Rhythmical changes of a level nitric oxide (NO) in roots etiolated seedlings of pea ( Pisum sativum L.) and influence of exogenous calcium

Активные формы азота (АФА) включают наименее изученных сторон. При изучении этого низкомолекулярные      соединения NO, вопроса основное внимание уделяется NO - пероксинитрит (ООNO-), N2O3, NO2-, NO-, NO+, молекуле-радикалу,    обладающей    широким NO2• - радикал и др. Роль АФА в процессах спектром биологического действия (Dmitriev, 2004). взаимодействия сигнальных систем одна из Следует заметить, что NO в растительных тканях может выполнять роль и метаболита, и сигнальной молекулы и токсичного соединения (Glyan’ko et al., 2009; Meilhos et al., 2011). Как метаболит она может участвовать в посттрансляционной модификации белков (S-нитрозилирование, металлонитрозилирование, тирозиннитрование c ООNO-); как сигнальная молекула – инициировать экспрессию генов; как токсическое вещество – вызывать совместно с АФК апоптоз клеток. В растениях NO выполняет функцию сигнальной молекулы и одного из важнейших компонентов защитной системы при действии стрессовых факторов (Kolupaev, Karpets, 2009). Анализируя литературные данные, можно прийти к заключению, что биохимическая генерация NO регулируется механизмом(ами), в котором(ых), по-видимому, задействован кальций. Известно, что NO контролирует гомеостаз ионов кальция (Са2+) в клетках организмов (Clementi, 1998) и почти все типы кальциевых каналов и транспортеров регулируются оксидом азота через S-нитрозилирование белков или с участием вторичных мессенджеров NO – циклических ГМФ (сGMP), АДФР (cADPR) и протеинкиназ (ПК) (Besson-Bard et al., 2008). Эндогенные и экзогенные источники NO активируют приток Са2+ в цитоплазму из внеклеточного пространства (Garcia-Mata et al., 2003; Lamotte et al., 2004). С другой стороны, увеличение концентрации цитозольного Са2+ под действием внешних факторов влияет на синтез NO, что ведет к усилению физиолого-биохимических процессов и каскаду сигнальных реакций, сопровождаемых экспрессией генов. Так, показана активация Са2+-кальмодулинзависимой киназы (ССаМК) ритмичными изменениями концентрации кальция в цитоплазме и органеллах, что сопровождается усилением генерации NO (Courtois et al., 2008). Оксид азота в свою очередь может влиять на кальциевые каналы путем S-нитрозилирования сенсора кальция кальмодулина (СаМ), что блокирует приток Са2+ в цитоплазму (Jeandroz et al., 2013). Исходя из этого, можно говорить о перекрестном и взаимном влиянии двух сигнальных соединений на процессы метаболизма, особенно при трансдукции абиотических и биотических сигналов (Jeandroz et al., 2013; Vandelle et al., 2006). Однако механизмы с помощью которых NO модулирует поток Са2+ в клетках до конца непонятны.

В данном случае, речь может идти об автоколебательных процессах в химических реакциях, когда эти колебания включаются в цепь взаимодействий между собой и регулируются, по-видимому, геномом (Detari, Karcagi, 1984). О тесном взаимодействии сигнальных молекул, в частности, Са²⁺, NO и Н 2 О 2 , в растительных клетках в литературе известно (Jeandroz et al ., 2013; Steinhorst, Kudla, 2013). Однако механизмы, управляющие этими взаимодействиями, до конца не выяснены. Наиболее изученными в этом плане являются механизмы колебаний (осцилляций) Са²⁺ в цитоплазме, образующиеся за счет притока этого элемента из внеклеточного пространства и внутриклеточных органелл и последующим его уменьшением (оттоком) из цитоплазмы (Denisenko,

Kuz’mina, 2013).

В задачу наших исследований входило изучение динамики уровня NO в корнях этиолированных проростков гороха с целью выяснения характера изменений NO в зависимости от экзогенного кальция и оценке генерации NO как автоколебательного процесса, зависимого от других процессов и регулируемого, вероятно, единым механизмом.

