Результаты физико-химического анализа изменений химического состава слоевища Hypogymnia physodes (L.) Nyl. под воздействием солей тяжелых металлов

Для оценки состояния атмосферы все чаще используют информацию об изменении химического состава слоевища лишайников. При этом анализируют данные о содержании хлорофилла [16], лишайниковых кислот [10; 19], пигментов [13]. Проведено много исследований по накоплению лишайниками поллютантов, особенно металлов. Используют некоторые накипные ( Umbilicaria decussata (Vill.) Zahlbr.), листоватые ( Hypogymnia physodes (L.) Nyl. , Parmelia sulcata Taylor), а также кустистые лишайники ( Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf, Usnea hirta (L.) F.H. Wigg.) . Расширяется спектр физико-химических методов исследования лишайников. Например, в работе L.J.R. Boileau с соавторами [12] методом рентгенофлуоресцентного анализа исследовали образцы на содержание пяти металлов (Ti, Fe, Ni, Pb и U) в 109 лишайниках, собранных в окрестностях производства урана в Канаде. Тот же метод использовали для определения микроэлементного состава лишайника (Cu, Pb и Zn) [23]. Группой ученых из Польши для анализа 800 образцов лишайников был применен метод электронного парамагнитного резонанса [18]. Нейтронным анализом активации (INAA), а также электротермической атомно-адсорбционной спектроскопии. В 2007 г. L. Bergamaschi с соавторами [9] проанализировали 4 эпифитных лишайника Hypogymnia physodes, Parmelia sulcata, Pseudevernia furfuracea и Usnea hirta на содержание 29 элементов (Al, As, Br, Ca, Cd, Ce, Cl, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, Hg, I, K,

La, Mg, Mn, Ni, Pb, Rb, Sb, Sc, Se, Sm, Th, Ti, V, Zn). Для оценки наличия и содержания металлов в лишайниках часто применяется метод плазменной масс-спектрометрии, например в работе [11]. При этом предварительно авторы предлагают проводить микроволновое кислотное вываривание тканей лишайника при атмосферном давлении. Содержание Fe, Mn, Co, Cr, Zn и Cu в лишайниках было исследовано методом поглощательной спектроскопии [22]. В то же время в литературе недостаточно данные о ИК спектроскопических исследованиях химических изменений лишайников в результате воздушного загрязнения металлами.

В этой связи цель нашей работы – исследование возможностей, некоторых физико-химических методов оценки изменения химического состава слоевища Hypogymnia physodes в результате воздействия солей тяжелых металлов.

В качестве методов исследования были выбраны методы ИК спектроскопии в среднем (СИК) и дальнем (ДИК) диапазоне, а также рентгенофлуоресцентный анализ (РФА) и атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС). Выбор ИК спектроскопического метода в работе обусловлен тем, что средний ИК диапазон 400 – 4000 см-1 получил наибольшее применение при расшифровке химического строения органических соединений, реже при идентификации следов металлизации в биологических системах. Использование в нашей работе ДИК (10 – 400 см-1) определено неуклонным ростом интереса к данной области, поскольку с помощью этого метода можно получить ценную информацию о металлорганических соединениях [4]. Предпочтение РАФ и ААС отдано в связи с тем, что последние информативны, хорошо зарекомендовали себя при элементном анализе и наиболее часто применяются при оценке содержания металлов в природных объектах.

Материалы и методы исследования . Объектом исследования служили образцы индифферентного вида лишайника Hypogymnia physodes . 4 образца лишайника были собраны весной 2008 г. в экологически чистой зоне, расположенной в 60 км от г. Твери (окрестности дер. Ферязкино Калининского р-на Тверской обл.), которую можно считать фоновой [8]. Влажный образец 1 использовали в качестве контроля. Влажные образцы 2 – 4 опрыскивали в течение 5 дней 5% растворами сульфата ртути (II), цинка (II) и кадмия (II) (НgSO 4 , ZnSO 4 , СdSO 4 ) (табл. 1).

Спустя 5 дней, каждый образец лишайника (1 – 4) промывали 100 мл дистиллированной воды, затем сушили в сушильном шкафу при температуре 25 – 300С.

