Роль чувствительных С-волокон в развитии кардиопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования

Ишемическая болезнь сердца по-прежнему занимает лидирующее место среди причин смертности населения большинства экономически развитых стран мира, в том числе и в странах СНГ. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования последних лет существенно расширили представления о патогенезе ИБС. В клиническую терминологию прочно вошли такие новые феномены как оглушенный, гиберниру-ющий миокард, а также феномен ишемического прекондиционирования. Прекондиционирование миокарда - один из наиболее эффективных механизмов эндогенной кардиопротекции. Под ишемическим прекондиционированием понимают повышение устойчивости миокарда к продолжительной ишемии, возникающее после кратковременных эпизодов локальной ишемии -реперфузии [1,2,3]. Однако применение данного феномена в клинической практике ограничено ввиду невозможности прогнозирования и предупреждения приступа ишемии. В последние годы было также показано, что устойчивость миокарда к ишемии повышается не только после кратковременных эпизодов ишемии - реперфузии самого миокарда, но и после ишемии - реперфузии анатомически отдаленных органов, таких, например, как тонкий кишечник, почки, скелетная мускулатура. Этот феномен получил название дистантного ишемического прекондиционирования (ДИПК). В многочисленных исследованиях была показана высокая эффективность ДИПК в ограничении размера некроза миокарда [4]. Понимание механизмов, лежащих в основе ДИПК, важно для скорейшего внедрения возможностей данного феномена в клиническую практику. Согласно современным представлениям, существуют 2 пути передачи ишемического сигнала от анатомически удаленного органа к сердцу - гуморальный [4-8] и нейрогенный [4,5,9-11]. Нейрогенный путь предполагает участие чувствительных немиели-низированных С-волокон [12]. Если эта гипотеза верна, то активация афферентных С-волокон конечностей неишемическим стимулом может оказывать кардиопротекторное действие. В экспериментальных исследованиях было показано, что введение капсаицина в неонатальном периоде в высоких дозах вызывает дегенерацию чувствительных нервных волокон. В тоже время капсаицин вызывает стимуляцию этих же волокон при воздействии в малых концентрациях [12,13]. Эксперименты, проведенные Ren X. et al. [14], продемонстрировали наличие кардиопротектор-ного эффекта неишемического стимула: надреза передней брюшной стенки, названного травматическим дистантным прекондиционированием. Было также показано, что кардиопротекторный эффект травматического прекондиционирования обусловлен раздражением чувствительных рецепторов, расположенных в коже, и требует вовлечения кардиальных симпатических нервов [9].

Целью настоящего исследования было изучение участия чувствительных С-волокон в механизмах развития противоишемического эффекта дистантного ишемического прекондиционирования (ДИПК) при ишемии и реперфузии миокарда.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все исследования были проведены на модели острой коронарной недостаточности. В качестве наркоза использовался этаминал натрия в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно с последующим введением поддерживающей дозы 10 мг/кг/час внутривенно. Животных посредством трахеотомии переводили на искусственное дыхание атмосферным воздухом с помощью аппарата ИВЛ. Для измерения системного артериального давления (АД) крысам канюлировали правую общую сонную артерию. ЭКГ регистрировали при помощи игольчатых электродов. Температуру измеряли в прямой кишке с помощью температурного датчика. Регистрацию ЭКГ, АД осуществляли с помощью компьютерной программы Spike 4. Грудную клетку вскрывали в четвертом межреберном промежутке. Регионарная ишемия достигалась путем наложения лигатуры на переднюю нисходящую коронарную артерию (ПИКА). Окклюзия артерии подтверждалась цианозом ишемизированной области, снижением АД (на 10-20 мм рт. ст.) и подъемом сегмента ST на ЭКГ. Реперфузия миокарда достигалась простым удалением фишки и подтверждалась исчезновением цианоза и снижением сегмента ST и составляла 120 минут. Изучались следующие показатели гемодинамики: среднее АД (АД ср.), частота сердечных сокращений (ЧСС), двойное произведение (ДП). Показатели гемодинамики регистрировались непрерывно в течение эксперимента и оценивались в конце 15-минутной стабилизации после вскрытия грудной клетки, в начале 30-минутной окклюзии ПИКА, в начале реперфузии, а также, каждые 30 минут в течение реперфузии.

В конце реперфузии производили повторную окклюзию ПИКА. Внутривенно в левую общую яремную вену вводили 0.5 мл 5% раствора синьки Эванса, определяя, таким образом, зону риска, как не окрашенную в синий цвет. Затем сердце извлекали и отделяли правый желудочек. После за- мораживания при температуре -20 С левый желудочек разрезали на б поперечных срезов. Срезы сканировали при помощи сканера с обеих сторон, после чего их помещали в раствор трифенилте-тразолия хлорида на 15 минут при температуре 37 С для идентификации зоны некроза. Жизнеспособный миокард (клетки, сохранившие деги-дрогеназную активность) окрашивался в кирпично-красный цвет, некротизированная ткань была белесой. После 24-часовой инкубации срезов в 10% растворе формалина срезы сканировали повторно для определения соотношения площадей зоны риска и зоны некроза. Размеры зон риска и некроза определяли при помощи компьютерной планиметрии с использованием программы Adobe Photoshop 6.0.

Животные были разделены на два экспериментальных протокола.

Протокол 1. Для изучения участия чувствительных С-волокон в развитии кардиопротектор-ного эффекта ДИПК были набраны 30 новорожденных крысят в возрасте 1-2 суток. Животные были разделены на опытную и контрольную группы. С целью дегенерации чувствительных нервов, преимущественно немиелинизированных С-волокон, новорожденным крысам опытных групп (п=15) под 4% ингаляционным галотановым наркозом подкожно в область спины вводили раствор, содержащий капсаицин (50 мг/кг массы), этанол (1/10), Твин-80 (1/10) и дистиллированную воду (8/10). Крысам контрольных групп (п=15) вводили раствор такого же состава, но не содержащий капсаицина. При достижении массы крыс 200-250гр животные обеих групп были дополнительно рандомизированы на 2 подгруппы. Одним животным выполнялась только 30-минутная окклюзия ПИКА, сопровождающаяся 120-минутной реперфузией (группы контроль - ОИМ, п=7, и капсаицин - ОИМ, п=б), другим - за 25 минут до начала коронарной окклюзии выполнялось 15-минутное пережатие обеих бедренных артерий (группы контроль - ДИПК, п=8, и капсаицин - ДИПК, п=9). С целью подтверждения эффективности воздействия капсаицина на чувствительные С-волокна всем крысам измеряли массу мочевого пузыря, поскольку известно, что при потере чувствительной иннервации наблюдается его выраженная гипертрофия [13].

Протокол 2. Для изучения участия чувствительных С-волокон в ограничении зоны некроза миокарда, вызванной его ишемией и реперфузией, мы проводили стимуляцию С-волокон путем подкожного введения капсаицина крысам опытных групп. Исследование проводилось на 50 белых нелинейных крысах-самцах массой 250-

ЗООгр, разделенных на пять групп. В контрольной группе крыс после периода 15-минутной стабилизации выполняли 30-минутную окклюзию ПИКА, сопровождающуюся 120-минутной реперфузией (п=10). Во второй группе крысам за 25 минут до начала окклюзии ПИКА выполнялось 15-минутное пережатие обеих бедренных артерий (группа ДИПК, п=10). В третьей группе окклюзия бедренных артерий выполнялась с 25-й минуты ишемии по 10-ю минуту реперфузии (группа ДИПК25', п=10). В четвертой группе крысам подкожно билатерально в область задних конечностей за 25 минут до начала 30-минутной ишемии миокарда вводился капсаицин в дозе 3 мкг (группа Капсаицин, п=10). Животным пятой группы капсаицин вводился на 25-й минуте ишемии миокарда (группа Капсаицин25', п=10).

Статистическая значимость различий изучаемых показателей между группами оценивалась при помощи теста множественных сравнений Бонферрони. Все данные представлены в формате среднее ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатели гемодинамики в течение всего эксперимента во всех группах крыс представлены в табл. 1, 2. В ходе экспериментов не отмечалось значимых различий показателей гемодинамики (АД ср., ЧСС) в опытных группах по сравнению с контрольными.

Протокол 1. Размеры зон риска были сопоставимы во всех экспериментальных группах. На рис. 1 представлены зоны некроза в миокарде левого желудочка крыс, подвергшихся введению больших доз капсаицина в возрасте 1 - 2 суток, а также в группах крыс, которым вводился раствор такого же состава, но не содержащий капсаицин. Размеры зон некроза в группах животных, которым выполнялась 30-минутная ишемия миокарда с последующей 120-минутной реперфузией, были сопоставимы и составили 45±4 и 43±3% (группы Контроль-ОИМ и Капсаицин-ОИМ, соответственно, р>0,05). В группе Контроль-ДИПК отмечалось уменьшение размера некроза на 44% в сравнении с группой Контроль-ОИМ (р<0,01). У животных, которым в неонатальном периоде с целью дегенерации чувствительных С-волокон вводился капсаицин (группа Капсаицин-ДИПК), окклюзия бедренных артерий не сопровождалась развитием кардиопротекторного эффекта (р>0,05 в сравнении с группой Капсаицин-ОИМ).