MATERIALS AND METHODS

Объектом исследований служили проростки гороха посевного ( Pisum sativum L.), сорт Ямальский, выращенные в пластмассовых кюветах на влажной фильтровальной бумаге при 22^оС. Перед замачиванием семена промывали теплой проточной водой с мылом и обеззараживали 3 % раствором перекиси водорода в течение 15 мин. После этого семена заливали прокипяченной водопроводной водой (60^оС) и помещали в термостат для прорастания при 22^оС в течение 48 ч. Для исследований отбирали однородные проростки с длиной корней 25-30 мм.

В экспериментах с действием экзогенного кальция опытные проростки экспонировали на растворе СаСl 2 в концентрации 100 мкМ. Обработку проростков кальцием и ЭГТА (100 мкМ) проводили перед началом опыта. Содержание NO в тканях корня определяли с использованием флуоресцентного зонда 4,5-диаминофлуоресцеин диацетата (DAF - 2DA). Это соединение проникает через клеточную мембрану и деацетилирует с помощью внутриклеточных эстераз в 4,5-диаминофлуоресцеин (DAF-2), который образует с

NO флуоресцирующее соединение – диаминотриазолфлуоресцеин триазол (DAF-2T) (Nakatsuboa et al., 1998). Перед окрашиванием исходные корни прединкубировали на соответствующих варианту опыта средах (Н 2 О, СаСl 2 , СаСl 2 +ЭГТА) в течение необходимого времени: 10, 20, 30 и так далее минут. Затем отрезки корней (участки 5 – 15 мм от апекса) инкубировали в среде для окрашивания, содержащей 10 мкM DAF-2DA и 10 мM трис-HCl (pH 7.4), в течение 20 мин на качалке, при 26^оС. Интенсивность флуоресценции оценивали на поперечных срезах (толщина 100 – 150 мкм) из окрашенных отрезков корней с использованием флуоресцентного микроскопа Axio Observer Zl (Германия) с цифровой монохромной камерой Axio Cam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений Axio Vision Rel.4.6. Блок фильтров № 10, длина волны возбуждения 450-490 нм, эмиссия 515-565 нм. Основное флуоресцентное свечение в срезах корней в наших опытах зафиксировано в эпидермальных клетках корня (Glyan’ko, 2013). Результаты анализа срезов корней представлены в относительных единицах интенсивности флуоресцентного свечения, выраженные в % от нулевой точки (0 мин), значение которой принималось за 100%.

Содержание общего кальция в корнях проростков определяли на атомно-абсорбционном спектрометре модели 403 фирмы Perkin Elmer (CША) в пламени ацетилен-воздух (Glyan’ko et al., 2013). Результаты представляют собой средние арифметические с указанием стандартной ошибки из трех независимых экспериментов. Число анализируемых срезов корней при микроскопических исследованиях не менее 10. Достоверность различий средних значений оценивали по t-критерию Стъюдента. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel.

RESULTS AND DISCUSSION

На рисунке 1 представлены кривые линии, характеризующие динамику уровня NO в течение 60 мин. В варианте «вода» четко прослеживаются ритмичность флуктуаций в содержании оксида азота: повышение через 10, 30, 50 мин и уменьшение через 20, 40 и 60 мин. Флуктуации в уровне NO наблюдаются и на фоне действия экзогенного источника кальция (100 мкМ СаСl2) (рис. 1). Однако временная зависимость флуктуаций уровня NO в этом случае иная: повышение уровня оксида азота через 20, 40, 60 мин, снижение – через 10, 30, 50 минут. Таким образом, экзогенный кальций влияет на содержание оксида азота, изменяя временную амплитуду его синтеза и сохраняя ритмичность флуктуаций. Надо полагать, что подобное влияние экзогенного кальция связано с увеличением апопластного и внутриклеточного Са2+. Об этом косвенно можно судить по содержанию общего кальция в корнях проростков спустя 60 мин. после начала экспозиции. Так, содержание общего кальция в корнях с 860±36 мкг/г сухого вещества в контроле увеличивается до 1043±28 мг/ г сухого вещества в варианте с экзогенным Са2+, что, по- видимому, может служить объяснением характера динамики флуктуаций NO в варианте с экзогенным кальцием. Опыт с экспозицией проростков на растворе СаСl2 + ЭГТА свидетельствует о нивелировании влияния экзогенного кальция на флуктуации уровня NO (рис. 1). Это, по-видимому, можно объяснить связыванием внеклеточного кальция ЭГТА.

