Региональный аспект в изучении цитоэмбриологии растений

Т. Н. Гудошникова, кандидат биологических наук (Саранск),

В. И. Кудряшова, кандидат биологических наук (Саранск)

Региональный аспект в изучении животных, растений и представителей других царств живых организмов приобретает все большую актуальность.

Это определяется тем, что важно знать о разнообразии видов, обитающих в крае, особенностях жизнедеятельности представителей видов, различных взаимоотношениях между организмами и другими биологическими системами. Именно эти признаки определяют и поддерживают устойчивость и стабильность экологических систем региона. Вместе с тем многие виды животных и растений под влиянием экологических факторов сокращают свою численность в крае или исчезают совсем. Данное явление должно вызвать тревогу и бережное отношение к природе.

Интерес вызывает изучение влияния экологических условий на эмбриогенез растений. Цитоэмбриология растений изучает процессы, происходящие в цветке, развитие и строение макроспор и микроспор, мужского и женского гаметофитов, мужских и женских половых клеток — зиготы и эндосперма. Эти процессы тесно связаны друг с другом, поскольку их развитие начинается с одной единственной клетки. Кроме того, их изучение основано на применении одинаковой микроскопической методики. Дифференциация клеток и тканей, образование специализированных органов, выполняющих специализированные функции, происходят по мере развития цветка, семени и плода. Развитие растений, характеризующееся сменой i ядерных фаз, связано со сменой поколений (по-I левого и бесполого). В настоящее время эмбриологические исследования важны для преодоления нескрещиваемости, повышения фер- тильности гибридного потомства, оптимальных сроков опыления.

Цитоэмбриология растений имеет довольно богатую историю. Корни зарождения этой науки можно найти в глубокой древности. Вопросами размножения и пола растений интересовались со времен Аристотеля. Однако развитие эмбриологии начинается, когда техника микроскопирования значительно усовершенствовалась. Постепенно совершенствовался цитоэмбриологический метод исследования. Он помогает постичь сущность сложнейших и многообразнейших генетических процессов, связанных с размножением покрытосеменных растений, выявить зависимость их от условий внешней среды с самых ранних стадий развития. Установлено, что неблагоприятные внешние условия нарушают правильность течения эмбриональных процессов и могут приводить к понижению фертильности.

Объектами наших исследований являлись генотипически различные образцы люпина узколистного и люпина желтого. Люпин относится к семейству бобовых, и его род в настоящее время имеет свыше тысячи видовых названий. В отличие от традиционных районов возделывания люпина, в пределах Мордовии климат характеризуется непостоянством и контрастностью. Республика находится вблизи засушливого юго-востока, где нередко отмечается острый дефицит влаги. Осадки выпадают неравномерно.

Для цитоэмбриологического анализа фиксируют цветки люпина на ранних стадиях бутонизации. Для этой цели используют фиксатор Карнуа, приготовленный в соотношении: 1 часть уксусной кислоты, 3 части хлорофор-