Таблица 1

№ образца	Экотоксиканты	Варианты анализы
		СИК	ДИК	РФА	ААС
1	-	+	+	+	+
2	НgSO 4	+	+	+	-
3	ZnSO 4	+	+	+	+
4	СdSO 4	+	+	+	+

Примечание. + – анализы проведены; - – анализы не проведены в связи с техническими ограничениями прибора.

Схема эксперимента

ИК спектры образов 1 – 4 получали в среднем (400 – 4000 см-1) и длинном ИК (100 – 400 см-1) диапазоне. Для записи спектров образцов в среднем ИК диапазоне использовали стандартную методику приготовления таблетки с бромидом калия (KBr) [7]. ИК спектры образцов записывали на Фурье-ИК спектрометре «Equinox 55» немецкой фирмы Bruker.

Для записи спектров образцов в длинном ИК диапазоне готовили таблетки из смеси образца со сверхвысокомолекулярным полиэтиленом (СВМПЭ) в соотношении 1:30. Толщина таблетки составляла 2 мм. ИК спектры в длинноволновом диапазоне записывали на спектрометре «FIS» японской фирмы Hitachi.

При интерпретации ИК спектров образцов лишайника ориентировались на основные зарубежные руководства [5; 14; 17; 20; 21]. Характер отнесения некоторых полос был уточнен в ходе наших экспериментальных исследований [1 – 3].

Кроме того, в отделе аналитических исследований центра коллективного пользования Санкт-Петербургского государственного горного института (ОАИ ЦКП СПбГГИ) на содержание тяжелых металлов РФА и ААС были проанализированы образцы 1 – 4. Определение цинка, кадмия и ртути в образцах 1 – 4 осуществляли с помощью последовательного волнодисперсионного рентгенофлуоресцентного спектрометра XRF-1800 японской фирмы Shimadzy. Для каждого анализа было взято 10 мг образца.

Определение цинка и кадмия в образцах лишайника было осуществлено методом ААС на приборе АА-6300 (Shimadzy). Предварительно каждую навеску образца массой 5 мг обрабатывали при нагревании смесью HNO 3 и H 2 O 2 . После растворения разводили до объема 100 мл, дополнительно разбавляли в 25 раз( 2/50).

Кроме изменений химического состава слоевища лишайника были оценены морфологические изменения – окраска, появление некротических пятен, усыхание лишайникового слоевища.

Таблица 2

Морфологические изменения слоевища Hypogymnia physodes в результате воздействия солей тяжелых металлов

Образцы, обработанные солями тяжелых металлов

Образец из фоновой зоны

экотоксикант, внешний вид слоевища

НgSO 4

признаки коричневый цвет, некротические пятна

ZnSO 4

бежевый цвет, некротические пятна, сильное усыхание, уменьшение толщины лопастей, поперечная исчерченность

СdSO 4

оливковый цвет, слабая поперечная исчерченность

Результаты эксперимента. Под воздействием различных солей тяжелых металлов в течение 5 дней в образцах 2 произошли морфологические изменения. Сравнение образцов 2 с контрольными, выявило наибольшие отклонения от нормы у лишайников, обработанных растворами сульфата цинка и ртути (табл. 2). Внешними симптомами цинковой интоксикации являются поперечная исчерченность, уменьшение толщины лопастей лишайника, а также побледнение. Последнее обусловлено уменьшением содержания пигментов, связанного с разрушением хлорофилла. Кроме того, известно, что ртуть индуцирует интенсивный выход калия при низких концентрациях (10-3 – 2М). Потери калия связаны с замещением калийных ионов ионами тяжелых металлов, при этом происходит нарушением мембранной целостности.

В отличие от действия солей ртути и цинка воздейчтвие интоксикации кадмием, по-видимому, незначительно. Об этом свидетельствуют слабо выраженные внешние изменения. Однако с учетом кумулятивного характера накопления лишайником металлов более длительное его экспонирование в растворах солей металлов приведет, по-видимому, к более значительным морфологическим изменениям.

