Роль генов общего стрессорного ответа в формировании бактериальной персистенции

Ключевым свойством любой популяции является её генотипическая и фенотипическая гетерогенность. Это свойство обеспечивает выживание популяции при воздействии многочисленных стрессов в меняющихся условиях среды [Тимофеев-Ресовский, Воронцов, Яблоков, 1977; Олескин, 2001; Миркин, Наумова, 2005]. Одним из примеров фенотипической гетерогенности бактериальных популяций являются опубликованные в последнее время данные об их субпопуляционной структуре по признаку персистенции [Rotem et al., 2010; Jong, Haccou, Kuipers, 2011; Maisonneuve, Gerdes, 2014; Bergh, Fauvart, Michiels, 2017].

Персисторы – это бактериальные клетки, которые в относительно небольшом количестве присутствуют в любой популяции и за счет значительного замедления скорости метаболических процессов (дормантное состояние) характеризуются пониженной чувствительностью к стрессорному воздей- ствию различных внешних физико-химических факторов [Lewis, 2010; Maisonneuve, Gerdes, 2014]. При этом сама субпопуляция персисторов неоднородна и представляет собой континуум микросубпопуляций, качественно и количественно различающихся по отношению к различным типам стрессоров [Tkachenko et al., 2014; Zhang, 2014; Bergh, Fauvart, Michiels, 2017]. Таким образом, персистенция представляет собой инструмент биологической «страховки» (bet hedging) бактериальной популяции от вымирания в условиях изменчивости среды [Carey, Goulian, 2018].

Переход бактериальной клетки из «нормального» состояния в дормантное обеспечивается за счет случайных флуктуаций около некоторого порогового уровня содержания в ней регуляторных молекул, относящихся к механизмам общего стрессор-ного ответа [Rotem et al., 2010]. Другой механизм представляет собой собственно стрессорный ответ

в виде индукции упомянутых клеточных систем, что приводит к возрастанию количества персисто-ров и способствует выживанию популяции в целом [Lewis, 2010; Maisonneuve, Gerdes, 2014]. Поскольку в естественных условиях бактерии часто испытывают стрессорные воздействия, можно говорить о значительной роли механизмов общего стрессорного ответа в персистообразовании. Наибольшее количество персисторов при периодическом культивировании образуется в стационарной фазе роста [Lewis, 2010; Bergh, Fauvart, Michiels, 2017], наиболее близкой к естественным условиям [Ленгелер, Древс, Шлегель, 2005]. Исходя из этого, переход периодической культуры бактерий в стационарную фазу часто используется в качестве экспериментальной модели персистообразования в природной популяции.

С использованием этого подхода нами была изучена роль в бактериальной персистенции генов rpoS, rmf, relA и spoT, относящихся к механизмам общего стрессорного ответа. Известно, что ген rpoS кодирует σS-субъединиицу РНК-полимеразы. Гены, промоторы которых имеют сродство к данной σ-субъединиице, объединены в структуру rpoS-регулона и участвуют в адаптации к стрессам преимущественно при переходе в стационарную фазу роста [Hengge-Aronis, 2002; Ткаченко, 2012]. Гены relA и spoT кодируют (p)ppGpp-синтетазу и (p)ppGpp-синтетазу/гидролазу соответственно. При этом для SpoT сигналом для синтеза (p)ppGpp является отклонение скорости трансляции от максимальной, тогда как RelA реагирует на истощение в клетках хотя бы одной из аминокислот. Незаряженные тРНК, связываясь с аминоацильным центром рибосом, служат для RelA в качестве сигна- ла, индуцирующего синтез (p)ppGpp. Первоначально (p)ppGpp был описан как сигнал стресса голодания и отнесен к категории алармонов, участвующих в адаптации к аминокислотному голоданию. Однако в настоящее время показано его участие в регуляции множества процессов в бактериальной клетке, связанных с ее ростом, адаптацией к стрессам, вторичным метаболизмом, персистенцией, клеточным делением, подвижностью, биопленкообразованием и вирулентностью. Под регуляторным контролем (p)ppGpp находятся около 500 генов, и этот список постоянно пополняется [Hauryliuk et al., 2015; Ткаченко, 2018]. Одним из них является ген стационарной фазы rmf [Izutsu, Wada, Wada, 2001]. Продукт его экспрессии, белок RMF, ингибирует трансляцию, превращая рибосомы в неактивную димерную форму [Wada, 1998].

