Результаты испытания набора реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ (тест-EGFR) для диагностики in vitro в клинической практике

В последнее десятилетие второй по распространенности причиной смертности, после сердечно-сосудистых заболеваний, стали онкологические болезни. Это связано с несколькими факторами, во-первых – с увеличением продолжительности жизни, во-вторых – с изменением доступности и качества методов диагностики. Однако наиболее доступные методы диагностики дают неоднозначные результаты [1, 3, 5].

В настоящее время выходят на первый план детекции мутаций методом ПЦР-РВ. Методы молекулярных тестов позволяют выявить наследственно обусловленные формы рака, вызванные мутациями, передающимися из поколения в поколение, обеспечить эффективное применение таргетных препаратов, увеличить эффективность и снизить себестоимость лечения [1, 2, 4, 5].

Компанией ООО «ТестГен» разработан набор реагентов, который предназначен для профессионального применения в медицинских организациях и клинико-диагностических лабораториях онкологического профиля для обследовании пациентов с диагнозом метастатический немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) III-IV стадии с целью качественного определения статуса мутаций L858R, T790M и делеции (del) в 19 экзоне гена EGFR методом ал-лель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе свободно циркулирующей ДНК, содержащей опухолевую ДНК, выделенной из плазмы крови, для определения показаний к таргетной терапии низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназы EGFR и мониторинга ответа на них.

Одним из первых методов определения соматических мутаций в гене EGFR было секвенирование по Сэнгеру, которое предполагало анализ всей кодирующей области. Однако этот метод имеет низкую чувствительность, поэтому были разработаны более чувствительные способы, основанные на прямом анализе мутаций и делеций гена EGFR. Современные методы анализа соматических мутаций представляют собой либо таргетноесеквенирование генов, либо полногеномное/полноэкзомноесеквенирование. Однако это дорогостоящие методы. Также следует отметить, что в молекулярно-генетических исследованиях используют преимущественно ДНК, выделенную непосредственно из опухолевой ткани, но при прогрессировании заболевания существуют трудности с получением материала для проведения ПЦР, поскольку опухоль часто является гетерогенной и имеет различные молекулярногенетические профили. Поэтому наиболее перспективным представляется определение содержания маркеров циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цДНК). За счёт лизиса опухолевых клеток количество цДНК в плазме увеличивается, особенно существенно это происходит на поздних стадиях заболевания.

Таким образом целью нашей работыявляется анализ результатов испытания набора реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ (Тест-EGFR) для внедрения его в клинико-лабораторную практику.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• -    изучить соответствие набора реагентов своему назначению;

• -    определить эффективность медицинского изделия для диагностики invitro в соответствии с предназначенным производителем применением медицинского изделия по назначению;

• -    определить качество набора реагентов, эффективность и безопасность его применения.

Материалы и методы. На базе ГАУЗ «Республиканского клинического онкологического диспансера МЗ РТ» в период с «05» июня 2017 г. по «10» июля 2017 были проведены клинические испытаниямедицинского изделиядля диагностики invitro«Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ (Тест-EGFR) по ТУ 9398-00497638376-2015 в исполнениях: 1) «Тест-EGFR-12» на 12 определений, 2) «Тест-EGFR-24» на 24 определения» производства ООО «ТестГен», в соответствии с Приказом Министерства Здравоохранения РФ от 9 января 2014 г. N 2н.

Набор реагентов «Тест-EGFR» рекомендуется пациентам с диагнозом метастатический немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) III-IV стадиидля определения показаний к таргетной терапии низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназы EGFR и мониторинга ответа на них.

Общее время проведения анализа составляет 2–2,5 ч.

Аналитические характеристики набора представлены таблице 1.

