Роль фетоплацентарных белков в регуляции продукции интерлейкина-2 наивными Т-клетками и Т-клетками памяти

Известно, что физиологически протекающая беременность сопровождается изменениями, направленными на формирование иммунной толерантности к полуа логенному эмбриону. Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунной толерантности является супрессия Т-клеточной памяти в условиях постоянного воздей ствия антигенов эмбрионального происхождения [Кудряшова. Гасанова. 2011; Кадырова, 2014].

В последние годы было показано, что уровень функциональной активности Т-клеток определяется стадией их дифференцировки. характеризую-щейся различной экспрессией ряда функциональных и адгезионных молекул [Sallusto et aL 2004]. В литературе имеются единичные работы по дифференцировке Т-клеток памяти при неосложнен-

€> Заморина С. А, Литвинова Л. С . Юрова К А, Дунец Н. А, Хаумахмакеа О. ПТимганова В П, Бочкова М. С .Храмцзв П. В, Раев М. Б, 2017

ной беременности [Кадырова. 2014]. а данные о функциональной активности Т-клеток памяти под воздействием белков зоны беременности отсутствуют. В то же время, очевидно, что при неосложненной беременности в периферической крови действуют факторы, приводящие к снижению активности циркулирующего пула Т-клеток памяти, способных к осуществлению антиген-специфичес-ких цитотоксических реакций адаптивного иммунитета в отношении антигенов эмбрионального происхождени я.

В 2008 г. методами протеомики продемонстрировано, что лишь несколько молекул регулируют иммунную толерантность матери среди них - трофобластический pl-гликопротеин (ТЕГ), наряду с хорионическим гонадотропином (ХГ) и альфа-фстопро-теином (АФП) [Dong et al.. 2008]. Эти белки позиционируются как иммуносупрессоры, и ряд их эффектов в отношении актуальных клеточных субпопуляций, вовлеченных в формирование иммунной толерантности, активно изучается [Martinez et aL 2013; Заморила. Раев. 2015; Damen et al, 2016].

Исследование дифференцировки клеток памяти - методически довольно сложный процесс. Экспрессия различных изоформ молекулы CD45 позволяет разделить Т-лимфоциты на наивные Т-клстки и Т-клстки памяти. Молекула CD45 является трансмембранной тирозиновой протсинфосфа-тазой, а ее экспрессия на иммунокомпетентных клетках признана критическим регулятором сигнализации, опосредованной Т-клеточным рецептором (TCR) [Mustelin et al., 2003; McNeill et aL 2007].

Дифференцировка Т-клеток затрагивает состав внеклеточного домена CD45: в наивных клетках это полная комплектация (CD45RA, 220 кДа), по мере антигензависимой дифференцировки ряд доменов теряется, а продукт конечной модификации обозначают как CD45RO (180 кДа). Т-лимфоциты, экспрессирующие CD45RA+, позиционируются как наивные Т-клетки, а экспрессирующие CD45RO+ -как «примированные» Т-клетки памяти.

Наивные Т-клетки, экспрессирующие высокомолекулярные изоформы CD45, имеют высокую фосфата зную активность и поддерживают Т-клеточный рецептор (TCR) в примированном состоянии для распознавания антигена [McNeill et aL, 2007]. Процесс активации наивных клеток довольно сложен и требует вовлечения TCR и кости-мулирующих молекул (CD28 и др ). Переход к низкомолекулярным изоформам — CD45RO при активации Т-клеток снижает фосфатазную активность рецептора CD45 и. как полагают, способствует ослаблению Т-клеточной сигнализации [Holmes, 2006]. В свою очередь, быстрый и усиленный ответ CD45RO клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функциональным отличием от их «наивных» предшест венников [Elyaman el. al., 2008; Селедцов и др., 2010].

Известно, что активация Т-лимфоцитов тесно связана с аутокринной продукцией интсрлсйкина-2 (ИЛ-2), который, в свою очередь, является одним из ключевых цитокинов, запускающим пролиферацию Т-клеток и их дифференцировку,

В связи с вышесказанным, целью исследования является изучение роли ТБГ, ХГ и АФП в регуляции продукции ИЛ-2 изолированными CD45RA¹ и CD45RO⁺- клетками в системе in vitro.

Материалы и методы

Объекты исследования. В работе использовали фракционированные мономуклеары периферической крови (МПК) практически здоровых доноров, которыми являлись небеременные женщины репродуктивного возраста (п=8). МПК получали центрифугированием в градиенте плотности фи-колл-верографина (1.077 г/см³) («Pharmacia», Швеция), после чего клетки отмывали и подвергали воздействию фетоплацентарных белков. В качестве контроля применяли пробу, где вместо белков добавляли ГШС.

Сепарирование CD45RA⁺ и CD45RO⁺- клеток. Для получения монокультур наивных Т-клеток (CD45RA”) из суспензии МПК был использован метод иммуномагнитной сепарации, в основе которого лежит технология MACS® («Miltenyi Biotcc» Германия), основанная на использовании суперпарамагнитных биодеградируемых частиц MACS MicroBeads, конъюгированных с моноклональными антителами. Добавленные к взвеси клеток MicroBeads/CD45RA-4acn

Выделенные клетки с фенотипом CD45RA1 или CD45RO+ отмывали в среде RPMI-1640 («Sigma-Aldrich», США), затем оценивали их количество с помощью автоматического счётчика клеток (Countess™ Automated Cell Counter, «InVitrogen», США) с использованием красителя Tiypan blue 0.4% («InVitrogen». США). Жизнеспособность составляла не мснсс 95-98% от общего числа клеток. Отсутствие моноцитов (CD 14^) и В-лимфоцитов (CD19+) в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток до культивирования подтверждали с помощью анализа поверхностных маркеров на проточ- ном цитофлуориметре MACS Quant CMillenyi Biolec”, Германия). согласно протоколам производителей. В эксперименте использовали клеточные культуры, содержание CD3+CD45RA+CD14'CD19' и CD3”CD45RO+CD14'CD19' Т-клсток в которых составляло в среднем 98.5 ± 1.5%.

Культивирование CD45RA⁺ и CD45RO⁺-клеюк CD45RA⁺ или CD45RO^ клетки (1^10^ кл/мл) культивировали Б 48-луНОЧНЫХ планшетах в среде RPMI-1640 («Sigma-Aldrich», США). с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сы-воротки - ЭТС («Sigma». США). 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США), 2 мМ L-глутамина («ICN Ph.». США) в течение 48 ч. при 37°С во влажной атмосфере. содержащей 5% СО₂.

В работе использовали физиологические концентрации фетоплапентарных белков, соответствующие нормальной беременности — для ТБГ (получен в ИЭГМ УрО РАН Патент РФ № 2367449) -1 и 10 мкг/мл [Посисеева. Назаров, Татаринов. 2004]. для ХГ (Московский эндокринный завод) 10 и 100 МЕ/мл [Со1е: 20121 ДЛЯ АФП («Биалекса», Россия) 10, 50, 150 Ед/мл [Gagnon et al., 2008].

В качество активатора Т-лимфоцитов использовали T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ас/Exp) («MiltenyiBiotec», Германия) - антибио-тиновые частицы MACSiBead™ с биотинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+ человека. Нагруженные антителами частицы MACSiBead™ имитируют присутствие антигенпрезентирующих клеток и активируют Т-клеткн. Реагент Ас/Exp добавляли в пробы в количестве 5

мкл, которые содержали - 0.5х106 нагруженных антителами MACSiBead™ частиц. Соотношение клеток и активирующих частиц составляло 1:2.

Оценка концентрации ИЛ-2. Содержание ИЛ-2 в культуральных супернатантах оценивали им му коферментным методом при помощи тест-систем «Вектор-Бест», Россия. Измерение оптической плотности производили на многоканальном спектрофотометре Biohit ВР 800 (Финляндия).

Статистическая обработка данных проводилась С помощью парного /-критерия Стьюдента. Данные на рисунках представлены в виде М±о.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что через 48 ч. инкубации в интактных пробах CD45RA+ Т-лимфоцитов содержание ИЛ-2 в супернатантах клеточных культур было в 5.9 раз больше, чем в популяции CD45RO+-клеток (17.2±16.8 пг/мл; 2.88± 2.55 пг/мл, соответственно).