В связи со своей практической значимостью, наиболее полно изученной является персистенция к антибактериальным препаратам. Находясь в дормантном состоянии, персисторы обладают множественной антибиотикотолерантностью, благодаря чему способны возобновлять рост после прекращения воздействия антибиотиков. Это дает основание рассматривать их в качестве основной причины рецидивов инфекционных заболеваний [Lewis, 2010; Maisonneuve, Gerdes, 2014]. Таким образом, изучение персистенции имеет важное значение для разработки новых антибактериальных средств.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовали штаммы Escherichia coli (табл. 1) .

Таблица 1

Штаммы, использованные в работе

Штамм	Генотип	Источник
BW25141	F-, Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), Δ(phoB-phoR)580, λ-galU95, ΔuidA3::pir+, recA1, endA9(del-ins)::FRT, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514	Северинов К.В. [Datsenko, Wanner, 2000]
EAT01	как BW25141, но ∆rmf	Tkachenko et. al., 2017
EAT03	как BW25141, но ∆rpoS
SRY1	как BW25141, но ∆relA	Коллекция лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН
SRY2	как BW25141, но ∆relA ∆spoT
EAT16	как BW25141, но λRZ5rpoS742::lacZ
EAT17	как BW25141, но λRS45rmf39::lacZ

Штаммы высевали на 5 мл питательной среды LB («Sigma», США) с добавлением соответствующих антибиотиков: ампициллин 25 мкг/мл («MP Biomedicals», Франция), канамицин 25 мкг/мл («Синтез», Россия). После 7 ч. культивирования в термостате при 37ºС бактериальную культуру переносили в соотношении 1:1000 (по объему) на 50 мл LB в колбу Эрленмейера (250 мл) с добавлением антибиотиков. Культивировали 16 ч. в термо- статируемом шейкере («GFL 1092», Германия) при 37ºС, 120 об/мин. Далее, для проведения эксперимента культуру переносили в 50 мл свежей среды LB в колбу Эрленмейера (250 мл), доводя оптическую плотность (OD600) культуры до 0.1 (соответствует 0 ч. культивирования). Инкубировали в термостатируемом шейкере при 37ºС, 120 об/мин. Биомассу клеток оценивали по оптической плотно- сти на спектрофотометре UV1280 («Shimadzu», Япония).

Экспрессию генов определяли на транскрипционном уровне с помощью двух методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с предварительным проведением обратной транскрипции и репортерных генных слияний. Репор-терное слияние rpos::lacZ трансдуцировано из штамма RO200 [Muffler et al., 1997]. Репортерное слияние rmf::lacZ сконструировано в соответствии с протоколом, предложенным R.W. Simons, F. Houman, N. Kleckner [1987]. Уровень экспрессии определяли методом Миллера [Миллер, 1976].

РНК выделяли из бактериальной культуры родительского штамма BW25141 (табл. 1) с помощью коммерческого набора «GeneJET Purification Kit» («Thermo Fisher Scientific», США) согласно протоколу. Концентрацию РНК в полученных пробах измеряли при OD260, качество проб оценивали по OD260/OD280 и OD260/OD230 при помощи спектрофотометра NanoDrop 2000 («Thermo Fisher Scientific», США) и методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием [Кузнецов, Кузнецов, Романов, 2012; Великов, 2013]. Пробы обрабатывали ДНКазой, входящей в состав коммерческого набора «TurboTM DNase» (2U/мкл) («Thermo Fisher Scientific»,США). В качестве матрицы для обратной транскрипции использовали 100 нг суммарной РНК. Также в состав реакционной смеси входили: праймеры Random 9 («Евроген», Россия) 5мкМ, смесь dNTPs («Thermo Fisher Scientific», США) 1 мМ, ревертаза 200U «Thermo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase» с буфером («Thermo Fisher Scientific», США). Реакцию проводили при 42°С 1 ч. с предварительной инкубацией при комнатной температуре 10 мин. и с последующей инактивацией при 70°С 10 мин. Синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени. Праймеры подобраны с помощью программы PrimerSelect версия 7.1.0 (DNASTAR, Inc.) и представлены в табл. 2. Реакцию проводили при помощи коммерческого набора «qPCRmix-HS SYBR» («Евроген», Россия) на амплификато-ре «CFX96 RT Systems C1000 Thermal Cycler» («BioRad», США). Процедура ПЦР включала начальную денатурацию 95°С 5 мин., далее следовали 40 циклов из последовательно повторяющихся шагов: денатурация – 95°С 15 сек., отжиг праймеров – 60°С 15 сек., элонгация – 72°С 15 сек. После завершения ПЦР строили кривую диссоциации для оценки наличия димеров праймеров и других артефактов. Эффективность реакций и пороговые циклы устанавливали при помощи программы LinRegPCR (2014.x) [Ruijter et al., 2009]. Полученные данные нормализованы с использованием геномной ДНК [Demidenok, Kaprelyants, Gon- charenko, 2014].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета стандартных программ STATISTICA 5.0 (StatSoft, Inc.). Повторность экспериментов 3-кратная.

