Результаты анализа полногеномных ассоциаций недостатков экстерьера вымени у коров айрширской породы

В настоящее время актуальной задачей при идентификации наиболее релевантных признаков, описывающих внешние характеристики вымени, представляется определение генетических составляющих, вовлеченных в формирование молочного типа коров. Морфологические признаки и физиологические свойства вымени достаточно устойчиво наследуются потомством и, следовательно, посредством селекции ценных генотипов можно значительно увеличить число животных с оптимальными показателями формы вымени и равномерным развитием его четвертей, интенсивности молоковыведения, резистентности к заболеванию маститом и других параметров.

Общая оценка экстерьера, а также морфологических признаков вымени, позволяет выявлять физические отклонения или проблемы со здоровьем, контролировать общее состояние животного, включая признаки заболеваний, травм или дефицита питательных веществ. Своевременное выявление и исключение из селекционного процесса животных с выраженными недостатками телосложения и характеристиками молочной железы позволяет предотвратить накопление нежелательного сочетания генов в стадах и их распространение в породе (1).

Для поддержания высокой продуктивности и качества молока в молочном животноводстве крайне важен контроль за здоровьем вымени. Воспалительные заболевания, такие как мастит, могут серьезно нарушить секреторную функцию молочной железы. Особую опасность представляет субклинический мастит, который протекает без видимых признаков, что усложняет его своевременное обнаружение. Ранняя диагностика и профилактика этого заболевания остаются приоритетной задачей.

Одно из направлений работы по минимизации распространенности мастита в стадах — селекционная работа, направленная на отбор животных, обладающих индивидуальной генетической устойчивостью к заболеванию. В связи с этим актуален поиск генов-кандидатов, ассоциированных с резистентностью у молочного скота к маститу (2).

Оценка вымени у крупного рогатого скота обычно проводится после первого отела. Показатели экстерьера вымени служат важным источником информации для выявления параметров, определяющих устойчивость/вос-приимчивость к маститу, продолжительность продуктивного использования (3). Несмотря на то, что показатели экстерьера вымени могут варьировать в зависимости от породы, фенотипические данные, как правило, описывают общую форму молочной железы, морфологию и расположение сосков (4). Наследуемость таких признаков относительно невысока и колеблется от 0,14 до 0,42, при этом большинство признаков, связанных с морфологией молочных желез, коррелируют друг с другом (5).

В настоящее время в селекционной работе, которая направлена на дальнейшее улучшение молочного типа, существенное внимание уделяется характеристикам вымени и совершенствованию телосложения у молочного скота (6). Об этом свидетельствует тот факт, что в 19 странах, характеризующихся высокой молочной продуктивностью скота, удельный вес экстерьерных признаков в итоговых индексах племенной ценности составляет в среднем 15,2 %. В России, согласно действующему нормативному документу «Порядок и условия проведения бонитировки племенного крупного рогатого скота молочного и молочно-мясного направлений продуктивности», при итоговой оценке из максимальных 100 баллов за экстерьер корова может получить 15 баллов, то есть 15,0 % (7).

А.Ф. Контэ с соавт. (8) дали характеристику взаимосвязи между показателями оценки типа телосложения черно-пестрого скота и частотой возникновения недостатков экстерьера на основе анализа варианс и кова-рианс с использованием дисперсии. Была установлена достоверная связь недостатка «косое дно вымени» с прикреплением передних долей вымени (r = 0,409, p < 0,001), высотой задних долей вымени (r = 0,353, p < 0,001), глубиной вымени (r = 0,469, p < 0,001) и длиной передних долей вымени (r = 0,375, p < 0,001). Согласно Т.В. Шишкиной (9), у черно-пестрой породы наиболее часто встречаются наклонное дно вымени (17 %), асимметрия долей (16 %), сближенные соски (40 %), что подтверждает целесообразность сосредоточиться на изучении этих показателей.

В зарубежных исследованиях установлено, что косое дно вымени негативно влияет на качество доения (10). A.A. Saleh с соавт. (11), с помощью ступенчатой множественной регрессии выявили, что ширина и высота задних долей вымени могут быть использованы в качестве индикаторов для прогнозирования надоев молока и продолжительности лактации. R. Djedovi c с соавт. (12) установили генетические корреляции у голштинских коров между удоем и рядом линейных типовых признаков, которые варьировали от 0,02 с высотой прикрепления задних долей вымени до 0,28 между с передним прикреплением вымени. Отбор по оптимальной морфометрии вымени и сосков в племенных программах может способствовать снижению восприимчивости к интрамаммарным инфекциям у коров (13). Отбор производителей по предсказанной передающей способности и определение генетических корреляции между линейными оценками экстерьера и продуктивными признаками будет способствовать более эффективной селекции (14). С помощью четырех нелинейных моделей (Von Bertalanffy, Brody, Logistic и Gompertz) X. Zhang с соавт. (15) подобрали оптимальные кривые роста для создания метода ранней селекции буйволов с низким числом соматических клеток.

