РНК-терапевтические препараты как новая генерация лекарств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 616-092.616.08                                

Несмотря на определённые успехи в лечении, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются причиной смерти номер один в большинстве стран мира, унося ежегодно около 18 млн. человеческих жизней [1].

Одна из причин этого состоит в плохой изученности молекулярной основы большинства ССЗ, что находит отражение в росте заболеваемости и смертности от них даже в странах с высокоразвитыми здравоохранением и биомедицинскими исследованиями. Другой, не менее важный фактор — отсутствие эффективных лекарственных средств. Так, если проанализировать историю лечения большинства ССЗ, включая сердечную недостаточность, артериальную гипертензию и ишемическую болезнь сердца, то выяснится, что она была ограничена, в основном, небольшими органическими молекулами, например, сердечными гликозидами, бета-блокаторами, ангиотензинпревращающим ферментом, блокаторами рецепторов ангиотензина и кальциевых каналов, нитратами, статинами и т.д. [2].

И, чаще всего, самые последние «новые» лекарства от ССЗ представляли собой не что иное, как комбинацию уже одобренных и используемых терапевтических средств, а не новые соединения. В этой связи, усилия в этом направлении, предпринятые в последние годы, были направлены на создание альтернативных терапевтических средств, включая пептиды, антитела и нуклеиновые кислоты, которые открыли новые возможности в лечении ССЗ [3].

РНК-терапия — это новое направление медицины, которое, в качестве лекарственных средств, использует различные молекулы на основе РНК. Хотя РНК-терапия получила известность лишь недавно, тем не менее, её разработка продолжается вот уже в течение нескольких десятилетий [4-7].

В первых экспериментах изучалась возможность использования информационной (матричной) РНК (мРНК) с целью искусственной экспрессии белка in vivo [6, 7]. В этих первоначальных работах, где доставка in vitro транскрибируемой (IVT) мРНК в ткани мышей осуществлялась путём внутримышечной инъекции, эффективность экспрессии белка из инъецированных мРНК оказалась столь же высокой (судя по уровням белка, экспрессируемого из инъецированной нуклеиновой кислоты) как и при использовании векторов, кодируемых ДНК [6].

В следующем, ключевом исследовании, уже была использована лабораторная мРНК вазопрессина для кратковременной коррекции несахарного диабета у крыс [7]. После этих первоначальных успешных экспериментов с мРНК, в качестве терапевтических векторов начали применяться и другие молекулы на основе РНК. В настоящее время все они подразделены на пять групп и включают: антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) - antisense oligonucleotides (ASO); малые интерферирующие РНК (cиРНК) - small interfering RNAs (siRNAs); микроРНК (миРНК) – microRNAs (miRNAs); РНК-аптамеры (RNA aptamers) и мРНК (mRNAs) [6-11].

Как свидетельствуют данные по разработке двух вакцин против COVID-19 от Moderna и Pfizer/BioNTech с использованием технологии мРНК, терапия на основе молекул РНК может быть спроектирована, разработана, оценена, произведена и распространена в сравнительно короткие сроки. Однако более подробно эти вопросы, а также теория и функциональные аспекты различных методов РНК-терапии рассмотрены в публикациях [8, 12, 13].

Терапия на основе антисмысловых олигонуклеотидов (АСО). Подробно об этом обзоры [14, 15]. АСО представляют собой короткие (длиной 18–30 нуклеотидов) синтетические одноцепочечные нуклеиновые кислоты, которые связываются с клеточной РНК-мишенью по принципу комплементарности [15], чтобы: нарушать или корректировать сплайсинг (от англ. splice — сращивать или склеивать концы чего-либо) и/или процессинг пре-мРНК, или подавлять трансляцию, или индуцировать деградацию мРНК-мишеней [16, 17].

Каждый из этих действий, в конечном итоге, модулирует уровни целевого белка [15]. Важно отметить, что хотя АСО считаются РНК-терапевтическими, они могут быть также моно- или смешанными полимерами, состоящими из оснований РНК, ДНК и/или LNA ((locked nucleic acid, замкнутая нуклеиновая кислота) [15].

