии не отвечают на давление линейным растяжением, и их комплаентность уменьшается при более высоком давлении. Данная особенность описана как анизотропия и не выявлена при физиологических условиях у доступных на сегодняшнее время сосудистых протезов [14]. Комп-лаентность графтов из PCL отличалась от комплаентности артерий. Однако их вязкоэластические свойства были более схожи со свойствами артерий в сравнении с протезами Dacron и ePTFE. Возможно, что при применении этих графтов в качестве трехмерного каркаса с инкорпорированием клеток их компла-ентность может быть более близкой к артериям в сравнении с экспериментами in vitro.

Ремоделирование PCL графтов. Через 2 недели после имплантации в 50% случаев было обнаружено образование пристеночного тромба в зоне анастомозов. Другая половина графтов не имела признаков тромбообразова-ния на внутренней поверхности. Подобная картина наблюдалась также через 1 и 10 мес. после имплантации. Тромбообразование в части имплантированных PCL графтов может быть обусловлено несовпадением диаметра протеза и нативной аорты, которое приводит к нарушению гемодинамики в данной области.

Важными характеристиками заживления сосудистого графта являются образование внутренней эндотелиальной выстилки и инфильтрация стенки трансплантата клетками. Признаки эндотелизации наблюдались уже через 2 недели после имплантации, чему, вероятно, способствовала пористая морфология внутренней поверхности графта. Также через месяц имплантации на внутренней поверхности графтов определяли частичное формирование неоинтимы, которая представляла собой тонкую выстилку.

Высокопористая структура PCL графтов способствовала проникновению клеток в их стенки. Так, через 2 недели отмечали слабую клеточную инфильтрацию в стенке имплантированного графта, представленную преимущественно макрофагами и фибробластами. К 1-му мес. исследования клетки проникали на 2/3 толщины графта. Через 10 мес. имплантации клетки располагались по всей толщине графта и активно формировали внеклеточный матрикс, о чем свидетельствовали волокна коллагена в стенке протеза. На наружной поверхности имплантатов наблюдали реакцию на инородное тело с образованием гигантских многоядерных клеток, а также волокон соединительной ткани. К 10-му мес. данная реакция на инородное тело уменьшалась.

В проведенном исследовании низкая скорость деградации PCL и активный синтез фибробластами внеклеточного вещества в графтах способствовали сохранению

Таблица 2

Сравнение механических свойств PCL графтов и нативной вены

Графт	Прочность, МПа	Относительное удлинение, %	Е mod , МПа
PCL	3,72 (3,35–4,51)*	779,92 (743,35–802,31)*	4,025 (3,52–5,71)*
Нативная v. saphena	10,09 (8,05–12,13)	73,1 (62,8–81,8)	1,37 (0,89–1,75)

Примечание: *p<0,05 – относительно нативной V. saphena.

Таблица 3

Комплаентность (C, процент на мм рт. ст. *10–2) PCL графтов в сравнении с комплаентностью подвздошных артерий и вены человека, графтов Dacron и ePTFE

С	PCL	A. thoracica interna	V. saphena	Dacron	ePTFE
С при 30 мм рт.ст.	6,1±5,2	18,3±12,8	24,2±13,1	1,9±0,8	1,8±0,5
С при 60 мм рт.ст.	4,7±3,6	8,9±7,3	3,4±0,9	1,9±0,3	1,7±0,4
С при 90 мм рт.ст.	2,8±2,1	3,5±1,1	2,1±1,0	1,8±1,0	0,8±0,2

целостности имплантата в условиях кровообращения на протяжении 10 мес.

Выводы

Исследование PCL графтов в физиологичных условиях путем имплантации в брюшную часть аорты крыс продемонстрировало их эндотелизацию и активную трансмуральную инфильтрацию клетками, синтезирующими внеклеточный матрикс. Данные процессы обеспечивали регенерацию тканей. Кроме того, сосудистые графты, изготовленные методом электроспиннинга, были способны выдерживать длительную механическую нагрузку, оказываемую током крови. Таким образом, PCL графты могут быть использованы в качестве основы для восстановления кровеносного сосуда in situ . Тем не менее, остается потребность в улучшении их проходимости, механических и вязкоэластических свойств.

Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00050) и проведено в Научно-исследовательском институте комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний.