Роль циклина D1 в механизмах резистентности к гормональной терапии тамоксифеном

Hormone-receptor positive breast cancer is the most common molecular subtype and represents 60–75 % of all breast cancers (BC). The presence of specific molecular targets such as the estrogen/progesterone receptor determines the use of hormone therapy for patients with this subtype. Tamoxifen, a selective estrogen receptor modulator, remains the first adjuvant treatment choice for the hormone-receptor positive BC patients. However, tamoxifen resistance is the major limitation of its efficacy. In this regard, the study of drug resistance mechanisms as well as search for biological prognostic markers of tamoxifen efficacy is very important. Cyclin D1 is a representative of the regulatory protein family, which plays a central role in the cell cycle regulation. The data on the association between cyclin D1 and estrogen-dependent signaling as well as the characteristics of CCND1 gene and its most studied polymorphic loci, were presented. The prognostic significance of cyclin D1 in hormone-receptor positive BC receptor-positive breast cancer was described. The experimental and clinical studies data on the association between the cyclin D1 expression level and tamoxifen efficacy are analyzed. Current approaches to overcoming hormone resistance based on cyclin D1 studies were considered.

В структуре заболеваемости и смертности женского населения рак молочной железы (РМЖ) остается ведущей онкологической патологией, как в России, так и в мире. По данным ВОЗ, в 2018 г. было зарегистрировано 2,09 млн новых случаев заболевания РМЖ [1]. В Российской Федерации РМЖ является самым распространенным злокачественным новообразованием у женщин, составляя 21,1 % [2].

Многообразие молекулярных нарушений в опухолевых клетках молочной железы определяет высокую клиническую и биологическую гетерогенность заболевания. Для наиболее эффективного подбора терапии принято классифицировать РМЖ на основе экспрессии маркеров: эстрогеновых рецепторов (ER), прогестероновых рецепторов (PR), рецепторной тирозинкиназы семейства эпидермального фактора роста (HER2), белка клеточной пролиферации Ki67, и выделять гормон-позитивные опухоли (люминальный А, люминальный В рак молочной железы, люминальный HER2-позитивный) и гормон-негативные (с гипреэкспрессией HER2 и тройной негативный РМЖ) (таблица).

Для рецептор-позитивного РМЖ применение тамоксифена (препарата класса селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов) остается «золотым» стандартом противоопухолевой гормонотерапии. Однако, несмотря на высокую чувствительность такого типа опухолей к гормонотерапии, использование данного терапевтического подхода не всегда демонстрирует ожидаемую эффективность. В этой связи все большее значение приобретает выявление дополнительных прогностических маркеров, которые определяют различное биологическое поведение опухолей молочной железы и ответ на проводимую терапию. Одним из таких молекулярных маркеров являются регуляторы циклин-зависимых киназ (Cdk) – белки-циклины, которые координируют различные внутриклеточные сигнальные каскады посредством контроля клеточного цикла.

Общие представления о циклине D1

Семейство циклинов (циклин A – циклин J) включает 14 белков с коротким временем полужизни, которые, как правило, отличаются друг от друга по аминокислотной последовательности. Общей структурной особенностью всех циклинов является наличие гомологичной последовательности из 150 аминокислотных остатков, называемой таблица/table

Биологические подтипы рМЖ [3, 4]

Biological subtypes of breast cancer [3, 4]

Молекулярный подтип/Molecular subtype	Параметры/Parameters
Тройной негативный/	Негативные ER, PR и HER2/
Triple negative	Negative ER, PR и HER2
Гормон-рецептор-негативный	Негативные ER, PR/Negative ER, PR
HER2-позитивный/	Позитивные HER2/Positive HER2
Hormone-receptor negative HER2-positive	(ER–/HER2+)

Гормон-рецептор-позитивный HER2-позитивный (люминальный HER2-позитивный)/

Hormone-receptor positive HER2-positive (luminal HER2-positive)

Позитивные ER, PR/Positive ER, PR Позитивные HER2/Positive HER2 (ER+/HER2+)

Гормон-рецептор-позитивный HER2-негативный/ Hormone-receptor positive HER2-negative

Высокая экспрессия ER/PR/High ER/PR expression

Люминальный-А подобный/

Низкий уровень Ki67/Low Ki67

Низкая степень злокачественности/Low-grade cancer

Luminal A-like

Прогностически благоприятные мультипараметрические молекуляр-

ные маркеры/

Favorable multiparameter molecular markers

Люминальный-B подобный/ Luminal B-like

Низкая экспрессия ER/PR/Low ER/PR expression Высокий уровень Ki67/High Ki67 Высокая степень злокачественности/ High-grade cancer Неблагоприятные мультипараметрические молекулярные маркеры/ Unfavorable multiparameter molecular markers