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2007 | № 4

ма и 6 частей этилового спирта. Этот фиксатор обладает способностью проникать в ткани объекта и потому особенно удобен для фиксации объемистого эмбриологического материала (бутоны, завязи, семяпочки, части семени, пыльники}. В состав большинства фиксаторов входят многие токсические вещества, которые могут повлиять на структуру объекта. Кроме того, многие из компонентов фиксирующих жидкостей могут вызвать мацерацию или излишнее уплотнение тканей. Во избежание подобных воздействий бутоны промывают спиртом. Для этого материал проводится через три смены 96 % спирта (по несколько часов в каждой} и переносится в 100 % спирт для дальнейшей проводки. Конечным этапом обработки зафиксированного материала, предназначенного для изготовления постоянных эмбриологических препаратов, является его резка на микротоме, для чего он должен быть заключен в подходящую для этого плотную среду. Наиболее распространенным и универсальным является парафин. Заключение в парафин проводится в три этапа. Помещение фиксированного материала в растворитель парафина и парафин называют проводкой. Сложность проводки состоит в том, что перемещение материала из одной среды в другую должно происходить постепенно, без резкой смены ее состава и концентрации. В противном случае может Ьытг ПОШП т то и О ЛТП1П/Т1тП V ГТ СТТСТ V II TV -1 Т Т СТ 1J j4ttjv_ vuiiu I 1-р.у j miCl 164 V I pj- 64 1 J у Ы 1VLC1VI\ ГЛ iJWliCr, ср r 16V сированного материала. При перенесении материала из одной жидкости в другую надо следить, чтобы он не находился долго на воздухе и не подсыхал, отчего может нарушиться структура. После этого фиксированный материал переносят в тигелек или фарфоровую чашку с налитым в нее чистым растворителем, затем к растворителю добавляют чистый парафин. Тигелек закрывают крышкой и помещают в термостат, установленный на 56 °C, т. е. на температуру плавления парафина. После суток пребывания материала в термостате, когда расплавившийся парафин хорошо пропитывает объект, крышки с тигельком снимают и держат материал в термостате до тех пор, пока не испарится дочиста растворитель. Обычно на это требуется 2 — 4 суток. Если удаление растворителя задерживается, можно осторожно слить парафин, в котором находится материал, и заменить его свежим. Свободный от растворителя парафин с материалом разливают в за ранее приготовленные небольшие плоские коробочки из пергамента или плотной бумаги, размером примерно 2 х 3 х 1 см. Материал равномерно распределяют иголкой по дну коробочки. Этикетку укладывают поверх застывшего парафина. По остывании плиточки с материалом вынимают из коробочек и в таком виде хранят до подготовки парафинированного материала для резки. Монтирование парафинированного материала для резки на микротоме производится следующим образом: отдельные пыльники или семяпочки выплавляются из парафиновой плиточки, разогретой препаровальной иглой. Вместо этого можно растопить всю плиточку и извлечь оттуда нужный материал. После этого на одной из торцовых сторон кубика, покрытой слоем расплавленного и затем застывшего парафина, сделать небольшое возвышение (бугорок}. Парафин наносится каплями, падающими с умеренно нагреваемой над пламенем горелки или спиртовки парафиновой палочки. При этом надо следить, чтобы наносимый парафин хорошо слился с парафином, покрывающим кубик: в противном случае он может легко отколоться от него и отпасть при резке. После того как возвышение слегка затвердеет, в него надо вмонтировать приготовленный выплавленный материал. Для этого бутоны погружаются в парафиновый бугорок и постепенно покрывают каплями теплого пара-ЯтИЛЛСТ /„-, П 1Z1 HLIT) О ТЛТ»} 77 ТТ СТ 1 ГСТ ГТ СТ Т 111 1 СТ 1*1 nQTirtl \^ГШЦ yv^tilXtillVl 1464 IV L V / , Дд^кП J VI1V XXI 61 УГ1 р<ЛШ важно, чтобы материал был хорошо пропитан парафином: тогда он не будет крошиться. Имеет также значение температура воздуха, при которой происходит резка. Обычно нормальная комнатная температура бывает низка для того, чтобы парафин легко резался и срезы легко слипались, образуя ленту. Поэтому следует подогревать блок перед резкой, а также нож и блок во время резки, используя тепло близко поставленной лампы. Из различных сортов парафина следует предпочитать тот, который обладает низкой температурой плавления, особенно в случае обычных, не отличающихся особой твердостью объектов. Резка проводится на микротоме салазочного типа. С помощью микротома делают срезы толщиной 7 — 10 мк