Добавление Т-клеточного активатора способствовало значительному увеличению концентрации ИЛ-2 в среде культивирования: в популяции CD45RA Т-лимфоцитов - в 21.17 раза (р()<0.05), а в культуре CD45RO" - в 86 раз (рЮ<0.05) (364.33±31.16 пг/мл; 286.4±52.55 пг/ мл, соответственно).

В целом, субпопуляции CD45RA+ и CD45RO” секретировали одинаковый уровень ИЛ-2, достоверных различий между субпопуляциями не было обнаружено (рисунок).

Влияние фетоплацентарных белков на продукцию ИЛ-2 изолированными CD45RA+ и CD45RO+-клетками (п=8)

Установлено, что на уровне наивных Т-клеток памяти (CD45RA4") стимулирующий эффект на продукцию ИЛ-2 оказывал ХГ (10 и 100 МЕ/мл) и АФП (100 Ед/мл), но не ТБГ. Известно, что ХГ, являясь плацентарным аналогом лютеотропного гормона, в физиологических условиях проецируется после оплодотворения клетками трофобласта. Гормон отличается широким спектром биологического действия, регулируя стероидогенез плаценты и плода, а также оказывая эффекты на уровне иммунной системы [Schumacher el al., 2009]. Максимальная концентрация ХГ в период гестации (—100 МЕ/мл) совпадает с экспрессией антигенов МНС I класса на клеточной поверхности эмбриона (I триместр). распознавание которых, как правило, приводит к процессам иммунного отторжения. В силу этого факта. ХГ считается одним из основных факторов. формирующих иммунную толерантность во время беременности. Известно, что ХГ контролирует дифференцировку Т-регуляторных лимфоцитов и ИЛ-17-продуцирущих лимфоцитов, а также активность NK-. NKT-клеток и фагоцитов [Замо-рина, 2013]. Тем не менее, роль ХГ в процессах дифференцировки Т-клеток памяти остается не исследованной. Тот факт, что ХГ повышает продукцию ИЛ-2 как наивными Т-клетками, так и при-мированными Т-клетками памяти, свидетельствует о том, ЧТО гормон активно участвует В регуляции активности этих субпопуляций.

АФП - это гликопротеин, синтезируемый в фетальной печени. В норме АФП может обнаруживаться в сыворотке эмбриона, начиная с 4-й недели беременности. Его концентрация достигает пика междуг 12 и 16-й неделями и затем постепенно снижается вплоть до рождения. Так как АФП проникает через плаценту, он может обнаруживаться в довольно высокой концентрации в сыворотке крови матери, достигая максимума между 32- и 36-й неделями беременности. Уровень АФП служит важным показателем при мониторинге антенатального периода. Экспериментальные исследования свидетельствуют об иммуносупрессорной активности этого белка [Черешнев и др., 2004]. В нашем исследовании показано, что АФП в высокой концентрации, соответствующей III триместру (100 Ед/мл), повышал продукцию ИЛ-2 только наивными Т-клетками памяти.

В отношении примированных Т-клеток памяти (CD45RO ) показано, что стимулирующий эффект демонстрировали ХГ (10 и 100 МЕ/мл) и ТБГ (1 и 10 мкг/мл), но не АФП (рисунок).

ТБГ - онкофета льный белок, продуцируемый клетками цито- и синцитиотрофобласта во время беременности. В динамике беременности уровень ТБГ постепенно растет и достигает значений 200-

400 мкг/мл к III триместру, и он становится доминантным белком в сыворотке беременных. В то же время в сыворотке крови плода его уровень не превышает 1-2 мг/л [Посисеева. Назаров. Татаринов, 2004].

ТБГ вносит существенный вклад в иммунные реакции матери, участвуя в формировании иммунологической толерантности к плоду7, однако этот аспект его действия в отношении Т-клеток иммунной памяти не изучен. В нашем исследовании продемонстрировано. что ТБГ в концентрациях, экстраполированных с I триместра беременности, повышает продукцию ИЛ-2 примированными Т-клетками памяти.