Геномные ассоциативные исследования (genome-wide association studies, GWAS) с использованием плотных однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP) (16) позволяют определить количественные локусы признаков (quantitative trait loci, QTL) для множества фенотипов, а последующая генная онтология дает понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе признаков конформации для выявления наиболее вероятных кандидатов в качестве генов (17).

Анализы, проведенные T. Tribout с соавт. (18) в популяциях коров голштинской, монбельярдской и нормандской пород, позволили подтвердить большое число генов и вариантов для раскрытия механизмов генетической детерминации, лежащих в основе признаков экстерьера и продуктивности коров. Например, QTL (rs436532576 на 88.723.742 п.н.), обнаруженный на BTA6, который влияет как на здоровье молочной железы (содержание соматических клеток), так и на морфологию вымени всех трех пород, находился рядом с QTL, ассоциированным с выходом молочного белка и его процентным содержанием в молоке.

Изучение полногеномных ассоциаций с результатами линейной оценки для айрширской породы крупного рогатого скота ранее не проводилось. Аналогичные исследования проведены для бурой швицкой породы (19, 20), а также для китайской (21) и чешской (22) голштинских популяций, однако в их задачи не входило изучение недостатков экстерьера. Ассоциации с морфологией молочных желез у крупного рогатого скота бурой швицкой породы были обнаружены на BTA 3, 5, 6, 7, 27 и 19, у чешской голштинской популяции с глубиной тела — на BTA 6, с качеством ног и копыт — на BTA 9, 10, 15 и 21, с признаками вымени — на BTA 2, 8, 10, 12, 24, 29. Следовательно, хотя молочная продуктивность служит основным приоритетом для всех пород молочного направления продуктивности, их характеристики имеют неодинаковую генетическую обусловленность, вызванную различиями в архитектуре генома (23). Также в работах зарубежных авторов выявлены наиболее значимые гены-кандидаты, связанные с балансом вымени и идентифицированные с помощью GWAS (SNP rs382921722 на участке 20 хромосомы) (18), и установлена связь с этим признаком для микросателлитного маркера TGLA126 на 20-й хромосоме (24).

Появляется необходимость поиска значимых локусов, связанных с качеством вымени, и в айрширской популяции, например, с недостатком экстерьера «косое дно вымени», который негативно влияет на технологическую пригодность, функционально-биологические показатели, долголетие, здоровье животных и качественные параметры состава молока (количество соматических клеток).

В настоящей работе впервые описаны результаты идентификации участков генома крупного рогатого скота айрширской породы, связанных с недостатками экстерьера вымени, проведена структурная и функциональная аннотация генов, локализованных в этих участках и обусловливающих формирование особенностей вымени коров.

Нашей целью было проведение полногеномного ассоциативного анализа (GWAS) для выявления позиционных кандидатных генов, связанных с формированием недостатков молочной железы у коров айрширской породы.

Методика. Материалом для исследования служили данные 669 гено-типированных коров ( Bos taurus taurus ) айрширской породы первого отела, полученные с использованием ДНК-чипов различной плотности, которые содержали 50 тыс. (BovineSNP50v2 BeadChip, «Illumina, Inc.», США) и 150 тыс. SNP (GGP Bovine 150K, «Neogen, Corp.», США). Генотипирование проводили с 2020 по 2025 год на базе ЦКП ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста и молекулярно-генетической лаборатории ООО «Мираторг Генетика» по стандартным методикам, рекомендованным компанией «Illumina, Inc.» (США). Контроль качества (QC) проводили с использованием программного обеспечения Plink (v1.90, Cambridge, MA, США) для удаления маркеров, которые не соответствовали заданным стандартам.

Данные ДНК-чипа для создания адаптивных файлов расширения (.ped, .map, .fam, .bed, .bim) редактировали с использованием программного обеспечения PLINK 1.9 с частотой минорного аллеля (MAF) ниже 5 % (maf 0,05).