Протокол 2. На рис. 2 представлены размеры зон некроза в миокарде левого желудочка крыс, которым проводилась стимуляция чувствитель- ных С-волокон посредством подкожного введения низких доз капсаицина. В контрольной группе крыс зона некроза составила 42±1%. В группе, в которой выполнялась двухсторонняя окклюзия бедренных артерий за 25 минут до начала острой ишемии миокарда (группа ДИПК), отмечалось ограничение зоны некроза на 54% в сравнении с контрольной группой (р<0,001). В группе животных, в которой окклюзия бедренных артерий производилась с 25-й минуты ишемии по 10-ю минуту реперфузии (группа ДИПК25'), также было получено значительное уменьшение зоны некроза в сравнении с контрольной группой (р<0,001).

У крыс, которым до начала острой коронарной окклюзии подкожно вводился капсаицин (группа Капсаицин), наблюдалось значительное ограничение размера некроза по сравнению с животными контрольной группы (р<0,001). При этом, кардиопротекторный эффект введения низких доз капсаицина был сопоставим с эффектом ДИПК (р>0,05). При введении капсаицина на 25-й минуте ишемии противоишемический эффект отсутствовал (р>0,05 в сравнении с группой Контроль), в то время как двухсторонняя окклюзия бедренных артерий, выполняемая с 25 минуты острой коронарной окклюзии, приводила к ограничению повреждения миокарда (р<0,001 в сравнении с группой Капсаицин25').

ОБСУЖДЕНИЕ

Основное преимущество ДИПК заключается в малой инвазивности и технической простоте воспроизведения, что делает его использование в клинической практике перспективным. Многообещающие результаты некоторых недавних клинических исследований [15] могут способствовать скорейшему внедрению ДИПК в практическую медицину. Это обусловливает важность изучения механизмов, лежащих в основе развития эффектов этого феномена.

В настоящее время известно, что в формирование окончательного размера некроза миокарда вносит вклад как ишемическое, так и реперфузионное повреждение [16,17,18,19], развивающиеся независимо друг от друга и, возможно, посредством различных механизмов. Существование реперфузионного повреждения подтверждается уменьшением размера инфаркта при использовании лечебных вмешательств, осуществляемых в первые минуты восстановления коронарного кровотока [18,19,20]. В проведенном нами ранее исследовании [20] было продемонстрировано ограничение зоны некроза миокарда у крыс, подвергавшихся двухсторонней окклюзии бе- дренных артерий с 25-й минуты ишемии по 10-ю минуту реперфузии при воспроизведении у них модели острой коронарной недостаточности. Это свидетельствует о более значимом вкладе реперфузионного повреждения в формирование окончательного размера зоны необратимого повреждения миокарда, чем предполагалось ранее.

Учитывая факт существования ишемического и реперфузионного повреждения, нам показалось важным и актуальным изучить роль нервных механизмов в реализации противоишемического эффекта ДИПК на этапах ишемии и реперфузии.

При дегенерации чувствительных С-волокон введением высоких доз капсаицина новорожденным крысам противоишемический эффект ДИПК не проявлялся. Этот факт является прямым доказательством непосредственного участия С-волокон в механизмах развития данного феномена. Введение крысам подкожно низких доз капсаицина, селективно стимулирующего С-волокна [12], до начала 30-минутной коронарной окклюзии сопровождалось ограничением зоны некроза, сравнимым по выраженности с противоишемиче-ским эффектом ДИПК (р>0,05), что согласуется с имеющимися в литературе данными [9]. Вместе с тем, стимуляция С-волокон низкими дозами капсаицина на 25-й минуте ишемии не оказывала кар-диопротекторного действия (р>0,05 в сравнении с группой Контроль). Эти данные могут свидетельствовать о существовании иных, вероятно, гуморальных механизмов ДИПК, осуществляемого с 25-й минуты ишемии по 10-ю минуту реперфузии.

ВЫВОДЫ

• 1.    При дегенерации капсаицин-чувствительных афферентов у новорожденных крыс противоишемический эффект дистантного ишемического прекондиционирования не проявлялся, что свидетельствует о непосредственном участии чувствительных С-волокон в механизмах развития данного феномена.

• 2.    Стимуляция С-волокон до начала острой ишемии способствует ограничению зоны некроза в миокарде и сопоставима по противоишемиче-ской эффективности с дистантным ишемическим прекондиционированием.

• 3.    Стимуляция С-волокон во время ишемии миокарда не оказывает противоишемического эффекта, что может свидетельствовать об участии других, вероятно, гуморальных механизмов, лежащих в основе развития кардиопротекторно-го эффекта дистантного прекондиционирования, осуществляемого с 25-й минуты ишемии по 10-ю минуту реперфузии миокарда.

Табл.1.