Общий вывод, который можно сделать из полученных результатов состоит в том, что в краткосрочных опытах обнаружены ритмичные изменения уровня оксида азота и влияние на эти флуктуации ионов кальция. Можно предположить, что активация Са2+-каналов и стимуляция поступления ионов Са2+ в цитоплазму оказывает влияние на генерацию NO. Однако здесь необходимо заметить, что вопрос о путях синтеза NO в растениях остается до настоящего времени до конца нерешенным. С одной стороны бесспорно признается путь синтеза NO с участием цитозольной нитратредуктазы (НР), но функциональная связь между ионами кальция и активностью НР остается под вопросом (Courtois et al., 2008). Второй путь синтеза NO, связанный с использованием в качестве субстрата L-аргинина, подтвержден многочисленными исследованиями [Besson-Bard et al., 2008; Glyan’ko, 2013), но не доказан присутствием в растениях фермента идентичного NO-синтазе (NOS) млекопитающих, катализирующей окислительную реакцию синтеза NO из L-аргинина в животных клетках. Что же касается взаимосвязи между Ca2+ и генерацией NO по аргинин-зависимому пути, то имеются данные о необходимости ионов кальция в реакции, катализируемой предполагаемой растительной NO-синтазой (Vandelle et al., 2006). Зависимость активности конститутивной изоформы сNOS млекопитающих от кальмодулина и ионов Ca2+ (Bogdan, 2001) подтверждена также и в опытах с различными видами растений (Corpas et al., 2006). Предполагаются и другие источники генерации NO – с участием гидроксиламина, полиаминов, ксантиноксидоредуктазы, неэнзиматического пути и, возможно, другие (Freschi, 2013). Множество путей синтеза NO в растениях затрудняет определение основного из них. Можно предположить, что это будет зависеть от мест их локализации в клетках, тканях, органах. По данным Glyan’ko (2013) в этиолированных проростках гороха функционируют как НР-путь синтеза NO, так и L- аргинин зависимый путь.

NO играет специфическую роль в регуляции Cа2+-гомеостаза путем модуляции активности Са2+-каналов как на плазмалемме, так и на мембранах внутриклеточных органелл (Besson-Bard et al., 2008). Так, показана активация Са2+-кальмодулинзависимой киназы (ССаМК) изменениями концентрации кальция в цитоплазме и органеллах, что сопровождается усилением генерации NO (Courtois et al., 2008). Оксид азота в свою очередь может блокировать приток Са2+ в цитоплазму через кальциевые каналы путем S-нитрозилирования сенсора кальция кальмодулина (СаМ) (Jeandroz et al., 2013). Исходя из этого, можно говорить о перекрестном и взаимном влиянии двух сигнальных соединений на процессы метаболизма, особенно при трансдукции абиотических и биотических сигналов (Vandelle et al., 2006; Kolupaev, 2007; Besson-Bard et al., 2008a).

Накопление цитозольного NO будет вести к стимуляции процессов, оказывающих влияние на гомеостаз Ca²⁺ во внутриклеточных органеллах путем создания в цитоплазме кальциевых волн (осцилляций), составляющих звенья в трансдукции информации в геном (Medvedev, 2010; Jeandroz et al., 2013). Кальциевые волны осуществляются за счет мембранного транспорта, Са²⁺-АТФаз, киназ, белков-сенсоров (Tarchevsky, 2002). Действие NO на генерацию АФК, которые влияют на Са²⁺-каналы, может проявляться в ингибировании активности НАДФН-оксидазы за счет S-нитрозилирования цистеина (Cys890) фермента (Yun et al., 2011).

Необходимо отметить роль АФК (О2•-, Н2О2), основными продуцентами которых являются мембранная НАДФН-оксидаза и апопластная супероксиддисмутаза (Marino et al., 2012). АФК оказывают влияние, как и NO, на проницаемость Са2+-каналов, связывают оксид азота с образованием пероксинитрита (ООNO-), образуют положительную обратную связь по регуляции НАДФН-оксидазы путем фосфорилирования фермента (Kimura et al., 2012). О волновой природе функционирования АФК (Н2О2) в растительных клетках сообщается в ряде работ, в которых доказывается наличие в клетках арабидопсиса АФК-волн, выполняющих функцию системного сигнала на длинные дистанции, связанного с формированием системной устойчивости к действию стрессоров (Miller et al., 2009; Mittler et al., 2011). И главную роль в этих процессах играет НАДФН-оксидаза (RbohD oxidase) – генератор АФК, активность которой связана с Са2+-сигналингом и Са2+-регулируемыми киназами (Steinhorst, Kudla, 2013). Показаны колебания в активности микросомальной НАДФН-оксидазы этиолированных проростков гороха, что может влиять на уровень генерации АФК (Glyan’ko, Ischenko, 2013).