Таблица 2

Праймеры, использованные для ПЦР в реальном времени

ген	Последовательность праймеров
rpoS	5’ – TGAAGATGCGGAATTTGATGAGAA – 3’ 5’ – TCGGCCGTTAACAGTGGTGAA – 3’
rmf	5’ – CGCGCACATCAACGTGGTTATCA – 3’ 5’ – GCCAGCCTCCCAGCCATTGT – 3’
relA	5’ – GCTGAAGGCGTTAAAGCGGAAGTGT – 3’ 5’ – CGGCAGGTGGCGATAGTGAGTGT – 3’
spoT	5’ – GCGCACGCTGGGCTCACTT – 3’ 5’ – GCGCGGCTTTCACCACTTCTTT – 3’

Результаты

Для выяснения роли генов rpoS, rmf, relA и spoT в бактериальной персистенции нами определена экспрессия каждого из них на транскрипционном уровне. Полученные результаты представлены в сопоставлении с данными о частоте персистенции родительского штамма и делеционных мутантов по исследуемым генам. Нокаутные штаммы в целом демонстрируют более низкие значения частоты персистенции по сравнению с контролем при переходе бактериальной культуры в стационарную фазу роста и собственно в стационарной фазе.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспрессия гена rpoS на транскрипционном уровне достигает максимума при переходе в стационарную фазу на 8 ч. культивирования, а также в глубоком стационарном состоянии на 72 ч. Эти результаты согласуются с данными о частоте персистенции нокаутного штамма ∆ rpoS , демонстрирующего наибольшее снижение частоты персистенции по сравнению с родительским штаммом также при переходе культуры в стационарную фазу роста (8–24 ч.). После 24 ч. различие в значениях частоты персистенции между мутантом и родителем снижается, однако уровень персисторов в культуре нокуатного штамма ∆ rpoS остается сравнительно низким (рис. 1).

Наиболее высокие значения экспрессии генов relA и spoT наблюдаются в экспоненциальной фазе и при переходе в стационарную фазу (рис. 3). Ген rmf демонстрирует максимум экспрессии также при переходе в стационарную фазу (8–24 ч.) (рис. 2). Однако мутанты ∆rmf, ∆relA и ∆relA∆spoT показывают максимальное снижение частоты персистенции в поздней стационарной фазе (48–72 ч.). Наиболее вероятно, что активация экспрессии генов relA и spoT в стационарной фазе происходит преимущественно на трансляционном уровне, как ранее нами показано в отношении rmf [Tkachenko et al., 2017].

Полученные нами результаты показали, что исследуемые гены rpoS, rmf, relA и spoT вовлечены в частота

BW25141°D»-600 пеР™стенЧии

ArpoS ■-

-е- экспрессия rpoSJacZ

-■■ уровень rpoS мРНК

ODeoo чаСТ0ТЭ персистенции

-•- экспрессия rmf::lacZ

-■-уровень rmf мРНК

BW25141 -•- &rmf ■»

Рис. 2 . Роль гена rmf в персистенции E. coli

Рис. 1 . Роль гена rpoS в персистенции E. coli

частота уровень персистенции уровень spoT мРНК

ODeoo

BW25141 ♦

Are/Д *

ODeoo ЧаСТ0Та

Рис. 3. Роль генов relA (А) и spoT (Б) в персистенции E. coli

Обсуждение

Участие генов rpoS, rmf, relA и spoT в регуляции бактериальной персистенции связано с ком- регуляцию формирования персисторных клеток E.coli при переходе в стационарную фазу и собственно в стационарной фазе.

BW25141. ^РСИСТеНЧИИ Дге/ДДброГ* *

плексным воздействием на клетки в этот период различных стрессоров, включая голодание, накопление метаболитов, закисление среды, недостаток кислорода и др. В этом отношении стационарная фаза сходна с естественными условиями обитания

[Ленгелер, Древс, Шлегель, 2005], активирующими механизмы общего стрессорного ответа [Ткаченко, 2012].