Ключевая функция ИЛ-2 на уровне исследуемых субпопуляций заключается в обеспечении перехода антиген-акгивированных CD4 и CD8 -лимфоцитов из G1 в S-фазу клеточного цикла, что, в конечном итоге, приводит к их пролиферации [Snares el al.. 2002; Литвинова и др.. 2014]. В целом, ИЛ-2 способствует переходу СВ45КА⁺-клеток в CD45RO -клетки, которые непосредственно реализуют иммунный ответ на специфический антиген. что и является их важнейшим функциональным отличием от их «наивных» предшественников. В то же время, очевидно, что активация клеток памяти в период беременности - явление неоднозначное, поскольку если эти клетки активируются на фетальные антигены, то это может привести к отторжению эмбриона. Можно предположить, что в сыворотке беременных женщин есть факторы, нивелирующие эту активацию. В частности, известно, что |3-эстрадиол в концентрациях, соответствующих III триместру беременности, снижает экспрессию генов G/M и hTERE а также и уровень ИЛ-2 в супернатантах [Хазиахматова, 2016]. По-видимому. физиологический смысл этих изменений, индуцированных p-эстрадиолом, подразумевает ограничение агрессивной иммунной реакции при вынашивании.

Кроме этого, при интерпретации данных необходимо учитывать фенотипическое разделение Т-клеток памяти на CD4 и CD 8 . Активация наивных CD8 Т-лимфоцитов завершается их трансформацией в цитотоксические Т-лимфоциты. Одновременно фенотип CD4+CD45RO+ объединяет в себе активированные Т-клетки памяти. Т-регуляторные лимфоциты и ИЛ-17-продуцирующие лимфоциты. Важно отметить что ИЛ-2 необходим для развития Т-регуляторных лимфоцитов, увеличение количества которых ассоциировано с успешной беременностью [Shumacher el aL 2009]. Таким образом, повышение уровня ИЛ-2, секретируемого таргетными суб- популяциями Т-клеток, имеет неоднозначное им-мунорегуляторное значение.

В ситуации in vivo уровень ИЛ-2 с наступлением беременности не изменяется в сравнении с небеременными, но повышается в случае спонтанного аборта [Vassiliadis et at, 1998]. Как известно, основными продуцентами ИЛ-2 являются CD4⁺ лимфоциты, которым в этой ситуации он необходим для дифференцировки в Т-регуляторные лимфоциты. Вероятно, с самых ранних сроков беременности, на системном уровне происходит активация СВ4⁺-клеток под действием фетальных антигенов. необходимая для формирования иммунной толерантности. В то же время, при патологии проницаемость плацентарного барьера усиливается и это приводит к увеличению количества фетальных антигенов в кровотоке матери и соответственно, ведет к повышению уровня ИЛ-2 у женщин с угрозой прерывания беременности.

Для понимания процессов формирования иммунной толерантности важно понять, какова роль фетоплацентарных белков в регуляции иммунной памяти? В данной работе продемонстрировано, что ХГ в концентрациях, соответствующих таковым при беременности, повышает продукцию ИЛ-2 как наивными Т-клетками, так и примированными Т-клетками памяти, АФП стимулирует продукцию ИЛ-2 только в концентрации, соответствующей III триместру беременности и только на уровне наивных Т-клеток, вероятно, способствуя их трансформации в активированные Т-клетки памяти, В то же время, ТБГ в концентрациях, соответствующих I триместру (1 и 10 мкг/мл), стимулировал продукцию ИЛ-2 активированными Т-оетками памяти. Вероятно, в данном случае, ТБГ преимущественно воздействует на CD4+-лимфоциты, которые под воздействием аутокринного ИЛ-2 дифференцируются в Т-регуляторные клетки. В целом, фето плацентарные белки оказывают преимущественно стимулирующее действие на продукцию ИЛ-2 наивными Т-клетками и Т-клетками памяти,

Исследование поддержано грантом РФФИ р_а 16-44-590049 и субсидией «Организация проведения научных исследований» (№ 603, БФУ им, И. Канта).