для приготовления микропрепаратов. При нормальной резке нож должен быть поставлен перпендикулярно салазкам и направлению своего движения. Первым этапом при изготовлении микроскопического препарата является наклеива- ние парафиновой ленты на предметные стекла. Стекла, употребляемые для этой цели, должны быть прямыми и ровными, без царапин и идеально чистыми, без малейших следов жира. Стекла для наклеивания ленты вытирают досуха с обеих сторон, наносят каплю белка на сухую поверхность и тщательно растирают ее пальцем (мизинцем), чисто вымытым и протертым спиртом. После этого наносят на середину стекла несколько капель дистиллированной воды. Затем на поверхность воды наносят парафиновую ленту. Ее надо класть нижней стороной вниз, строго соблюдая очередность срезов. Препарат с расправленными и плотно уложенными срезами оставляют на сутки для окончательного высушивания и приклеивания срезов при комнатной температуре или лучше при 35 — 40 °C в термостате. Подготовленный описанным способом препарат для последующего окрашивания должен быть освобожден от парафина, окрашен и заключен в канадский бальзам. Всякая окраска микротомных препаратов, сделанных из парафинированного материала, начинается с освобождения их срезов от парафина и помещения в среду, одинаковую с растворителем краски — чаще всего спирт или воду. Гематоксилин Равица представляет собой водный раствор краски, протрава также представляет собой водный раствор железо-аммиачных квасцов. Удаление парафина производится погружением препаратов в его растворитель — ксилол. Для перехода к воде употребляют промежуточную среду в виде спирта. После окраски и промывки в воде срезы обычно заклеиваются канадским бальзамом. Микропрепараты подсушивают в термостате и смотрят под микроскопом. Для определения фертильности пыльцы фиксируют пыльники со зрелой пыльцой в фиксаторе Кар-нуа. Продолжительность фиксации колеблется от 30 мин до нескольких часов. Материал помещают и хранят в 80 % спирте. Из спирта пыльник переносят на предметное стекло, раздавливают и наносят каплю ацетокармина. Убрав лишние ткани, препарат накрывают покровным стеклом и осторожно подогревают на спиртовке. У фертильных пыльцевых зерен зернистая цитоплазма и спермин окрашены в густой карминно-красный цвет. Остальное содержимое фертильных пыльцевых зерен окрашивается в розовый цвет. Стерильные пыльцевые зерна почти не окрашиваются кармином или окрашиваются равномерно. Их содержимое часто отходит от оболочки и находится на разных этапах гибели. Спермиев в таких пыльцевых зернах нет. Указанные различия между фертильными пыльцевыми зернами нетрудно установить, если пыльца имеет тонкую экзину. Толстая экзина маскирует содержимое пыльцы. У многих культурных видов растений спермин образуются не в пыльце, а в пыльцевых трубках во время их прорастания в столбике. В таких случаях о фертильности пыльцевых зерен приходится судить относительно окрашивания их содержимого. В обычных для данного растения внешних условиях почти вся образующаяся в пыльниках пыльца является вполне нормальной и фертильной. Морфологически она выглядит более или менее однородной, однако однородность эта может быть лишь чисто внешней. Под влиянием неблагоприятных внешних условий (плохой погоды с чрезмерными понижениями или, наоборот, повышением температуры и влажности), под влиянием искусственного воздействия различными реагентами (высокой и низкой температуры, Х-лу-чами, наркотиками и другими химикатами) нормальное развитие и строение пыльцы могут более или менее нарушаться, что приводит к появлению стерильной пыльцы, характеризующейся деформацией и дегенерацией ядер, клеток и цитоплазмы. Стерильность в большинстве случаев связана с нарушением правильности течения мейоза при микроспорогенезе. Нарушение нормального течения мейоза выражается в образовании многоядерных археспо-риальных клеток из-за отсутствия цитокинеза; перемещении по цитоплазматическим каналам отдельных хромосом и целых ядер из одного микроспороцита в другой или из одной микроспоры в другую; ослаблении или отсутствии конъюгации хромосом; образовании уни-, три-, тетра-, и поливалентов наряду с бивалентами; неравномерном расхождении хромосом. При нарушенном течении мейоза нередко образуется ядро с диплоидным числом хромосом. Такие ядра возникают в результате выпадения мейоза и образования реституционных ядер. Сущность последнего явления заключается в том, что в анафазе первого деления мейоза хромосомы не расходятся к противоположным