циклиновым боксом, который отвечает за связывание с Cdk. N-концевой участок циклинов (бокс деструкции) определяет внутриклеточный распад белков [5]. В зависимости от времени действия в клеточном цикле циклины подразделяются на два подсемейства: G1-циклины (C, D, E) и митотические циклины (циклины A и B). Циклины группы D (D1, D2, D3) являются основными белками, регулирующими фазовый переход G1/S в клеточном цикле, из всех циклинов этой группы наиболее изученными являются белки D1 [6]. Циклин D1 необходим для формирования долек и альвеол в процессе нормального развития молочной железы [7]. Показано, что аберрантная экспрессия циклина D1 стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток молочной железы и способствует развитию опухоли в линиях трансгенных мышей [8]. Высокий уровень экспрессии циклина D1 обнаружен при доброкачественных пролиферативных заболеваниях молочной железы, что свидетельствует о его вовлечении в наиболее ранние молекулярные нарушения, ведущие к развитию злокачественной трансформации [9].

В ответ на разнообразные митогенные стимулы внутриклеточное содержание циклина D1 резко возрастает, что ведет к образованию комплекса циклин D1-Cdk4/6, который транспортируется из цитоплазмы в клеточное ядро белками p21waf1, p27Kip1 и p57Kip2. В середине G1-фазы циклин D1-Cdk4/6 и активированный комплекс циклин E-Cdk2 фосфорилируют белок pRb, что приводит к высвобождению транскрипционных факторов E2F-DP, регулирующих активность генов, продук- ты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы [10, 11].

Помимо важнейшей регуляторной роли в клеточном цикле, циклин D1 вовлечен в механизмы активации ERα, опосредуя взаимодействие ERα и SRC, что позволяет формировать транскрипционно активный тройной комплекс в отсутствие лиганда [12]. С другой стороны, ERα регулирует экспрессию гена циклина D1, формируя, таким образом, петлю положительной обратной связи – активация циклина D1 приводит к экспрессии ERα, что, в свою очередь, индуцирует увеличение продукции циклина D1 [13].

Ген циклина D1 и его полиморфные варианты

Циклин D1 кодируется геном CCND1 , локализованным на хромосоме 11q13.3. Амплификация CCND1 достигает 10–15 % случаев первичного рака молочной железы, причем наиболее характерна для рецептор-позитивных опухолей, в частности люминального B подтипа [14–16]. Однако гиперэкспрессия циклина D1 наблюдается в 50–70 % опухолей молочной железы, что свидетельствует о наличии регуляторных механизмов белковой экспрессии циклина D1, отличных от генной амплификации [17].

Согласно данным базы Gene Cards, известно около 4385 полиморфных вариантов гена CCND1. Наиболее хорошо охарактеризованным является полиморфизм в четвертом экзоне CCND1 rs9344 G>A. В результате альтернативного сплайсинга гена CCND1 замена глицина на аланин в 870-м положении приводит к образованию двух транскриптов – изоформ a и b. Тринскрипт b кодируется вариантным аллелем A, тогда как дикий тип CCND1 кодирует тринскрипт а; оба транскрипта имеют высокую степень гомологии. Вариант транскрипта b характеризуется коротким C-концевым доменом, который ответствен за процессы внутриклеточной протеосомной деградации, что определяет длительный период полураспада вариантного белка и высокий уровень экспрессии CCND1 [18]. Представленные результаты данных проведенных метаанализов свидетельствуют о связи CCND1 rs9344 G>A с риском развития РМЖ в различных популяционных выборках [19–23].

Помимо CCND1 rs9344 G>A перспективным объектом исследования является полиморфный локус rs67865 в 3´нетранслируемом участке (3´-UTR) гена CCND1, характеризующийся заменой C на G в 1722-м положении. Хотя роль данного полиморфизма в регуляции экспрессии гена CCND1 остается неизвестной, показано, что мутации в 3´-UTR гена CCND1 связаны с высокой стабильностью мРНК и гиперэкспрессией белка [24]. Метаанализ, представленный в 2016 г., не подтвердил ассоциативную связь полиморфизма rs67865 с риском развития злокачественных новообразований [25]. Однако более ранние данные, полученные в 2009 г. N. Mavaddat et al., свидетельствуют о том, что этот полиморфный локус гена CCND1 ассоциирован с чувствительностью к рецептор-негативному раку молочной железы [26]. Интегративный геномный подход, включающий данные полногеномных исследований (GWAS) и экспрессионный анализ, показал, что экспрессия генов, ассоциированных с риском развития РМЖ, различна в рецептор-позитивных и рецептор-негативных опухолях. Используя такой подход, обнаружено 13 SNP (включая CCND1 rs9344), связанных с дифференциальной экспрессией соответствующих им генов в рецептор-позитивном РМЖ [27]. Стоит отметить, что в современных литературных источниках не представлены исследования SNPs rs9344 и rs678653 во взаимосвязи с эффективностью терапии тамоксифеном у больных РМЖ.