Многие АСО, кроме того, запускают пути эндогенной деградации РНК, рекрутируя РНКазу H1, которая расщепляет цепь РНК дуплексов ДНК: РНК [18].

Небольшой размер и хорошо понятные принципы, лежащие в основе дизайна последовательности АСО, помогают предотвратить потенциальную токсичность, сопряжённую с нецелевым связыванием [19].

In vivo АСО с немодифицированными фосфодиэфирными связями быстро разрушаются сывороточными нуклеазами и выводятся из кровотока почками [20].

Для улучшения фармакокинетики и фармакодинамики в состав АСО вводятся многочисленные химические модификации нуклеотидов [9]. Например, фосфодиэфирные связи АСО могут заменяться фосфоротиоатными связями для усиления устойчивости к нуклеазам и снижения гидрофильности при сохранении устойчивой активности РНКазы H1 [9, 21]. Наконец, необходимо указать и ещё на одно важное свойство АСО — в большинстве своём они не требуют специализированных транспортных средств для их доставки в ткани или клетки [9].

Некоторые мишени, такие как пропротеинконвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), липопротеин (а) (Lp(a)) и ANGPTL3 (angiopoietin-related protein 3, ангиопоэтин-подобный белок 3), генетически связаны с сердечно-сосудистыми и метаболическими заболеваниями [22-25].

Свойства АСО и олигонуклеотидных терапевтических средств позволяют им эффективно достигать каждой ткани, включая печень и сердце [9]. Имеется довольно значительное количество АСО, одобренных FDA в качестве терапевтических соединений. Однако для лечения ССЗ одобрение FDA получили лишь 2 препарата: мипомерсен (торговое название Kynamro) и воланесорсен. Мипомерсен предназначен для лечения гомозиготной семейной гиперхолестеринемии (ГоСГ), редкого генетического заболевания, при котором мутированы оба аллеля рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [26].

Без лечения ГоСГ приводит к снижению клиренса циркулирующего холестерина ЛПНП в плазме [25].

Соединение Kynamro представляет собой 2'-О-метоксиэтилхимерную АСО «второго поколения» [25], который сконструирован с помощью фосфоротиоатных, а не фосфодиэфирных связей, характерных для природных РНК [26].

АСО содержит нуклеотиды ДНК в центре молекулы с 2'-О-метоксиэтил-модифицированными нуклеотидами РНК на концах [26]. В печени этот препарат инициирует деградацию мРНК, кодирующей аполипопротеин (Аро) В-100, ключевой структурный элемент ЛПНП и его метаболического предшественника, липопротеина очень низкой плотности [26]. Снижение уровня белка ApoB, в свою очередь, снижает содержание холестерина ЛПНП и липопротеина (а) (Lp (а)) в крови [26, 27].

Двойное слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое клиническое исследование фазы III (NCT00607373), завершённое в 2010 г., показало, что мипомерсен эффективно ингибирует продукцию белка ApoB примерно на 25% и снижает уровень холестерина ЛПНП у пациентов с ГоСГ, которые уже получали гиполипидемическую терапию липид-снижающими препаратами [25, 28].

Тем не менее, несколько последующих исследований выявили побочные эффекты применения мипомерсена у пациентов, включая серьезные реакции в месте инъекции и гриппоподобные симптомы [28, 29]. Кроме того, сообщалось о серьезном риске повреждения печени. По данным функциональных проб печени, примерно у каждого третьего пациента, получавшего мипомерсен, обнаруживались измеримые признаки гепатотоксичности [30-33]. Поэтому в апреле 2021 г этот препарат был снят с продажи на открытом рынке.

Другой хорошо известный препарат АСО (воланесорсен) эффективно снижает уровень триглицеридов в плазме. Он нацелен на мРНК, кодирующую печеночный аполипопротеин C-

III (APOC3) [34,35]. Разработанный фирмами Ionis Pharmaceuticals и Akcea Therapeutics, этот препарат был зарегистрирован под торговой маркой Waylivra. У пациентов с синдромом семейной хиломикронемии (ССХ) еженедельные дозы воланесорсена заметно снижали уровень триглицеридов (1700 мг/дл против 90 мг/дл по сравнению с плацебо) [35].