полюсам, а снова включаются в одну и ту же ядерную оболочку. При этом образуется реституционное ядро, которое обычно имеет непра- вильную форму и диплоидное число хромосом. В случае нарушения нормального течения развития пыльца выглядит морфологически крайне неоднородной и является разнокачественной: наряду с карликовой при этом встречается гигантская пыльца и всевозможные переходы между этими крайними пределами. Процент бесплодной пыльцы по отношению к нормальной обычно различен не только у разных растений, но и в разных пыльниках одного и того же растения, причем он может достигать значительной величины. Иногда вся пыльца оказывается бесплодной. В ряде случаев дегенерирует не только вся пыльца, но и пыльники, причем на месте тычинок могут появиться листочки. В таких случаях возникает полная мужская стерильность. Нормальное течение процессов опыления и оплодотворения, так же как и процессов развития пыльцы и зародышевого мешка, может быть нарушено под влиянием различных факторов. Эти нарушения обычно выражаются в замедленном прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок, и даже их полной остановке, в увеличении промежутка времени между опылением и оплодотворением, частичном или полном их выпадении, в потере жизнеспособности половых клеток, что связано с возникновением частичной или полной стерильности. В сухую и жаркую погоду процессы опыления и оплодотворения протекают неблагоприятных условиях {при отсутствии опылителей, при слишком крайних температурах и влажности) процессы опыления и оплодотворения могут вовсе не происходить, что повлечет за собой отсутствие образования семян. При воздействии пониженных температур на процесс оплодотворения прежде всего отмечается замедление, в некоторых случаях — остановка роста пыльцевых трубок и отсутствие оплодотворения. При нормальном развитии и строении женского гаметофита все зародышевые мешки, какого бы типа они ни были, являются вполне фертильными. Однако под влиянием различных воздействий: как естественных (неблагоприятной погоды с резким понижением или, наоборот, повышением температуры и влажности), так и искусственных (воздействием высокой и низкой температуры, различными химическими веществами, недостаток питания и т. д.), нормальный для данного вида ход образования и строения зароды- шевого мешка может нарушаться, что приводит к появлению стерильных зародышевых мешков, причем в одних случаях это связано с нарушениями правильности течения мейоза при мегаспорогенезе, а в других не связано с ними. Нарушения нормального хода мегаспорогенеза, обусловленные воздействием вышеперечисленных факторов, заключаются в том, что в мей-озе наряду с бивалентами образуются уни- и поливаленты, хромосомы неправильно отходят к полюсам, а некоторые из них остаются в цитоплазме клетки, в результате чего впоследствии образуются добавочные ядра разных размеров, иногда чрезвычайно маленькие (микро-нуклеусы). Микронуклеусы обнаружены как на разных фазах мегаспорогенеза, так и на разных стадиях развития зародышевого мешка при нарушениях нормального течения мейоза. Добавочные клетки мегаспор образуются крайне редко. Например, у растений, обычно имеющих четыре мегаспоры, может образоваться пять, шесть и даже восемь клеток мегаспор. В то же время может возникнуть меньшее, чем обычно, число мегаспор. Благодаря нарушению нормального течения мейоза при образовании мегаспор ядра зародышевого мешка имеют отклоняющееся от нормы число хромосом, меньшее или, наоборот, большее чем обычно для данного вида гаплоидного числа, а клетки мегаспор могут быть разной величины. Зародышевые ния мейоза, в дальнейшем могут уклоняться от нормального развития и строения (число ядер в них может быть больше или меньше для данного вида). Дифференциация и поляризация в них могут происходить ненормально или даже совсем отсутствовать, в результате чего яйцевой и антипоидальный аппараты у них образуются с иным, чем обычно, числом ядер и клеток. Если же ни яйцевого, ни антипоидально-го аппарата не образуется, все ядра в таком зародышевом мешке лежат рассеянно по всему мешку или все вместе посредине мешка, не обнаруживая тенденции к расположению по полюсам. Многие из вышеописанных аномалий в развитии и строении зародышевого мешка приводят к тому, что некоторые или все зародышевые мешки оказываются нежизнеспособными. Сначала они останавливаются в своем развитии, затем отмирают. Содержимое их при этом сжимается и разрушается. Иногда материнские клетки мегаспор дегенерируют до

