Роль генов семейства Argonaute в эффектах активатора РНК-интерференции эноксацина на продолжительность жизни Drosophila melanogaster

Автор: Пакшина Н.Р., Яковлева Д.В., Уляшева Н.С., Прошкина Е.Н., Москалев А.А.

Журнал: Известия Коми научного центра УрО РАН @izvestia-komisc

Статья в выпуске: 6 (64), 2023 года.

Бесплатный доступ

Эпигенетические механизмы играют ведущую роль в регуляции генной экспрессии и координации биологических процессов, влияя на скорость старения и продолжительность жизни организма. Важную роль в реализации этих механизмов играют малые РНК, которые подавляют активность своих мишеней путем РНК-интерференции и обеспечивают противовирусную защиту. Эноксацин является уникальным индуктором факторов РНК-интерференции с потенциальной геропротекторной активностью. Установлено, что его эффекты опосредованы микроРНК, но возможно участие и других видов некодирующих РНК. В данном исследовании мы изучили влияние эноксацина на продолжительность жизни Drosophila melanogaster и впервые проанализировали вклад в его эффект генов семейства Argonaute, которые специфично обеспечивают биогенез и функционирование микроРНК, киРНК и пивиРНК.

Еще

Малые рнк, рнк-интерференция, эноксацин, продолжительность жизни, старение, гены argonaute, drosophila melanogaster

Короткий адрес: https://sciup.org/149143620

IDR: 149143620 | DOI: 10.19110/1994-5655-2023-6-103-114

Текст научной статьи Роль генов семейства Argonaute в эффектах активатора РНК-интерференции эноксацина на продолжительность жизни Drosophila melanogaster

Эпигенетика изучает наследуемые изменения экспрессии генов или клеточного фенотипа, не связанные с изменениями нуклеотидной последовательности генома. Эпигенетические механизмы включают в себя метилирование ДНК, модификацию РНК и гистонов, структуру хроматина и некодирующие РНК [1]. Предполагается, что нарушение их слаженной работы является одной из ведущих причин старения. Дисбаланс в эпигенетических механизмах вызывает обширные изменения генной экспрессии и состояние геномной нестабильности [2, 3].

Многочисленные исследования свидетельствуют о важной роли малых РНК в эпигенетической регуляции [1, 4, 5]. К данной группе некодирующих РНК относятся микроРНК, короткие интерферирующие РНК (киРНК), Piwi-взаимо- действующие РНК (пивиРНК), отличающиеся по размеру, функции и белкам Argonaute, с которыми они взаимодействуют. МикроРНК регулируют экспрессию генов с помощью РНК-интерференции - посттранскрипционного процесса путем нацеливания на специфические мРНК и последующего ингибирования трансляции и деградации этих молекул [1, 6]. Они участвуют в развитии организма, дифференцировке клеток, регуляции клеточного цикла, старении, метаболизме, апоптозе, и их экспрессия меняется при некоторых заболеваниях человека [1, 7]. КиРНК также осуществляют деградацию молекул-мишеней мРНК посредством РНК-интерференции. Кроме того, они участвуют в защите генома от активности мобильных генетических элементов и вирусов [8]. ПивиРНК описаны как важные регуляторы поддержания зародышевой линии. Они необходимы для подавления активности мобильных генетических элементов в зародышевых клетках [9], а также могут воздействовать на экспрессию генов посредством влияния на метилирование ДНК и модификации хроматина [10]. К белкам, обеспечивающим биогенез и функционирование малых РНК, относятся Drosha и представители семейства Dicer и Argonaute [11]. Имеются данные, указывающие на роль данных белков в регуляции стрессоустойчивости и продолжительности жизни (далее – ПЖ) модельных организмов [12].

Поиск терапевтических подходов, нацеленных на эпигенетические механизмы, является перспективной задачей современной биологии и медицины, так как изменения в этих механизмах имеют обратимый характер и тесно сопряжены с заболеваниями человека [13]. В настоящее время описан ряд веществ, обеспечивающих регуляцию метилирования ДНК, модификаций гистонов, транскрипционных регуляторов, которые способны влиять на скорость старения и предупреждать развитие возрастных патологических процессов [14-20]. Проводятся исследования, направленные на идентификацию низкомолекулярных соединений для ингибирования или активации экспрессии микроРНК [21, 22]. Эти молекулы также обладают потенциалом для замедления старения и предупреждения возраст-зависимых заболеваний [23–25].