В 2019 г исследование III фазы APPROACH также показало, что средний уровень триглицеридов снизился на 77% у пациентов, получавших воланасорсен, по сравнению с увеличением на 18% у пациентов в группе плацебо [36].

Было также установлено, что воланесорсен снижает уровень триглицеридов ниже порога риска острого панкреатита, вызванного триглицеридами [36].

Поскольку большинство АСО могут широко распределяться и накапливаться в печени и почках с периодом полураспада 2–4 недели, у воланесорсена были обнаружены некоторые признаки побочных эффектов, связанных с тромбоцитопенией и риском кровотечения [37, 38]. Несмотря на эти побочные эффекты, значительное снижение уровня липидов в плазме явилось основанием для того, чтобы Европейская комиссия одобрила воланесорсен в 2019 году в качестве единственно эффективного препарата для лечения пациентов с ССХ [39].

В настоящее время разрабатываются многочисленные АСО второго и третьего поколений для лечения не только ССЗ, но и других, опасных для жизни и редких генетических заболеваний, включая спинальную мышечную атрофию (спинраза), мышечную дистрофию Дюшенна (виондис 53) и наследственный транстиретиновый амилоидоз (инотерсен) [40-43].

Хотя краткосрочная безопасность АСО изучалась в доклинических и клинических исследованиях, потенциальные последствия длительного применения АСО до сих пор остаются неясными [19].

Кроме того, некоторые возможные побочные эффекты могут возникать из-за химии АСО или последующих событий, связанных с вовлечением в процесс мишени. По этим причинам требуется длительное наблюдение за пациентами, получающими препараты АСО, чтобы определить их эффективность и побочные явления в долгосрочной перспективе. Несмотря на эти, не решённые до конца проблемы, АСО-терапия всё же является большим шагом вперёд в лечении пациентов с некоторыми ранее неизлечимыми заболеваниями.

РНК-интерференция для подавления генов. Открытие РНК-интерференции (РНКи) полностью изменило наше понимание процессов экспрессии и регуляции генов. РНКи — это естественный процесс посттранскрипционной регуляции мРНК. Помимо регуляции экспрессии эндогенных генов, РНКи также защищает организм от чужеродных нуклеиновых кислот [44].

Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов обеспечивает ей широкие возможности для применения, например, такие как определение функций вновь открытых генов, или же идентификация новых и терапевтически значимых генов. У млекопитающих РНКи запускается короткими двухцепочечными РНК (дцРНК) эндогенного или экзогенного происхождения (синтетические РНК, патогены). Существует два основных типа РНКи: малые интерферирующие РНК (сиРНК) и микроРНК (миРНК). Они оба нацеливаются на мРНК, используя распознавание пар оснований, и инициируют деградацию мРНК, которая затем снижает уровни соответствующего белка [45].

Однако имеются ключевые различия между этими двумя механизмами РНКи. Например, сиРНК полностью комплементарны целевой мРНК и вызывают ее расщепление и деградацию [46], тогда как последовательности миРНК содержат множественные несовпадения с их мРНК-мишенью и инициируют деградацию мРНК путем привлечения ферментов декэпирования и деаденилаз [47].

Стандартный препарат сиРНК представляет собой дцРНК длиной от 21 до 25 нуклеотидов c двумя неспаренными нуклеотидами на 3’-конце каждой цепи. Попадая в клетку она встраивается в комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), после чего происходит удаление из комплекса одной из цепей сиРНК (цепи-спутницы, passenger-strand). Оставшаяся цепь (ведущая, guide-strand) связывается по принципу комплементарности со своей РНК-мишенью, и, если комплементарность полная, происходит разрезание целевой РНК, что приводит к деградации мРНК и снижению уровня экспрессии гена и соответствующего белка [48-51].

Первоначально терапевтические сиРНК сталкивались с множеством проблем, таких как иммуногенность, специфичность и нестабильность; однако было проведено множество исследований по оптимизации структуры и доставки лекарственных средств сиРНК. Сегодня многие препараты сиРНК получили одобрение FDA, в то время как другие в настоящее время проходят клинические испытания [8].

