Регуляция лептином и грелином апоптоза CD4+-лимфоцитов in vitro

Пептидные гормоны – лептин и грелин, являются реципрокными регуляторами метаболизма жировой ткани, энергетического обмена и пищевого поведения организма человека [Tena-Sempere, 2007]. При беременности жировой обмен претерпевает существенные изменения, а уровень лептина и грелина в периферической крови меняется в зависимости от срока беременности [Hardie, Trayhurn, 1997; Fuglsang et al., 2005]. Оба гормона активно вырабатываются плацентой, тканями эмбриона и играют важную роль на всех этапах гестации, контролируя процессы имплантации, а также рост и развитие плода [Tena-Sempere, 2007]. Лептин является провоспалительным гормоном и способствует преобладанию клеточно-опосредованного иммунного ответа [Liu et al., 2011]. Грелин обладает противовоспалительными эффектами и оказывает антагонистическое действие по отношению к эффектам лептина [Annunziato et al., 2008]. Поэтому изучение роли этих гормонов в контроле иммунных реакций при беременности является актуальным.

Беременность сопровождается формированием состоянием толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду [Ширшев, 2009]. Согласно современным представлениям одним из значимых механизмов поддержания иммунологической толерантности при беременности является сдвиг баланса регуляторных субпопуляций IL-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17)/Т-регу-ляторных лимфоцитов (Treg) в сторону увеличения Treg, обладающих иммуносупрессорной активностью [Heikkinen et al., 2004]. В наших исследованиях было показано, что лептин и грелин в концен- апоптоз.

трациях, характерных для беременности, разно-направлено регулируют баланс Тreg/Th17 [Орлова, 2011, 2012]. Известно, что апоптоз является ведущим факторов контроля активации и регуляции числа клеток. Ранее в наших исследованиях показано, что лептин и грелин оппозитно контролируют апоптоз лимфоцитов периферической крови при беременности [Орлова, Ширшев, 2010]. Наивные CD4⁺-лимфоциты периферической крови, из которых дифференцируются Тreg и Th17, экспрессируют рецепторы как к лептину [Liu et al., 2 011], так и к грелину [Fuglsang et al., 2005]. Поэтому важно оценить влияние этих гормонов на апоптоз CD4⁺-лимфоцитов периферической крови как на возможный механизм регуляции лептином и гре-лином баланса Тreg/Th17.

Цель работы – изучить влияние лептина и гре-лина, а также их совместные эффекты в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на апоптоз CD4⁺-лимфоцитов в системе in vitro .

Материалы и методы

В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови здоровых женщин репродуктивного возраста, находящихся в ранней фолликулярной фазе менструального цикла (4–7 день). Суспензию монону-клеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3). Далее методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T cell Kit; Invitrogen) из суспензии мононуклеаров выделяли CD4+-лимфоциты, CD4+CD25bright (Т-регуляторные клетки) и неактиви-

рованные Т-хелперы (CD4+CD25—лимфоциты). Чистота выделения оценивалась методом проточной цитометрии и была 90% и более.

Далее полученные субпопуляции клеток инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (10⁵кл/мл - 5 г 10⁶/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 г 10^-5М2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение суток при 37^С в условиях 5% СО 2 с гормонами. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в концентрации 35 нг/мл, что отражает его концентрацию в периферической крови при беременности [Hardie, Trayhurn, 1997]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрации 0.83 нг/мл, сопоставимой с уровнем гормона в периферической крови при беременности [Fuglsang et al., 2005]. Для исследования совместных эффектов лептин и грелин в культуры вносили одномоментно. В контрольные пробы вместо гормона добавляли физиологический раствор, используемый для растворения гормонов.

Для индукции апоптоза в культуры добавляли магнитные частицы с нанесенными анти-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen»), имитирующими активацию лимфоцитов при контакте с антигенпрезентирующими клетками.

После 24 ч. инкубации с гормонами снимали супернатант, удаляли магнитные частицы и оценивали апоптоз путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC) с использованием набора Annexin V – FITC Kit (IMMUNOTECH, France) методом проточной цитометрии («Becton Dickinson», США).

