Регуляция аутофагии увеличивает цитотоксичность темозоломида и индуцирует арест клеточного цикла на клеточных линиях меланомы in vitro



XX РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС • ПОСТЕРЫ

МЕЛАНОМА И ОПУХОЛИ КОЖИ

Регуляция аутофагии увеличивает цитотоксичность темозоломида и индуцирует арест клеточного цикла на клеточных линиях меланомы in vitro

Цель. Аутофагия – процесс утилизации клетками собственных органелл для сохранения жизнедеятельности – активирована во многих линиях меланомы человека. Ингибирование аутофагии является одним из перспективных направлений для повышения эффективности противоопухолевой химиотерапии больных меланомой. Целью нашей работы было изучение влияния ингибиторов аутофагии – хлорокина (CQ) и LY-294002 (LY) – на цитотоксическое действие темозоломида (TMZ), на клеточных линиях меланомы человека и исследование роли статуса гена B-RAF в клетках в эффективности комбинации TMZ с ингибиторами аутофагии.

Материалы и методы. Все эксперименты были проведены на клеточных линиях меланомы Mel MTP, Mel Z,

Mel IL, полученных от пациентов РОНЦ им. Н. Н. Блохина, с разным исходным статусом гена B-RAF. Эффективность совместного действия TMZ с CQ или LY определяли МТТ тестом. Количественным критерием цитотоксичности служил индекс IC50. Изменение экспрессии аутофагии под действием комбинированной терапии исследовали иммуноцитохимически и методом вестерн-блоттинга с использованием антител к маркеру аутофагии LC3B. Количество апоптотических клеток оценивали методом двойного окрашивания Аннексином V/7-ADD на клеточном анализаторе Muse Cell Analyzer (Merck Millipore). Клеточный цикл ана-лизировади методом проточной цитометрии. Статистическая обработка результатов 3 независимых экспериментов проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Статистически достоверным считались результаты с p<0.05.

Результаты. Из 3 исследованных клеточных линий меланомы 2 имели мутацию B-RAFV600 (Mel Z, Mel IL), а 1 была B-RAFWT (Mel MTP). В предварительных экспериментах была определена величина IC50 препаратов TMZ, CQ и LY для всех линий меланомы. Влияние ингибиторов аутофагии на цитотоксичность TMZ исследовали в условиях преинкубации клеток в течение 1 часа с максимально нетоксическим дозами CQ (20 мкМ) и LY (5 мкМ), выбрав нетоксическую концентрацию TMZ (100 мкМ). Показано, что оба ингибитора аутофагии усиливают действие TMZ, приводя к увеличению гибели меланомных клеток в среднем на 20% в равной степени как в случае наличия мутации B-RAFV600, так и при B-RAFWT. Исследование клеточной гибели показало, что в присутствии CQ количество апоптотических клеток увеличивалось лишь в случае B-RAFWT линии (6.2% vs 13.6%), но не изменялось для линий B-RAFV600 по сравнению с монотерапией TMZ. LY не влиял на апототическую гибель клеток. CQ синергично увеличивал TMZ-зависимый арест клеточного цикла, приводя к увеличению популяции G0/G1 в B-RAFV600 линиях, но не влиял на линию с диким типом гена. При ко-инкубации клеток с TMZ и LY, ингибитором PI3K, был показан аналогичный эффект. Было показано, что комбинированное действие TMZ и CQ или LY приводит к увеличению пунктата белка LC3B на аутофагосомах и повышенной экспрессии этого же маркера по сравнению препаратами в монорежимах.

Заключение. Мы изучили комбинационный эффект TMZ и LY или CQ. Преинкубация клеток меланомы с CQ или LY приводила к усилению их химиочувствительности к TMZ на клеточных линиях как B-RAFWT, так и B-RAFV600. Добавление LY и CQ в равной степени увеличивало G0/ G1 популяцию в мутантных клетках клетках, но не влияло на дикий тип. Поскольку уровень апоптотических клеток не изменялся, мы предположили, что клеточная гибель идет по пути аутофагии. Анализ активации аутофагии показал повышенную экспрессию маркеров аутофагии под действием комбинированной терапии клеток. Таким образом, аутофагия вовлечена в увеличение цитотоксичности TMZ при комбинации с CQ или LY. Процесс аутофагии является необходимым для поддержания клетками энергетического баланса и его инактивация на различных этапах может быть новой перспертивной мишенью в борьбе с меланомой. Работа поддержана грантом РНФ № 14–35–00107 от 17.09.2014