Большинство сиРНК-терапевтических средств или лекарств-кандидатов, ориентированных на сердечно-сосудистую систему, предназначены для лечения патологических состояний посредством доставки в печень. Инклисиран, продаваемый как леквио, одобрен в ЕС и США для лечения первичной гиперхолестеринемии или смешанной дислипидемии в конце 2021 г. [52, 53].

Инклисиран представляет собой искусственную сиРНК, конъюгированную с GalNAc (N-ацетилгалактозамин) на смысловой цепи для обеспечения специфической доставки в печень [54]. При абсорбции гепатоцитами инклисиран нацеливается на мРНК, кодирующую PCSK9, снижая, тем самым, экспрессию белка PCSK9 [55].

При этом инклисиран увеличивает уровень рецептора ЛПНП на поверхности клеток за счет снижения его оборота, что, в конечном итоге, снижает уровень ХС ЛПНП в крови из-за увеличения поглощения ХС ЛПНП печенью [52].

МиРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, которые играют жизненно важную роль в клеточных функциях посредством посттранскрипционной регуляции генов [56,57]. Как упоминалось выше, нуклеотидные последовательности миРНК содержат множественные несовпадения с их мРНК-мишенью, что может привести к нежелательным (нецелевым) эффектам. Однако эти несоответствия могут быть также полезными, поскольку позволяют одновременно нацеливаться на несколько различных мРНК. МиРНК обычно связываются с 3'UTR (нетранслируемой областью) мРНК и подавляют их трансляцию или привлекают деаденилазы и/или ферменты декэпирования для облегчения деградации мРНК-мишеней [58].

Небольшая часть микроРНК, по сообщениям, может повышать экспрессию генов [59].

В настоящее время на рынке нет терапевтических средств с миРНК. Однако число патентов и клинических испытаний ингибиторов миРНК (анти-миР) и имитаторов миРНК (миРНК-миметики) растет. Блокаторы миРНК (анти-миРНК). Поскольку нарушения в регуляции миРНК, в частности, их сверхэкспрессия, были ассоциированы со многими заболеваниями, репрессия миРНК быстро стала привлекательным подходом для терапии некоторых ССЗ. Анти-миРНК предназначены для специфического распознавания и ингибирования целевых миРНК, чтобы блокировать их связывание со своими мРНК-мишенями. С этой целью применяют различные подходы, которые основаны на использовании таких соединений как антагомиР (анти-миР, конъюгированные с холестерином), закрытые нуклеиновые кислоты и АСО [60-62].

Все эти молекулы предназначены для связывания и секвестрации миРНК, предотвращая, таким образом, взаимодействие миРНК-мРНК [63].

миРНК-миметики. Миметики миРНК представляют собой синтетические РНК, которые созданы по образцу эндогенных миРНК. В отличие от анти-миРНК, которые нацелены на ингибирование миРНК, сверхэкспрессирующихся при заболевании, миметики микроРНК предназначены, напротив, для замены или дополнения уровней полезных микроРНК. Терапевтические миметики миРНК, аналогично эндогенным миРНК, снижают уровень специфических генов [64].

Миметики миРНК в текущих клинических испытаниях предназначены, в основном, для терапии гепатита С и различных видов рака [65, 66].

РНК-аптамеры. В отличие от других РНК-терапевтических средств, РНК-аптамеры используют свою трехмерную конформацию, а не специфичную последовательность оснований для распознавания и спаривания со своими мишенями [67].

Подобно антителу, аптамеры (на основе ДНК, РНК или белка) связывают лиганд с очень высокой аффинностью и селективностью [66].

Хотя по функциям они аналогичны антителам на основе белков, производство РНК-аптамеров является более простым, выполняется полностью in vitro и более рентабельно по сравнению с изготовлением антител на основе белков [67].

РНК-аптамеры представляют собой одноцепочечные молекулы, которые выделяют с помощью метода систематической эволюции лигандов путём экспоненциального обогащения (SELEX, Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) [4, 5].