При учете результатов подсчитывали не менее 100000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Excell». При этом вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стандартную ошибку. Поскольку выборочное распределение данных, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали по парному t-критерию Стьюдента при р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что лептин и грелин в дозах, характерных для беременности, не оказывают значимых эффектов на апоптоз общей популяции CD4+-лимфоцитов периферической крови, активированных через Т-клеточный рецептор и CD28 (табл. 1).

Субпопуляция CD4+-лимфоцитов периферической крови помимо остальных типов клеток включает предшественников индуцибельных Тreg, а также натуральные Тreg (CD4+25bright), формирование которых происходит в тимусе [Dons et al., 2012]. Поэтому далее оценили влияние гормонов на апоптоз натуральных Тreg (CD4+25bright) и неактивированных Т-хелперов (CD4+25-лимфоциты), которые способны трансформироваться в индуци-бельные (адаптивные) Тreg [Dons et al., 2012].

Таблица 1 Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+-лимфоцитов in vitro (n=5)
Гормональное воздействие	CD4+AnV+- лимфоциты, %
Контроль	38.77±7.8
Лептин (35 нг/мл)	55.15±9.5
Грелин (0.83 нг/мл)	55.21±17.13
Лептин (35 нг/мл) +	49.45±18.24
Грелин (0.83 нг/мл)

Показано, что лептин в дозе, характерной для беременности, угнетает, а грелин не влияет на апоптоз CD4+25-лимфоцитов периферической крови (табл. 2). Однако при совместном внесении лептин и грелин снижают количество Т-хелперов (CD4+25-лимфоциты), вступивших в апоптоз, т.е. реализуются, главным образом, эффекты лептина. Учитывая результаты ранее проведенных исследований, где показано, что лептин усиливает генерацию Th17 из наивных CD4+-позитивных лимфоцитов периферической крови и угнетает формирование индуцибельных Treg, можно полагать, что ан-тиапоптотический эффект лептина в отношении как CD4+25-- лимфоцитов, так и общей популяции лимфоцитов периферической крови объясняется общей провоспалительной направленностью эффектов гормона. Однако, препятствуя апоптозу CD4+25--лимфоцитов, лептин, способствует сохранению предшественников индуцибельных Treg, что важно для поддержания беременности. Причем этот эффект преобладает и при совместном внесении лептина и грелина.

Таблица 2 Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+25--лимфоцитов in vitro (n=11)
Гормональное воздействие	CD4+25-AnV+ - лимфоциты, %
Контроль	12.19±3.25
Лептин (35 нг/мл)	8.54±2.47*
Грелин (0.83 нг/мл)	11.88±2.44
Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0.83 нг/мл)	8.78±1.51*
Примечание. Здесь и в табл. 3 -* - различия достоверны (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.

При анализе влияния лептина и грелина на апоптоз натуральных Treg периферической крови, установлено, что лептин и грелин в дозах, характерных для беременности, не оказывают значимых самостоятельных эффектов на апоптоз CD4+25bright

–лимфоцитов (табл. 3). Результатом совместного действия лептина и грелина в сочетаниях, характерных для беременности, является снижение числа натуральных Treg, вступивших в апоптоз.

Таблица 3

Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4⁺25^bright-лимфоцитов in vitro (n=6)

Гормональное воздействие	CD4+25brightAnV+- лимфоциты, %
Контроль	34.83±7.08
Лептин (35 нг/мл)	33.42±12.28
Грелин (0.83 нг/мл)	31.55±12.26
Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0.83 нг/мл)	20.46±4.77*

Суммируя полученные результаты, можно полагать, что при беременности, регуляция лептином и грелином апоптоза CD4+-лимфоцитов периферической крови является важным механизмом гормонального контроля баланса Th17/ Treg. Так, хотя при беременности лептин и угнетает формирование индуцибельных Treg [Орлова, 2011], но регулируя апоптоз, гормон способствует сохранению их предшественников, не влияя на уровень натуральных Treg периферической крови. Грелин, напротив, усиливает формирование адаптивных Treg [Орлова, 2011], но при этом не влияет на апоптоз CD4+25--лимфоцитов и натуральных Treg в периферической крови. Тогда как, действуя совместно, что ближе отражает физиологические условия беременности, лептин и грелин способствуют сохранению пула как адаптивных, так и натуральных Treg периферической крови. Таким образом, исследуемые гормоны играют значимую роль в поддержании периферической толерантности и сохранении беременности.

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1017.