Результатом действия этих механизмов, к которым относятся действия изученных нами генов, может быть формирование состояния замедления скорости метаболических процессов (дормантного состояния), способствующего развитию персистенции [Lewis, 2010; Maisonneuve, Gerdes, 2014]. В частности, это может происходить под регуляторным контролем (p)ppGpp, который, согласно литературным данным, ингибирует транскрипцию генов rrn и тем самым снижает количество рибосом в клетке. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению интенсивности процесса трансляции [Ткаченко, 2012]. Помимо этого, (p)ppGpp, опосредованно активируя Lon-протеазы, высвобождает токсины, входящие в состав токсин-антитоксиновых систем [Maisonneuve, Castro-Camargo, Gerdes, 2013]. Токсины ингибируют различные клеточные процессы и способствуют формированию дор-мантного состояния клеток [Wen, Behiels, Devreese, 2013; Hall, Gollan, Helaine, 2017]. Ток-син-антитоксиновые системы впервые были описаны как факторы персистенции [Maisonneuve, Gerdes, 2014], в регуляции которых принимает участие (p)ppGpp. Его регуляторные функции распространяются также на rpoS -регулон, играющий значительную роль в адаптации к стрессам, формируемым при переходе в стационарную фазу роста. При этом (p)ppGpp индуцирует транскрипцию гена rpoS и повышает стабильность продукта его экспрессии [Ткаченко, 2012].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что максимальный уровень транскрипции гена rpoS совпадает по стадии культивирования с наибольшим снижением частоты персистенции мутанта ∆rpoS по сравнению с контролем и наблюдается при переходе в стационарную фазу. Таким образом, ген rpoS участвует в регуляции персистенции преимущественно при переходе в стационарную фазу роста.

Под регуляторным контролем (p)ppGpp находится также исследованный нами ген rmf. Основываясь на полученных результатах и ранее опубликованных данных [Tkachenko et al., 2017], можно прийти к заключению, что ген rmf вовлечен в регуляцию персистенции в поздней стационарной фазе, когда происходит активация его экспрессии преимущественно на трансляционном уровне. Участие rmf в персистенции согласуется с его функциональной активностью, направленной на ингибирование трансляции. При этом, продукт данного гена – белок RMF – способствует остановке роста клеток, блокируя функции рибНосаомос.новании описанных выше данных можно говорить о значительной роли (p)ppGpp в форми- ровании персисторных клеток, что объясняет значительное снижение частоты персистенции нока-утных штаммов ∆relA и ∆relA∆spoT в поздней стационарной фазе. Вместе с тем в экспоненциальной фазе мутанты демонстрируют более высокий уровень персистенции по сравнению с родительским штаммом. Это связано с мнимым завышением частоты персистенции нокаутных штаммов в этот период. При помощи фазово-контрастной микроскопии и LIVE/DEAD-окрашивания обнаружены значительные изменения морфологических свойств клеток мутантов в виде формирования нитей, состоящих из нескольких не разделившихся клеток (рис. 4). Это приводит к занижению данных при подсчете числа живых клеток методом высева и, следовательно, мнимому завышению значений частоты персистенции, определяемой методом I. Keren et al. [2004]. Последующее разделение нитей на отдельные клетки при переходе в стационарную фазу дает возможность объективно выявить снижение частоты персисторных клеток в нокаутных штаммах по сравнению с контрольным. Согласно ранее опубликованным данным [Shan et al., 2015], низкая внутриклеточная концентрация (р)ppGpp приводит к повышению активности полифосфатазы Ppx. В результате снижения концентрации полифосфатов ингибируется активность Lon-протеазы, для которой эти соединения являются коферментами. Это приводит к недостаточному гидролизу ингибитора клеточного деления SulA и проявляется в фенотипе в виде не до конца разделившихся клеток. Исходя из этого, гены relA и spoT, согласно результатам мутационного анализа, осуществляют регуляцию персистообразования преимущественно в поздней стационарной фазе, хотя этот вывод не нашел прямого подтверждения при анализе экспрессии relA и spoT на транскрипционном уровне, что требует проведения дополнительных исследований.

Рис. 4. Фенотип клеток штаммов BW25141и BW25141 ∆relA ∆spoT в экспоненциальной фазе роста (6 ч. культивирования)

Таким образом, на основании комплексной оценки данных определения уровня генной экспрессии методами репортерных генных слияний и ПЦР в реальном времени, сопряженной с обратной транскрипцией, в сопоставлении с результатами мутационного анализа показано участие генов стационарной фазы rpoS, rmf, relA и spoТ в формировании персисторного состояния клеток E. coli.

Работа выполнена в рамках государственного задания (номер госрегистрации темы: 01201353249, а также при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края (проект №16-44-590279 р_а).