Анализ GWAS для количественных признаков (непрерывных переменных) и качественных признаков (case-control, бинарных переменных) был проведен по следующей модели:

У = ®a/(GuT) + ^е, где σa — стандартное отклонение аддитивных генетических эффектов, f(x) — функция z-score, G — матрица генотипов, uT — транспонирование 1 х p (u — вектор генетических эффектов с элементами е {0,1}), Ge — стандартное отклонение остаточной ошибки, е — стандартная нормальная случайная величина.

Поправка по критерию Бонферрони была применена для установления уровней значимости для эффекта SNP при полногеномных ассоциациях и составляла 1,67319E - 06 (0,05/29883). Полиморфизмы, отклоняющиеся от равновесия по Харди-Вайнбергу, исключались из анализа при пороге 1,0E - 04. SNP, локализованные на половых хромосомах, также исключались из анализа. Манхэттенские и квантильно-квантильные (Q-Q) графики были созданы с использованием пакета CMplot в среде программирования R.

Индивидуальную экстерьерную оценку первотелок проводили сер- тифицированные бонитеры в соответствии с «Правилами оценки телосложения дочерей быков-производителей молочно-мясных пород» (СНПплем Р 10-96).

Учитывали следующие недостатки экстерьера вымени животных: AT (additiional teats) — дополнительные соски, TT (thin teats) — тонкие соски, UUF (unbalanced udder floor) — косое дно вымени, AfUL (atrophy udder lobes) — атрофия долей вымени, CRT (close rear teats) — сближенные задние соски, SU (small udder) — вымя малого объема. Выявленные недостатки экстерьера вымени дополнительно выводились посредством порогового значения по функции нормального кумулятивного распределения. Для автоматического запуска логистической регрессии случаи наличия недостатков экстерьера кодировали как 2, отсутствие недостатков — как 1.

Поиск генов по выявленным значимым полиморфизмам по результатам GWAS-анализа с 29883 SNP проводили с помощью общедоступного ресурса NCBI , сборка генома крупного рогатого скота Bos_taurus_UMD_3.1.1).

Общий поиск ассоциативных данных (аннотация) осуществляли с применением базы данных локусов количественных признаков крупного рогатого скота (Cattle QTLdb, , которая содержит QTL крупного рогатого скота и ассоциативные данные, отобранные из опубликованных источников.

Онтология генов была проанализирована с помощью инструмента DAVID Functional Annotation Bioinformatics .

Результаты. С использованием биоинформатического анализа для 29883 SNP был проведен поиск ассоциативных аннотаций с недостатками экстерьера вымени коров айрширской породы.

Значимые однонуклеотидные мутации, ассоциированные с недостатками экстерьера вымени, при их детекции находились внутри обозначенных генов. Был выявлен ряд значимых SNP на 1-й хромосоме с атрофией доли вымени (AfUL), на 2-й и 14-й хромосомах — с выменем малого объема (SU), на 8-й — со сближенностью задних сосков (CRT), на 25-й — с дополнительными сосками (AT), на 29-й — с косым дном вымени (UUF) (рис. 1, 2).

Квантильно-квантильные Q-Q-графики ожидаемых и наблюдаемых P-значений —log io , полученные в результате анализа GWAS, не показали существенной стратификации популяции, которая могла бы повлиять на текущий анализ. Графики Q-Q для моделей недостатков экстерьера вымени указывали на возможные ложноположительные результаты, поскольку многие SNP отклонялись от ожидаемой вероятности. Наибольшие совпадения с ожидаемой вероятностью, указывающие на наличие SNP с весьма значимым влиянием на эти признаки, наблюдались для AT и AfUL, что согласуется с данными S. Mucha с соавт. (25).

С наиболее часто встречающимся недостатком в популяции айр-ширских коров, дополнительными сосками, был ассоциирован ген XYLT1 , кодирущий фермент ксилозилтрансферазу 1, который играет ключевую роль в биосинтезе протеогликанов — важных компонентов внеклеточного матрикса, хрящевой и костной ткани (табл.). В исследованиях J. Wei с соавт. (26) ген XYLT1 также ассоциирован с числом сосков у свиней.

Рис. 1. Результаты анализа полногеномных ассоциаций для недостатков вымени у коров ( Bos taurus taurus ) айрширской породы первого отела: AT — дополнительные соски, TT — тонкие соски, UUF — косое дно вымени; слева — круговая диаграмма GWAS; справа — q-q (квантиль-квантиль) график распределения ожидаемых и наблюдаемых значений достоверности ассоциаций.