; мейоза. Вместе с дегенерацией материнских ■ клеток макроспор и зародышевых мешков на : разных фазах развития дегенерируют семяпоч-) ки, что приводит к возникновению пустых смор-) щенных семян и, следовательно, к понижению или даже полной потере фертильности растений, у которых под влиянием тех или иных при-; чин произошли нарушения в нормальном раз-{ витии и строении зародышевого мешка. В тех | случаях, когда у растения наблюдается стериль-i ность, она затрагивает оба гаметофита — как | женский, так и мужской, либо один из них. : Женский гаметофит подвергается стерильно-| сти реже и в меньшей степени, чем мужской, j Это объясняется тем, что женский гаметофит ! более, чем мужской, защищен от воздействия I неблагоприятных внешних факторов, распола-| таясь внутри семяпочки и завязи, которые являются для него защитными органами. Развитие зародыша находится в тесной зависимости от воздействия внешних погодных и климатических условий. Различные неблагоприятные факторы нарушают нормальный ход про-

; цессов развития. При высокой или низкой тем-i пературе, недостаточном или обильном увлаж-! нении правильность течения эмбриогенеза S может быть нарушена, что приводит к частичной или полной стерильности. При неблагоп-. риятных внешних условиях нередки случаи i крайне замедленного, а иногда, наоборот, слиш-| ком ускоренного развития зародыша и дегене-■ рации его на разных стадиях развития. В одних случаях нуцеллус разрастается, становится многослойным, оболочки клеток уплотняются. По мере развития и уплотнения оболочек клеток нуцеллус изолирует зародыш и эндосперм от притока питательных веществ из ха-лазальной части семяпочки, и, не получая достаточного питания, зародыш и эндосперм останавливаются в развитии и постепенно отмирают. В других случаях нуцеллус не становится многослойным, оболочки его клеток не уп-’ лотняются, тем не менее зародыш и эндосперм недоразвиваются и дегенерируют на стадии ' небольшого числа клеток, так как из-за физиологической ослабленности не могут использовать ткань нуцеллуса в качестве питательного материала. В третьих случаях нуцеллус не ; разрастается, оболочки его клеток не уллотня-J ются, а зародыш благодаря ускоренному против ■ нормы и беспорядочному делению клеток при-| нимает вид бесформенной гипертрофирован-Г ной многоклеточной массы без признаков дифференциации на органы. Эндосперм при этом представлен небольшим числом клеток либо отсутствует.

В ходе эксперимента исследовали особенности развития и строения семяпочки и зародышевого мешка люпина желтого и люпина узколистного, что позволяет определить качество материнского растения как производителя плодов и семян. Микропрепараты изучали с помощью микроскопов Биолам — 1, МБР — 3, МБИ —- 6. При анализе препаратов по сортам люпина желтого были хорошо видны семяпочки, покрытые двумя интегументами. В момент заложения семяпочки прямые (в самых мелких бутонах), по мере развития они поворачиваются и изгибаются. На возникших бугорках семяпочек начинается наружная и внутренняя их дифференциация. С ростом центральной части семяпочки, называемой нуцеллу-сом, начинают развиваться наружный и внутренний покровы (интегументы). Наружный интегумент мошный, особенно в микропиллярной части. Внутренний развит слабее, представлен двумя-тремя слоями клеток. Граница между интегументами малозаметна. Микропиле, по-види-мому, образуется одним наружным интегументом, фуникулюс короткий, зародышевый мешок вытянут в длину, расширен в средней части и сужен к обоим концам, что указывает на его фертильность. На временных препаратах, приготовленных с применением ацетокармина, у люпина в завязи обнаружено от трех до пяти семяпочек. Семяпочки располагаются вдоль брюшного шва завязи. Наряду с крупными, встречались мелкие и недоразвитые семяпочки, в связи с чем морфологически разнородными оказались и семена. Количество семяпочек коррелирует с количеством образовавшихся семян в одном бобе, Это свидетельствует о нормальном ходе развития репродуктивных органов, так как резких отличий в количестве заложившихся семяпочек и образовавшихся семян не наблюдается, что обусловлено биологическими особенностями сортов.