Прогностическая значимость циклина D1 при рецептор-позитивном раке молочной железы

Несмотря на достаточно широкий интерес исследователей к циклину D1, данные о его прогностической значимости при рецептор-позитивном РМЖ довольно противоречивы. Наибольшее количество работ посвящено иммуногистохимической оценке экспрессии белка, достаточно часто анализируются число копий гена CCND1 и уровень его транскрипционной активности в аспекте факторов прогноза РМЖ [28]. Показана корреляция числа копий гена CCND1 и/или гиперэкспрессии циклина D1 с высоким риском развития рецидива и неблагоприятным исходом заболевания [29–35]. В ряде исследований связь циклина D1 с прогнозом у больных с эстроген-позитивным РМЖ не была подтверждена [36–38]. Согласно результатам TransATAC проекта, амплификация гена CCND1 ассоциирована с низкими показателями безрецидивной выживаемости, в то время как ядерная экспрессия CCND1, напротив, – с высокими показателями для данной группы пациентов [39]. По данным A.B. Ortiz et al. [14], гиперэкспрессия циклина D1 ассоциирована с благоприятными прогностическими маркерами (экспрессией ER, PR, низким grade). Вместе с тем авторами показано, что число копий гена CCND1 связано с коротким периодом выживаемости без прогрессирования у больных РМЖ. По-видимому, прогностическое значение амплификации гена CCND1 и уровня его белковой продукции может иметь противоположную направленность, которая обусловлена различной функциональной активностью циклина D1 в разные фазы клеточного цикла и многообразными регуляторными механизмами, опосредованными различными сигнальными каскадами [14]. По данным Z. Li et al. [40], большинство опухолей с амплификацией CCND1/высоким уровнем экспрессии циклина D1 имеет люминальный В подтип РМЖ, тогда как опухоли базально-подобного типа характеризуются потерей экспрессии белка, что свидетельствует о важном вкладе экспрессионного статуса циклина D1 в развитие опухолей данного молекулярного варианта.

Взаимосвязь циклина D1с эффективностью тамоксифена

Антиэстрогенные эффекты тамоксифена реализуются за счет конкурирующего с эстрадиолом связывания с цитоплазматическими ERα и/или ERβ. В противоположность комплексу эстроген-рецептор комплекс рецептор-тамоксифен не стимулирует синтез ДНК в ядре, что приводит к аресту клеточного цикла [41]. Поскольку тамоксифен опосредованно вовлечен в регуляцию клеточного цикла, есть основания полагать, что гиперэкспрессия циклина D1 может определять рост рецептор-позитивных опухолей молочной железы, устойчивых к антиэстрогенам. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что индукция гиперэкспрессии циклина D1 в культурах эстроген-позитивных опухолевых клеток отменяет антионкогенный эффект анти-эстрогенов, что является потенциальным механизмом резистентности [42, 43]. Для выявления потенциальных генов, ассоциированных с резистентностью к тамоксифену K.J. Huber-Keener et al. сравнили транскриптом тамоксифен-резистентных и тамоксифен-чувствительных клеточных линий РМЖ. Авторы показали, что тамоксифен-резистентные клетки характеризуются высоким уровнем экспрессии гена CCND1 [44].

Проведенные клинические исследования показали, что высокий уровень экспрессии циклина

D1 является маркером резистентности к тамоксифену [45, 46], что согласуется с данными экспериментальных работ. Ранее нами также был изучен уровень экспрессии циклина D1 у больных с рецептор-позитивным РМЖ, получавших терапию тамоксифеном, однако существенных корреляций с эффективностью лечения выявлено не было [47]. Вместе с тем было показано, что высокий уровень экспрессии циклина D1 ассоциирован с гетерогенным характером распределения ERα в опухоли [48].