Таблица 1

Аналитические характеристики набора реагентов «Тест-EGFR»

Аналитическая специфичность	Специфичен по отношению к мутациям L858R, T790M и делеции (del) в 19 экзоне гена EGFR
Аналитическая чувствительность	1 копия гена EGFR в 1 мкл раствора ДНК
Диапазон определяемых концентраций ДНК	От 1 до 1000 копий гена EGFR в 1 мкл раствора ДНК
Результат теста, соответствующий норме	Отсутствие мутаций L858R, T790M и делеции (del) в 19 экзоне гена EGFR

В качестве субъектов клинического испытания было использовано 50 образцов свободно циркулирующей ДНК, выделенной из плазмы крови от пациентов с диагнозом метастатический немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) III-IV стадии, полученных из банка остаточных аликвот цельной плазмы крови в процессе рутинной лечебно-диагностической практики ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», достаточных по объемам и удовлетворяющие параметрам программы клинического испытания.

В 28 предоставленных образцах мутантная ДНК гена EGFR не была обнаружена и в 22 образцах – обнаружена. Статус мутаций гена EGFR был известен и установлен до проведения клинических испытаний регистрируемого набора реагентов в ходе лечебнодиагностического процесса с помощью зарегистрированного Набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца, производства «Киаген Манчестер Лимитед», Великобритания, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2012/12826 от 05.09.2012.

Каждый из 50 образцов подвергался анализу для установления статуса мутаций L858R, T790M и делеций (del) в 19 экзоне гена EGFR методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени.

Статус мутаций L858R, T790M и делеций (del) в 19 экзоне гена EGFR в образцах под номерами 1-12 был установлен с помощью исследуемых образцов наборов реагентов «Тест-EGFR-12» (LOT: 1704-350) и «Тест-EGFR-24» (LOT: 1704-355), в образцах под номерами 13–24 с помощью наборов реагентов «Тест-EGFR-12» (LOT: 1704-351) и «Тест-EGFR-24» (LOT: 1704-355), в образцах под номерами 25–36 с помощью наборов реагентов «Тест-EGFR-12» (LOT: 1704-352) и «Тест-EGFR-24» (LOT: 1704-356), в образцах под номерами 37–48 с помощью наборов реагентов «Тест-EGFR-12» (LOT: 1704-353) и «Тест-EGFR-24» (LOT: 1704-356), в образцах под номерами 49–50 с помощью наборов реагентов «Тест-EGFR-12» (LOT: 1704-354) и «Тест-EGFR-24» (LOT: 1704-357).

Для экстракции ДНК из плазмы крови использовали комплект реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала «АмплиПрайм МАГНО-сорб» по ТУ 9398-00409286667-2012, вариант 100–1000 для выделения ДНК из 100 проб (НекстБио, Россия), регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13824 от 18.09.2013.

Полученная ДНК должна храниться при температуре +4 °С и использоваться для анализа в течение 12 часов.

Определение статуса мутаций L858R, T790M и делеции (del) в 19 экзоне гена EGFR исследуемым набором реагентов «Тест-EGFR» в препарате нуклеиновых кислот (НК), полученном из клинического образца, методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включало в себя три этапа:

• 1)    ПЦР-амплификацию ДНК;

• 2)    гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится во время прохождения ПЦР;

• 3)    интерпретацию результатов.

С пробами ДНК были проведены реакции амплификации участков гена EGFR в реакционном буфере при помощи специфичных к этим участкам ДНК праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси для амплификации присутствуют аллель-специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые олиго-нуклеотидные зонды, которые гиб-ридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени и разрушаются Taq-полимеразой, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».

Для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» использовали ампли-фикатор планшетного типа «ДТпрайм» («ДНК – Технология», Россия).

Далее провели анализ кривых накопления флуоресцентного сигнала по одному каналу:

• –    по каналу FAM/Green в реакционной смеси Норма регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продуктов амплификации ДНК нормального варианта гена EGFR ;

• –    по каналу FAM/Green в реакционных смесях del , L858R , T790M регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продуктов амплификации ДНК мутантных вариантов гена EGFR иделеций в экзоне 19.