Показатели гемодинамики в ходе эксперимента у животных, подвергшихся введению капсаицина или растворителя в неонатальном периоде: животные подвергались только 30-минутной ишемии и 120-минутной реперфузии миокарда (Контроль-ОИМ, Капсаицин-ОИМ) или двухсторонней 15-минутной окклюзии бедренных артерий с последующей окклюзией и реперфузией коронарной артерии (Контроль-ДИПК, Капсаицин-ДИПК).

Группа		Контроль-ОИМ	Капсаицин-ОИМ	Контроль-ДИПК	Капсаицин-ДИПК
До начала ОИМ	АД ср.	74±3	77±3	80±6	72±3
	ЧСС	381±9	382±25	369±20	380±15
Начало ОИМ	АД ср.	81 ±4	75±5	90±б	73±5
	ЧСС	400±12	398±23	394±17	425±9
Начало реперфузии	АД ср.	74±2	74±4	75±4	70±3
	ЧСС	416±8	402±21	399±17	410±11
30'реперфузии	АД ср.	7б±3	82±5	80±4	73±2
	ЧСС	39б±17	403±21	40б±19	40б±12
60'реперфузии	АД ср.	75±1	83±4	80±4	75±3
	ЧСС	383±10	408±24	425±16	421 ±11
90'реперфузии	АД ср.	77±3	82±5	83±4	73±4
	ЧСС	390±16	420±24	425±16	433±7
120'реперфузии	АД ср.	79±4	83±5	81 ±3	73±3
	ЧСС	407±17	432±24	425±16	438±12

Табл.2

Показатели гемодинамики в ходе эксперимента у животных, подвергшихся 30-минутной ишемии (Контроль) и 120-минутной реперфузии миокарда. Животным опытных групп за 25 минут до начала 30-минутной ишемии (ДИПК) и с 25-й минуты ишемии (ДИПК25') проводили двухстороннее 15-минутное пережатие бедренных артерий, либо подкожное введение капсаицина до ОИМ (Капсаицин) и на 25-й минуте острой коронарной окклюзии (Капсаицин25').

Группа		Контроль	ДИПК	ДИПК25'	Капсаицин	Капсаицин25'
До начала ОИМ	АД ср.	79±4	82±б	93±7	73±3	85±5
	ЧСС	428±9	421±10	390±16	382±13	407±14
Начало ОИМ	АД ср.	7б±5	82±б	88±6	81 ±4	78±4
	ЧСС	442±7	432±14	390±16	407±13	421±13
Начало реперфузии	АД ср.	73±2	81 ±6	87±5	78±4	73±3
	ЧСС	435±12	443±13	417±15	420±14	415±11
30'реперфузии	АД ср.	81 ±3	8б±б	92±5	78±3	72±3
	ЧСС	434±16	428±14	398±16	405±15	409±12
60'реперфузии	АД ср.	87±3	90±б	95±5	90±7	72±3
	ЧСС	435±16	428±14	395±16	422±18	432±12
90'реперфузии	АД ср.	84±4	87±7	92±5	88±6	74±2
	ЧСС	434±17	428±15	411±14	427±17	426±11
120'реперфузии	АД ср.	85±5	88±5	91±5	8б±5	74±3
	ЧСС	438±14	423±11	419±13	425±16	433±11

Данные представлены в формате: среднее ± стандартная ошибка среднего.

Рис. 1. Зоны некроза в миокарде левого желудочка у животных, подвергшихся введению капсаицина или растворителя в неонатальном периоде. Животным групп Контроль-ОИМ и Капсаицин-ОИМ выполняли только 30-минутную ишемию и 120-минутную реперфузию миокарда, крысам групп Контроль-ДИПК и Капсаицин-ДИПК до начала острой коронарной окклюзии проводили двухстороннее 15-минутное пережатие бедренных артерий.

**- р<0,01 - значимое уменьшение зоны некроза в группе Контроль-ДИПК в сравнении с группой Контроль-ОИМ.

Рис. 2. Зоны некроза в миокарде левого желудочка у животных, подвергшихся 30-минутной ишемии и 120-минутной реперфузии миокарда. Животным опытных групп за 25 минут до начала 30-минутной ишемии (ДИПК) и с 25-й минуты ишемии (ДИПК25') проводили двухстороннее 15-минутное пережатие бедренных артерий, либо подкожное введение капсаицина до ОИМ (Капсаицин) и на 25-й минуте острой коронарной окклюзии (Капсаи-цин25').

*** - р<0,001 - значимое уменьшение зоны некроза в группах ДИПК, ДИПК25' и Капсаицин в сравнении с контрольной группой,

• ### - р<0,001 - значимое уменьшение зоны некроза.

• <0,001 - значимое уменьшение зоны некроза