Пути преодоления резистентности к тамоксифену на основе исследований циклина D1

В настоящее время активно ведется поиск новых подходов, направленных на преодоление резистентности к гормонотерапии, которые связаны с изучением циклинов и циклин-зависимых киназ как молекулярных мишеней противоопухолевого лечения. Так, в исследовании J. Xing et al. изучена роль митохондриального белка класса гистоновых деацетилаз сиртуина 4 (SIRT4) в MCF7 и T47D клеточных линиях РМЖ, леченных тамоксифеном. Авторы показали, что SIRT4 блокирует транскрипцию и трансляцию MYC и CCND1 в опухолевых клетках посредством STAT3 сигнального пути. Полученные данные свидетельствуют о важной роли SIRT4 в механизмах чувствительности ER-позитивных опухолей к тамоксифену и необходимости его дальнейшего исследования [49].

Экспериментальные исследования последних лет показали, что тамоксифен в комбинации с нестероидными противовоспалительными препаратами (аспирин) ингибируют экспрессию регуляторных белков c-myc, рецептора прогестерона и циклина D1 и подавляют рост тамоксифен-резистентных MCF-7 клеточных линий РМЖ [50]. Полученные данные свидетельствуют о том, что аспирин обладает противоопухолевым эффектом, который реализуется посредством ингибирования активности циклинов и циклин-зависимых киназ. Авторы отмечают, что раскрытие возможных механизмов действия аспирина, определяющих чувствительность к тамоксифену, является одним из перспективных направлений исследования.

Интерес представляют данные о роли серин-треонин киназы Aurora-A (Aur-A) в механизмах чувствительности к тамоксифену. Показано, что истощение данного белка, который вовлечен в процессы регуляции митоза и клеточного цикла, повышает чувствительность эстроген-позитивных клеточных линий РМЖ к тамоксифену [51]. В работе продемонстрировано, что селективный ингибитор Aur-A MLN8237, который в настоящее время проходит клинические испытания, синергично взаимодействует с тамоксифеном и ингибирует рост тамоксифен-резистентных клеточных линий. Кроме того, Aur-A индуцирует активность ERa и CCND1 посредством фосфорилирования эстроге- нового рецептора по аминокислотным остаткам Ser167 и Ser305, что рассматривается в качестве Aur-A-опосредованного механизма развития резистентности к тамоксифену.

Наиболее перспективным подходом к преодолению гормональной резистентности является использование ингибиторов циклин-зависимых киназ, механизм действия которых обусловлен селективным подавлением комплекса циклин D1-Cdk4/6 [52, 53]. Палбоциклиб (palbociclib) представляет собой пероральный высокоселективный низкомолекулярный ингибитор циклин-зависимых киназ, один из первых Cdk4/6, для которого была доказана противоопухолевая активность in vitro. R.S. Finn et al. продемонстрировали синергичный механизм действия палбоциклиба и тамоксифена в эстроген-позитивных линиях клеток РМЖ [54]. Результаты рандомизированного, мультицентрового исследования III фазы PALOMA-3, представленного в 2016 г., показали, что применение фулвестран-та в комбинации с палбоциклибом у больных с рецептор-позитивным HER2-негативным метастатическим РМЖ позволяет значительно увеличить показатели выживаемости без прогрессирования по сравнению со схемой фулвестрант плюс плацебо, причем независимо от степени гормональной резистентности, уровня экспрессии ER/PR и статуса мутаций PIK3CA [55]. По итогам успешных клинических исследований MONALEESA-2 и MONARCH-1 еще два ингибитора Cdk4/6 – рибоциклиб (ribociclib) и абемакиклиб (abemaciclib) – получили одобрение FDA в качестве препаратов первой линии для лечения пациенток с рецептор-позитивным HER2-негативным метастатическим РМЖ в комбинации с антиэстрогенной терапией [53]. Стоит отметить, что персонализированное назначение палбоциклиба и рибоциклиба и абемакиклиба для такой категории больных стало возможным при наличии амплификации CCND1 в опухоли по результатам комплексного теста геномного профилирования FoundationOne CDx, одобренного FDA в 2017 г. [56]. В Российской Федерации стандарты лечения больных с рецептор-позитивным HER2-негативным метастатическим РМЖ включают палбоциклиб и рибоциклиб.

Новым витком этих исследований является поиск маркеров чувствительности и прогноза эффективности ингибиторов Cdk4/6 в сочетании с антиэстро-генными препаратами. Разрабатываются подходы, которые позволят одновременно блокировать Cdk2 и Cdk4/6 для повышения эффективности терапии ингибиторами циклин-зависимых киназ.

Заключение

Нарушение контроля над клеточным циклом является неотъемлемой частью развития опухолевого процесса. Поэтому факторы, вовлеченные в регуляцию контроля фазового перехода клетки – циклины и циклин-зависимые киназы, – рассматриваются в качестве перспективных терапевтических мише- ней. Накопленные к настоящему времени данные экспериментальных и клинических исследований циклина D1, а также результаты собственных наблюдений диктуют необходимость дальнейшего