Полученные результаты интерпретировали на основании данных об уровне флуоресцентного сигнала относительно фона по соответствующим каналам для контрольных образцов и проб ДНК, выделенных из исследуемых образцов. Интерпретация производилась с помощью программного обеспечения используемого амплификатора «ДТпрайм» («ДНК – Технология», Россия).

После проведения анализа предоставленными образцами набора реагентов «Тест-EGFR» и интерпретации результатов, полученные данные сравнивались с результатами ПЦР, проведённых в ходе лечебно-диагностического процесса с помощью Набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца, производства «Киаген Манчестер Лимитед», Великобритания, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2012/12826 от 05.09.2012, по стандартной методике производителя. Свидетельством правильности работы исследуемых медицинских изделий было совпадение результатов.

Также проведен статистический анализ результатов исследования.

Результаты исследований. В 28 предоставленных образцах мутантная ДНК гена EGFR не была обнаружена и в 22 образцах – обнаружена. Статус мутаций гена EGFR был известен и установлен до проведения клинических испытаний регистрируемого медицинского изделия в ходе лечебно-диагностического процесса с помощью зарегистрированного Набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца, производства «Киаген Манчестер Лимитед», Великобритания, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2012/12826 от 05.09.2012.

Сводные результаты клинических испытаний представленных образцов медицинского изделия в сравнении с результатами ПЦР, проведенных с помощью зарегистрированного медицинского изделия, Набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца («Киаген Манчестер Лимитед», Великобритания, № ФСЗ 2012/12826 от 05.09.2012), приведены в таблице 2.

В ходе проведения клинических испытаний было проанализировано 50 образцов плазмы крови и был выявлен 1 ложноотрицательный результат. Это может быть связано с неверной пробоподготовкой на этапе выделения или хранения ДНК, неустойчивостью продуктов ПЦР и другими факторами.

Анализ и оценка результатов проведенных клинико-лабораторных испытаний медицинского изделия подтвердили соответствие качества медицинского изделия, эффективности и безопасности его применения. По результатам статистической обработки полученных характеристик эффективности диагностическая чувствительность исследуемого медицинского изделия составила 90,1 %, диагностическая специфичность 95,9 %, доля ложноотрицательных результатов 9,9 %.

Воспроизводимость результатов 100 %. В процессе испытаний наборы продемонстрировали высокую надежность.

Выводы. В результате проведенных клинических испытаний в форме клиниколабораторных испытаний установлено: «Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ (Тест-EGFR) по ТУ 9398-004-97638376-2015 в исполнениях: 1) «Тест-EGFR-12» на 12 определений, 2) «Тест-EGFR-24» на 24 определения», производства ООО «ТестГен» безопасен и клинически эффективен при использовании по назначению, установленному производителем.

• 1.    Результаты проведенных испытаний подтверждают эффективность и безопасность применения медицинского изделия «Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ (Тест-EGFR) по ТУ 9398-004-97638376-2015 в исполнениях: 1) «Тест-EGFR-12» на 12 определений, 2) «Тест-EGFR-24» на 24 определения», производства ООО «ТестГен».

• 2.    Изделие может применяться в медицинских учреждениях и клинико-диагностических лабораториях онкологического профиля. Область применения набора реагентов – клиническая лабораторная диагностика, онкология.

• 3.    Отклонения от алгоритма выполнения клинических испытаний отсутствовали.

В ходе клинических испытаний медицинского изделия были выявлены следующие достоинства:

• 1)    удобство при использовании: изделие представляет собой набор реагентов готовых к использованию;

• 2)    медицинское изделие позволяет проводить качественное определение статуса мутаций L858R, T790M и делеций (del) в 19 экзоне гена EGFR методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе свободно циркулирующей ДНК, содержащей опухолевую ДНК, выделенной из плазмы крови, с высокими показателями диагностической чувствительности (90,1 %) и диагностической специфичности (95,9 %). Доля ложноотрицательных результатов 9,9 %. Воспроизводимость результатов 100 %. В процессе испытаний наборы продемонстрировали высокую надежность.