При цитоэмбриологическом анализе материала по сортам люпина желтого наряду с семяпочками, развитыми без отклонений, были обнаружены семяпочки (на поздних стадиях развития) с одним интегументом. В результате недоразвития интегументов микропиллярная часть зародышевого мешка оказалась не заши- щенной покровными тканями семяпочки. Большая часть зародышевых мешков из таких семяпочек имеет какое-либо нарушение в структуре, следовательно, семяпочка является стерильной.

При исследовании микропрепаратов по сортам люпина узколистного обнаружены ранние семяпочки (в самых мелких бутонах), представляющие собой покрытый эпидермисом бугорок из меристематических клеток — будущий ну-целлус семяпочки, или фертильный мегаспорангий. На данной стадии семяпочка прямая. Затем (на более поздних стадиях развития) у основания бугорка закладываются образованные меристематическими клетками валики — будущие покровы (интегументы), обрастающие нуцеллус. У его вершины они оставляют канал — микропиле, через который пыльцевая трубка проникает внутрь семяпочки, а в дальнейшем — в зародышевый мешок (женский гаметофит). Граница между интегументами малозаметна. Микропиле образуется наружным интегументом. При исследовании микропрепаратов по сортам люпина узколистного встречались семяпочки, не имеющие зародышевых мешков в нуцедлусе. Безусловно, их можно охарактеризовать как остановившиеся в развитии. Не вызывает сомнения и аномальность семяпочек, содержащих зародышевые мешки очень маленьких размеров. При изучении «давленых препаратов» обнаружено, что в завязи люпина желтого среднее количество заложившихся семяпочек составляет четыре и коррелирует с количеством образовавшихся семян в одном бобе. Наибольшее количество семяпочек зафиксировано у люпина узколистного -—■ до шести. Соответственно, и семенная продуктив ность выше, что является важным критерием оценки адаптивности исследуемых сортов люпина.

Изучение эмбриональных структур мужской генеративной сферы испытываемых сортов люпина показало, что существенных различий в строении и развитии пыльников не наблюдалось. В зрелых пыльниках наряду с фертильной пыльцой содержалось некоторое количество стерильной пыльцы. Фертильность пыльцы в годы исследования составляла довольно постоянную величину. Средний показатель составил 85 %. Пыльник состоит из четырех микроспорангиев. Стенка пыльника представлена эпидермисом, двуслойным эпителием, средним слоем и тапетумом. В строении стенки существенных различий не обнаружено. Процесс микроспорогенеза у люпина происходит в пыльцевых гнездах. На более поздних стадиях развития, происходящих в пыльниках, ведущих к образованию мужского гаметофита, происходит отмирание тапетума и клеток среднего слоя. Ко времени созревания пыльцы стенка зрелого пыльника представлена эпидермисом и слоем эндотеция. Первое деление ядра микроспороцита приводит к образованию двух гаплоидных ядер, а второе — четырех ядер будущих микроспор. После деления микроспоры, находящейся еще в микроспорангии, идет образование мужского гаметофита, т. е. пыльцы. Изучение люпина показало, что пыльца имеет треугольную форму. Фертильность пыльцы в годы исследований составляла довольно постоянную величину. Контрастные колебания погодных условий по годам и в течение вегетационного периода не привели к полному угнетению роста и развития люпина.