Процедура SELEX включает создание пула РНК, в котором те РНК, которые связываются с интересующими мишенями с высокой специфичностью, выделяются и обогащаются [4, 5, 67].

РНК-аптамеры демонстрируют гибкую направленность и, как было показано, связываются со специфическими молекулами, клетками и тканями [67]. В отличие от других РНК-терапевтических средств, РНК-аптамеры не ограничены внутриклеточной мишенью, и их можно сконструировать для связывания практически с любой молекулой в любом компартменте клетки [4, 5]. Связывающие свойства РНК-аптамеров позволяют им конъюгировать также с другими терапевтическими средствами или средствами для тканеспецифичной доставки [68].

В 2004 г. препарат пегаптаниб стал первым РНК-аптамером, одобренным FDA для лечения возрастной макулярной дегенерации (ВМД) [69].

Пегаптаниб представляет собой 28-нуклеотидный РНК-аптамер и функционирует посредством связывания с белком, фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), и последующим блокированием его провоспалительной активности у пациентов с ВМД, предотвращая, тем самым, серьезные осложнения зрения [69, 70].

Другие препараты-кандидаты на основе РНК-аптамеров в настоящее время проходят клинические испытания. Например, BT200 является кандидатом в пегилированные РНК-аптамеры, которые в настоящее время проходят испытания фазы I или II для лечения гемофилии А, атеросклероза и инсульта. BT200 показывает многообещающие результаты и действует как антитромботический агент, связывая домен A1 фактора фон Виллебранда (VWF) – фактора, критического для тромбообразования [71].

мРНК- терапия. Эксперимент по проверке концепции терапевтических средств, кодируемых мРНК, был проведен более трех десятилетий назад, когда Wolff et al. показали, что введение in vitro транскрибируемой (IVT)-мРНК в скелетные мышцы мыши приводит к экспрессии интересующего белка in vivo [6].

В течение 1990-х годов в ходе доклинических испытаний IVT-мРНК изучались различные области применения, включая замещение белков и разработки на основе вакцин для лечения или профилактики рака и инфекционных заболеваний [6, 11, 72].

Многочисленные исследования быстро выявили несколько основных недостатков терапии мРНК, включая короткий период полувыведения РНК и неспецифическую иммуногенность. За прошедшие десятилетия многие из этих проблем были решены, и терапевтические мРНК становятся предпочтительным подходом. Несколько университетов и фармацевтических компаний, включая Moderna, BioNTech, Novartis, CureVac, Sanofi Pasteur, Glaxo Smith Kline, AstraZeneca и Alexion, разрабатывают терапевтические средства на основе мРНК [8]. Концептуально многочисленные преимущества терапевтических подходов на основе IVT-мРНК делают их такими же или даже более универсальными, чем другие методы лечения на основе нуклеиновых кислот. IVT-мРНК полностью функциональны в цитоплазме и быстро транслируются с образованием желаемых белков [8, 9, 11].

Терапевтические средства на основе IVT-мРНК имеют лучший профиль безопасности, поскольку, в отличие от плазмидной ДНК и некоторых вирусных векторов, мРНК-терапевтические препараты неспособны интегрироваться в геном и, таким образом, устраняется риск инсерционного мутагенеза [11].

Производство IVT-мРНК относительно управляемо и недорого; все эти факторы способствовали проявлению широкого интереса со стороны фармкомпаний к этому новому классу препаратов для применения в онкологии, кардиологии, эндокринологии, гематологии, легочной медицине и в качестве вакцин против инфекционных заболеваний [8, 9, 11].

В настоящее время IVT-мРНК может быть доставлена в клетки пациента двумя способами. Первый способ – методом ex vivo, т.е. сначала осуществляется забор клеток у пациента, затем, после введения в них IVT-мРНК, клетки возвращаются обратно пациенту. Другой альтернативой является прямая доставка IVT-мРНК с использованием различных векторов доставки [8].