Внешние изменения слоевищ лишайника, обработанных растворами солей тяжелых металлов, сопряжены с химическими изменениями. Так СИК, показал химические изменения в образцах 2 – 4, которые, в первую очередь, связаны с накоплением слоевищем лишайника экотоксикантов. При сравнении ИК спектра контрольного образца с ИК спектрами образцов 2 – 4 обнаружены полосы поглощения на частотах 1316 – ν a (SO 2 ), 781, 666 и 518 см^-1 – ν(S-O-C) (рис. 1 а, б, в). Их появление указывает на взаимодействие SO 4 ^2- – анионов присутствующих в растворах солей металлов с компонентами лишайника приводящего к образованию сульфонов (R-SO 2 R) [1; 2; 5]. Появление в сульфонов может происходить в результате следующей реакции:

C n H 2n+2 + OH-SO 2 -OH + C m H 2m+2 = 2HOH + C n H 2n+1 -SO 2 -C m H 2m+1.    (1)

Кроме того, в ИК спектре образца 3, обработанного водным раствором ZnSO 4 , обнаружено поглощение на частоте 470 см^-1 ν(С-Zn-C), возможно указывающее на поглощение лишайником катиона Zn (рис. 1б) [6]. Однако в длинноволновой области ИК спектра образца 3 ожидаемого изменения на частоте 144 см^-1 δ(С-Zn-C) не выявлено. Изменения, указывающие на поглощение лишайником других катионов металлов, в средневолновом диапазоне ИК спектра образцов 2, 4 не выявлены. В том числе, ожидаемое поглощение на частоте 515см^-1 ν(C-Hg-C) в образце 2, связанное с усвоением лишайником катиона ртути не обнаружили.

В длинноволновой области ИК спектра образцов, обработанных солями HgSO 4 и СdSO 4 , не были обнаружены ожидаемые полосы поглощения в диапазоне 100 – 400 см^-1, которые можно было бы считать характерными для ионов металлов (рис. 2 а, б, в). Ртуть и кадмий имеют большой молекулярный вес, их присутствие в лишайнике можно идентифицировать по наличию ИК полос поглощения в области колебаний 156 ν Cd-Cd, 515 ν(C-Hg-C) и 183 см^-1 δ(C-Hg-C) соответственно. Отсутствие в длинноволновой области ИК спектра образцов 2 – 4 полос поглощения отвечающих металлам, вероятно связано с низким содержанием металлов или их соединений в лишайниках. Или возможно, происходит наложение многочисленных полос, относящихся к функциональным группам разных компонентов лишайника, в том числе полос связанных с усвоением лишайником катионов металлов.

Наличие тяжелых металлов в лишайнике достоверно удалось определить другими методами – РФА и ААС. В спектре образца обработанного 5% раствором HgSO4, полученного РФА обнаружены 2 полосы при 30,1 и 35,85 мА (рис. 3а). В спектре образца 3 отмечены изменения, связанные с усвоением лишайником цинк-катиона – 37,5 и 40,65 мА (рис. 3б). На присутствие в лишайниковом слоевище кадмия указывает наличие полос при 13,5 и 15,3 мА (рис. 3в). Чрезвычайно высокая чувствительность метода ААС, также позволила подтвердить наличие цинка и кадмия в лишайнике.

Определение катионов тяжелых металлов в лишайнике связано с процессом их накопления из окружающей среды. Например, в образце 2, кроме ртути, обнаружен цинк. Известно, что цинк входит в состав многих ферментов, участвует в биосинтезе аминокислот, например триптофана. Однако, его содержание в образце 2 соответствует концентрации в фоновом образце и примерно в 80 раз ниже, чем в образце 3, который обрабатывался раствором ZnSO 4 . РФА образцов 2 – 4 позволил доказать высокое содержание в лишайнике цинка и ртути, в то время как количество кадмия существенно меньше. Значительное содержание цинка и ртути в слоевище сопряжено с морфологическими изменениями (табл. 2).

Таким образом, применение различных спектроскопических методов при исследовании изменений химического состава слоевища лишайника Hypogymnia physodes под воздействием солей тяжелых металлов позволило выявить возможности разных методов. Традиционная ААС обладает чрезвычайно высокой чувствительностью , имеет низкие пределы обнаружения элементов, малый расход пробного материала, позволяет с высокой степенью достоверности определить индивидуальные элементы, например кадмий, цинк. Однако использование метода ограничивает возможность определения только одного элемента.