Флуктуации NO могут поддерживаться за счет связывания этой молекулы «NO-мишенями», к которым, в частности, относятся несимбиотический гемоглобин и нитрозоглутатион (GSNO) (Besson-Bard et al ., 2008; Sanchez et al ., 2011). GSNO является внутриклеточным резервуаром NO и может спонтанно освобождать оксид азота и выполнять роль проводника NO между клетками (Neill et al., 2008).

Все эти процессы ведут к формированию NO-волн, которые оказывают влияние на выход Са2+ из внутриклеточных органелл (вакуолей, ядра и др.) в цитоплазму и на обратный процесс. Наличие в клетке многочисленных «Са2+-мишеней» создает условия для уменьшения концентрации этого элемента в цитоплазме и формированию кальциевых осцилляций, которые наряду с NO-волнами, инициируют экспрессию ядерных генов. Эти процессы осуществляются за счет различных процессов (Medvedev, 2010). Особую роль в этом выполняют кальмодулин (CaM) и протеинкиназы, зависимые от Са2+ и осуществляющие фосфорилирование белков – факторов регуляции транскрипции (Steinhorst, Kudla, 2013; Tarchevsky, 2002).

Необходимо отметить, что существенным компонентом сигнальных систем являются Са2+-спайки (calcium spiking), образующие в результате флуктуаций в концентрации кальция. Са2+-спайки локализуются в околоядерном пространстве и формируются с участием белков ионных каналов (CASTOR, POLLUX), нуклепоринов (NUP85, NUP133) и связаны с осцилляциями кальция в нуклеоплазме (Oldroyd, Downie, 2008). Они, в частности, активируют кальций-зависимую кальмодулинкиназу (CCaMK) и далее рецептор цитокинина - гистидинкиназу (LjHK1, MtCRE1), что инициирует процесс деления клеток. В то же время действие цитокинина тесно связано с NO (Freschi, 2013).

Эндогенный ритм генерации NO в корнях, по всей вероятности, свидетельствует о наличии в клетках механизма, регулирующего как образование NO, так и АФК. Это подтверждается данными литературы о том, что в ответ на различные факторы генерация NO и АФК в клетках происходит одновременно и изменения в концентрации одного из компонентов оказывает влияние на уровень другого (Neill et al., 2008). Подобный механизм, очевидно, связан с гомеостазом ионов Са2+, выражающийся в пульсирующем изменении концентрации этого иона в цитоплазме (Са2+-волны). В последнее время это явление в литературе обозначается термином “Са2+-сигнатура” (саlcium signatures), которое характеризует флуктуации в концентрации внутриклеточного кальция по таким параметрам как: амплитуда, частота, продолжительность пульсов (Whalley, Knight, 2013). Показано влияние АФК (Н2О2) на синтез NO с участием НР у проростков арабидопсиса (Wang et al., 2010).

Таким образом, из вышеизложенного можно сделать вывод об определенном ритме в изменении уровня NO в клетках проростков гороха и о тесном взаимовлиянии Са2+, NO и АФК – как компонентов сигнальных систем растения, функционирование которых регулируется, вероятно, сходным(и) механизмом(ами). В этой связи предстоит выяснить механизм действия кальция и его влияние на перекрестное взаимодействие других сигнальных молекул, в частности, NO и Н2О2. Все эти механизмы, по-видимому, инициируются действием внешних факторов.

мин

Рисунок 1. Рис. Динамика интенсивности флуоресценции в корнях этиолированных проростков гороха на фоне воды, экзогенного кальция и ЭГТА.

1 - вода; 2 - 100 мкМ СаСl 2 ; 3 - 100 мкМ СаСl 2 + 100 мкМ ЭГТА

ACKNOWLEDGMENT

Степанову, Г.Г. Васильевой за помощь в проведении исследований.