Тонкие соски были достоверно связаны с 5 SNP, локализованными на 9-й (2 SNP, p ≤ 2,651E-07…7,507E-07), 11-й (1 SNP, p ≤ 4,772E-08) и 15-й хромосомах (2 SNP, p ≤ 1,837E-07…3,93E-08). Ген TRAPPC3L — важный компонент клеточного транспорта, обеспечивающий правильное движение мембранных пузырьков и, как следствие, нормальное функционирование секреторного пути клетки. Мутации в гене TRAPPC3L ассоциированы с болезнью Шарко‑Мари‑Тута и спондилоэпифизарной дисплазией позднего типа. Ген FIG4 кодирует белок, регулирующий метаболизм фосфоинозитидов — ключевых молекул, участвующих в клеточном сигналинге и везикулярном транспорте, — был ассоциирован в исследованиях A. Neustaeter с соавт. (27) cо спастическим синдромом у голштинских коров. Механизм действия гена FAM178B изучается в контексте различных биологических процессов, включая клеточную адгезию и регуляцию массы тела. Этот ген кодирует внутриклеточный белок, значимый для нормального функционирования и дифференцировки ряда ключевых тканей, нарушения в которых могут приводить к развитию патологий. Ген ARRB1 кодирует цитозольный белок, член семейства аррестинов/бета-аррестинов, дисфункция которого связана с различными патологическими процессами, включая нарушения сигнальных путей, регулирующих клеточный рост и миграцию. Ген ANO3 кодирует белок аноктамин-3, член семейства аноктаминов (ANO), который функционирует как кальций-активируемый хлоридный канал (CaCC) и участвует в регуляции мышечного сокращения и расслабления. В ранее проведенных исследованиях найдена связь ANO3 с экстерьером бурого скота (28).

Рис. 2. Результаты анализа полногеномных ассоциаций для недостатков вымени у коров ( Bos taurus taurus ) айрширской породы первого отела: AfUL — атрофия доли вымени, CRT — сближенные задние соски, SU — вымя малого объема; слева — круговая диаграмма GWAS; справа — q-q (квантиль-квантиль) график распределения ожидаемых и наблюдаемых значений достоверности ассоциаций.

Выявленные SNP, ассоциированные с недостатками экстерьера вымени у коров (Bos taurus taurus) айрширской породы первого отела

Признак	Хромосома	Однонуклеотидный полиморфизм	p	п.н.	Начальная позиция гена	Конечная позиция гена	Нить ДНК	Название гена	Описание
AT	25	ARS-BFGL-NGS-34801	8,48E - 05	15963644	15820835	15992972	1	XYLT1	xylosyltransferase I [Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:15516]
TT	9	Hapmap25127-BTA-83222	7,507E - 07	34658951	34623078	34661582	1	TRAPPC3L	trafficking protein particle complex 3-like [Source:HGNC Sym-bol;Acc:HGNC:21090]
	9	Hapmap50250-BTA-118345	2,651E - 07	41036409	40873047	41046003	- 1	FIG4	Bos taurus FIG4 homolog, SAC1 lipid phosphatase domain containing (S. cerevisiae) (FIG4), mRNA. [Source:RefSeq mRNA;Acc:NM_001076014]
	11	UA-IFASA-3579	4,772E - 08	2877187	2798822	2907015	- 1	FAM178B	family with sequence similarity 178, member B [Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:28036]
	15	ARS-BFGL-NGS-5404	3,93E - 08	55307660	55255745	55329451	- 1	ARRB1	Bos taurus arrestin, beta 1 (ARRB1), mRNA. [Source:RefSeq mRNA;Acc:NM_174243]
	15	Hapmap50832-BTA-96262	1,837E - 07	58001797	57913544	58130615	1	ANO3	anoctamin 3 [Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:14004]
UUF	29	BTA-65139-no-rs	2,03E - 06	26438465	26390466	26444955	1	UEVLD	Bos taurus UEV and lactate/malate dehyrogenase domains (UEVLD), mRNA. [Source:RefSeq mRNA;Acc:NM_001098952]
AfUL	1	ARS-BFGL-NGS-75385	4,59E - 06	157176980	157169740	157261755	- 1	SATB1	Bos taurus SATB homeobox 1 (SATB1), mRNA. [Source:RefSeq mRNA;Acc:NM_001102040]
CRT	8	ARS-BFGL-NGS-53037	1,97E - 07	48297805	48223036	48303993	- 1	TMEM2	transmembrane protein 2 [Source:HGNC Sym-bol;Acc:HGNC:11869]
SU	2	ARS-BFGL-NGS-36683	8,72E - 07	95861435	95781394	95903310	- 1	KLF7	Bos taurus Kruppel-like factor 7 (ubiquitous) (KLF7), mRNA. [Source:RefSeq mRNA;Acc:NM_001192919]
	14	Hapmap54399-rs29020908	5,45E - 09	64298207	64169832	64308334	1	UBR5	ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5