Перспективный в экологических исследованиях многоэлементный способ, как РФА, позволил одновременно определить много химических элементов в образце, что в перспективе дает возможность проведения качественного обзорного элементного анализа. С помощью данного способа удалось идентифицировать накопленную лишайником ртуть, кадмий, цинк, в том числе присутствие в химическом составе меди, цинка не связанных с аккумулированием экотоксикантов . Тем не менее, как и в случае с ААС отсутствует информация о типе соединений в талломе лишайника, образуемом в результате накопления поллютанта и его взаимодействия с химическими компонентами лишайника, степени влияния поллютанта на химическую структуру лишайника. В этой связи, информативными могут являться сведения ИК спектроскопического анализа.

ИК спектроскопический анализ позволил определить основные тенденции изменения химического состава в слоевище лишайника, которые вызваны влиянием экотоксикантов. Удалось установить типы функциональных групп соединений, образовавшиеся в результате накопления и взаимодействия анионов солей (сульфоны, R-SO 2 R), предложить механизм их возможного образования. Интересным, однако, остается вопрос связанный с механизмом его взаимодействия с химическими компонентами лишайника, выяснение динамики, характера и степени влияния, образуемых в лишайнике соединений, прогноз состояния лишайника связанного с химической деструкцией слоевища.

0,8

0,8 а)

0,8 б)

в)

Поглощение

1800 1600  1400 1200 1000  800   600   4001800 1600  1400 1200 1000  800   600   400 1800 1600  1400 1200 1000  800   600   400

Волновое число, см

Рис. 1. ИК спектры поглощения образцов Hypogymnia physodes из фоновой зоны (спектр 1) и обработанных растворами солей тяжелых металлов: HgSO 4 (2, а), ZnSO 4 (3, б) и CdSO 4 (4, в) в среднем диапазоне длин волн

Волновое число, см-1

Рис. 2. ИК спектры поглощения образцов Hypogymnia physodes из фоновой зоны (спектр 1) и обработанных растворами солей тяжелых металлов: HgSO 4 (2, а), ZnSO 4 (3, б) и CdSO 4 (4, в) в дальней области длин волн

Рис. 3. РФА спектры образцов Hypogymnia physodes , обработанных растворами солей тяжелых металлов: HgSO 4 (а), ZnSO 4 (б) и CdSO 4 (в)

К сожалению, СИК оказался менее эффективен при обнаружении металлов в следовых количествах. В настоящей работе удалось только в одном ИК спектре образца выявить поглощение на частоте 470 см-1 ν(С-Zn-C), возможно указывающее на поглощение лишайником катиона Zn. Ожидаемое изменение в ИК спектра образца 2 на частоте 515 см-1 ν(C-Hg-C) не подтвердилось. По-видимому, гетерогенность химического состава лишайника, а также низкая интенсивность полос поглощения затрудняет интерпретацию спектра. Скорее всего, это относится и к длинноволновой области ИК спектра, где нам не удалось обнаружить полосы, связанные с накоплением тяжелых металлов. В дальнейшем целесообразно применять новые методы разделения, такие как экстракция и хроматография, которые облегчат исследования сложного химического состава слоевища, а комбинирование их с методами ИК спектроскопии дает новую информацию в мониторинговых исследованиях.

Таким образом, возможности методов спектроскопии – СИК, ДИК, РФА и ААС при анализе химических изменений лишайника в результате воздействия солей тяжелых металлов различны. Эффективными при оценке следов металлов в лишайниковом слоевище являются данные РФА и ААС. Однако эти методы не позволяют установить тип образуемого при накоплении поллютанта соединения, механизмы его образования, характер и уровень воздействия. Такую информацию можно получить при использовании ИК спектроскопии. Точная идентификация функциональных групп разных соединений при оценке содержания некоторых тяжелых металлов с помощью ИК спектроскопии мало эффективна.

P. 131 – 139.

RESULTS OF PHYSICAL AND CHEMICAL ANALYSIS OF CHEMICAL CHANGES IN A THALLUS OF HYPOGYMNIA PHYSODES (L.) NYL.

Analysis of chemical changes in lichen under the influence of heave metals’ salts НgSO 4 , ZnSO 4 , СdSO 4 has been carried out by various physical and chemical methods. It has been revealed, that data of X-Ray fluorescent and nuclear absorption spectroscopy is informative in evaluation of thallus metallization. Infrared microscopy allows to determine chemical changes in thallus, related to the accumulation of SO 4^2— anions and appearance of sulphons.