Значительные усилия были затрачены на улучшение трансляционной способности и продолжительности жизни препаратов на основе IVT- мРНК in vivo. Они включают улучшение структурных компонентов IVT-мРНК, включая 5'-кэп, 5'- и 3'-нетранслируемые области, кодирующие последовательности и полиаденилированный хвост мРНК. Иммуностимулирующий профиль IVT-мРНК можно изменять и настраивать в зависимости от терапевтических целей. Например, для стратегии вакцинации на основе мРНК иммуностимулирующий эффект, связанный с IVT-мРНК, можно считать преимуществом, поскольку он может способствовать антиген-специфическим клеточным и гуморальным иммунным ответам. Тем не менее, активация врожденного иммунитета является основным препятствием для заместительной терапии белками; поэтому для решения этой проблемы уже разработаны и продолжают разрабатываться несколько подходов, направленных на создание «деиммунизированной» мРНК [73].

На сегодня в стадии разработки находятся 10 мРНК-препаратов для лечения ССЗ, из которых клинические испытания прошёл лишь один – мРНК VEGF-A (Moderna). В фазе I исследования внутрикожное введение мРНК VEGF-A приводило к увеличению локальной экспрессии белка VEGF-A (по оценке с помощью микродиализа) и усилению кожного кровотока у мужчин с сахарным диабетом 2 типа [74].

Эти результаты явились основанием для продолжения клинических испытаний и в фазе 2а, EPICCURE, планировалось определить, может ли данный мРНК терапевтический препарат восстановить ишемизированные, но жизнеспособные участки миокарда у пациентов с ишемической болезнью сердца [75].

Если поставленная задача увенчается успехом, то будут предоставлены доказательства того, что прямая инъекция мРНК в ишемизированную ткань может улучшить перфузию и функцию миокарда. Позитивные результаты клинического испытания фазы 2а EPICCURE, представленные на конференции Американской кардиологической ассоциации в ноябре 2021 года, свидетельствуют о том, что первичная конечная точка безопасности и переносимости была достигнута и что исследовательский анализ эффективности поддерживает дальнейшую клиническую разработку мРНК VEGFA (полный анализ данных и рукопись по результатам клинического испытания фазы 2а EPICCURE находятся в стадии подготовки) [76].

Вывод

Несомненный успех двух мРНК-вакцин против COVID-19 продемонстрировал миру эффективность и универсальность терапевтических средств на основе РНК, что привело к небывалому притоку ресурсов для разработки новых РНК-препаратов. Однако, несмотря на то, что выполняются или уже завершены более 40 клинических испытаний по оценке эффективности и безопасности различных РНК-препаратов, нацеленных на ССЗ, РНК-терапевтические средства остаются на сегодняшний день сравнительно неиспользованным источником для лечения этих распространённых и опасных для жизни заболеваний. Это, в определённой степени, связано с некоторыми текущими проблемами РНК-терапии. Наиболее главной среди них является проблема клеточно-специфической доставки РНК-препаратов, которую исследователям ещё предстоит решить. Тем не менее, хотя доставка РНК-препаратов в органы-мишени и их эффективное введение в клетки остаются сложными, многие преимущества РНК-препаратов (способность нацеливаться на широкий спектр генетических молекул, быстрое и эффективное производство, долгосрочный терапевтический эффект, полезность при редких заболеваниях и отсутствие риска генотоксичности) делают разработку технологий лекарственных препаратов на основе РНК выгодным вложением средств. Вдохновлённые разработкой различных новых РНК-препаратов, включая вакцины против COVID-19 в 2020 году, многие исследователи прилагают беспрецедентные усилия для разработки новых препаратов на основе РНК. Поэтому есть все основания ожидать, что в недалёком будущем имеющиеся проблемы РНК-терапии, в том числе и проблема доставки РНК-препаратов в органы мишени, будут успешно решены и в арсенале медицинских работников появится большое разнообразие препаратов на основе РНК, способных эффективно лечить пациентов с некоторыми ранее неизлечимыми заболеваниями, включая и страдающих определенными нозологическими формами сердечно-сосудистой патологии.

Все авторы принимали участие в разработке концепции статьи и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами.

Авторы не получали гонорар за статью.