[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:16806]

Примечание. AT — дополнительные соски, TT — тонкие соски, UUF — косое дно вымени, AfUL — атрофия доли вымени, CRT — сближенные задние соски, SU — вымя малого объема.

Ген UEVLD у крупного рогатого скота кодирует белок, который участвует в важных внутриклеточных процессах, связанных с транспортом и модификацией белков. В наших исследованиях он был аннотирован как ген-кандидат у животных с наличием косого дна вымени. A. Herrick с соавт. (29) выявили связь UEVLD с респираторными заболеваниями телок голштинской породы, N. Maddahi с соавт. (30) — с репродуктивными функциями голштинской породы Ирана.

Атрофия долей вымени была ассоциирована с геном SATB1 , кодирующим цитозольный белок семейства аррестинов, гиперэкспрессия которого связана с метастазированием при раке толстой кишки, молочной железы и других злокачественных опухолях. Также SATB1 играет роль в развитии и дифференцировке тканей, включая эпидермис и нейроны, участвует в пролиферации клеток и ингибировании апоптоза (запрограммированной клеточной смерти).

Ген TMEM2 в наших исследованиях оказался связан со сближенностью задних сосков, а ранее (31) был ассоциирован с метритами крупного рогатого скота. TMEM2 кодирует белок, который служит клеточной поверхностной гиалуронидазой и способствует эпителиально-мезенхимальному переходу и инвазии опухолевых клеток. Мутации TMEM2 ассоциированы с нарушениями развития скелета, а его гиперэкспрессия связана с метастазированием при раке молочной железы.

Полиморфизм в гене KLF7 , связанный с выменем малого объема, вовлечен в регуляцию клеточного цикла посредством активации ингибиторов циклин-зависимых киназ, таких как p21 и p27. Он участвует в дифференцировке адипоцитов (жировых клеток), кардиомиоцитов, остеоцитов и других типов клеток. В исследованиях F. Jahuey-Mart i nez с соавт. (32) и L. Ma с соавт. (33) KLF7 был ассоциирован с показателями роста крупного рогатого скота, в работе T. Melo с соавт. (34) — с половым созреванием коров. Ген UBR5 , также ассоциированный с SU, критически важен для нормального развития и жизнеспособности организма, нарушения функции которого могут приводить к задержке роста и развития. В работе N. Chung с соавт. (35) UBR5 был связан с развитием эмбрионов крупного рогатого скота.

Таким образом, выявленные гены-кандидаты, ассоциированные с недостатками экстерьера вымени у коров айрширской породы, прямым или косвенным образом влияющие на молочную продуктивность животных, могут быть использованы в геномной и маркер-ориентированной селекции, что подтверждают данные ряда зарубежных исследователей.

Итак, по результатам полногеномного ассоциативного анализа (GWAS), проведенного для 669 коров айрширской породы, наибольшее число однонуклеотидных полиморфизмов (5 SNP), сопряженных с недостатком вымени (тонкие соски), было выявлено на 9-й, 11-й и 15-й хромосомах в генах TRAPPC3L , FIG4 , FAM178B , ARRB1 , ANO3 . Два SNP, ассоциированных с выменем малого объема, обнаружены на 2-й и 14-й хромосомах. На 25-й, 29-й, 1-й и 8-й хромосомах выявлено по одному SNP, которые связаны соответственно с дополнительными сосками, косым дном вымени, атрофией долей вымени и сближенностью задних сосков. В рамках программы генетического улучшения молочного скота учет недостатков экстерьерных признаков выступает обязательным компонентом контроля популяции. Идентифицированные малоизученные гены-кандидаты, связанные с экстерьерными недостатками вымени айрширской породы коров, предоставляют возможность исследовать новые геномные области, влияющие на

фенотипическую экспрессию, что может способствовать прогрессивному совершенствованию функциональных характеристик вымени и, как следствие, увеличению долголетия.

Всероссийский НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал ФГБНУ Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 196601 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,