Эноксацин является первым низкомолекулярным активатором факторов РНК-интерференции [21]. Данное соединение относится к семейству синтетических антибактериальных соединений на основе фторхинолонового скелета. Оно проявляет активность в отношении спектра грамотри-цательных и грамположительных бактерий [26]. Основной механизм его действия заключается в модификации процессинга микроРНК и усилении деградации мРНК посредством микроРНК и киРНК [21, 23, 27]. Но он также может влиять на функцию пивиРНК через микроРНК [28].

С использованием модели Drosophila melanogaster мы проверили геропротекторную активность эноксаци-на и оценили вклад конкретных путей биогенеза малых РНК в его эффект. Дрозофила в контексте данного исследования представляет собой уникальный модельный объект. У нее имеются белки семейства Argonaute, которые отвечают за биогенез конкретных типов малых РНК. Argonaute-1 (AGO1) необходим для синтеза и функционирования микроРНК, Argonaute-2 (AGO2) - для киРНК, бел- ки Argonaute-3 (AGO3), Aubergin (aub) и piwi осуществляют биогенез пивиРНК [29]. Для определения их роли мы сопоставили влияние эноксацина в разных концентрациях на ПЖ дрозофил линии дикого типа и дрозофил с нокдауном генов Argonaute, кодирующих эти белки.

Материалы и методы

Линии Drosophila melanogaster и получение особей с нокдауном генов Argonaute

Линии, использованные в работе, представлены в табл. 1. Они содержатся в коллекции лабораторных линий плодовых мушек Drosophila Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН.

Условия содержания и обработки эноксацином

Для содержания дрозофил использовали климатические камеры KBF720-ICH (Binder, Германия). Животных содержали при температуре +25 °С, относительной влажности воздуха 60 %, 12-часовом режиме освещения. Состав питательной среды, на которой содержали контрольных и опытных животных при проведении экспериментов, был адаптирован из работы Xia и de Belle [30]: вода - 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32.1 г, агар-агар – 5.2 г, глюкоза - 136.9 г; для снижения микробиологической нагрузки 5 мл 10 %-ного раствора нипагина, разбавленного в 96 %-ном этаноле, 5 мл 50 %-ной пропионовой кислоты.

Раствор эноксацина в концентрациях 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500 мкг/мл наносили на поверхность питательной среды дрозофил в количестве 30 мкл на пробирку. В качестве растворителя использовали 1 мкмоль/л раствор NaOH. В контроле на среду наносили только 1 мкмоль/л NaOH.

Анализ продолжительности жизни

Для анализа ПЖ дрозофил собирали в течение 24 ч после вылета имаго. С использованием наркоза углекислым газом (Genesee Scientific, США) мух усыпляли, сортировали по полу и рассаживали в пробирки по 30 особей. Самцы и самки жили раздельно. Начиная с первого дня жизни имаго ежедневно вели подсчет числа умерших особей, два раза в неделю мух переносили на свежую среду.

Результаты представляли в виде кривых дожития и рассчитывали медианную ПЖ (длительность жизни наиболее типичных представителей выборки) и возраст 90 % смертности (показатель максимальной ПЖ). При статистической обработке данных применяли непараметрические методы, так как распределение продолжительности жизни не подчиняется нормальному закону. Для сравнения функций дожития использовали критерий Колмогорова-Смирнова [31]. Для оценки достоверности различий по медианной ПЖ – критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона [32]. Для оценки статистической значимости различий максимальной ПЖ применяли метод Ванг-Аллисона [33]. Поправка Бонферрони использовалась для корректировки множественных сравнений [34]. Обработку данных проводили с помощью программы Statistica, версия 6.1 (StatSoft, США), статистической среды R, версия 2.15.1 (The R Foundation) и онлайн-приложения OASIS 2 (Online application for survival analysis) [35].

Линии Drosophila melanogaster , использованные для получения особей с РНК-интерференцией генов Argonaute

Drosophila melanogaster lines used to obtain individuals with RNA interference of the Argonaute genes

Table 1

Линии	Генотип	Описание	Источник, номер линии
Canton-S	Линия дикого типа		Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#64349)
P{CaryP} attP40	у[1] v[1]; P{y[+t7.7]=CaryP} Msp300[attP40]	Контрольная линия для линий с РНК-интерференцией	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#36304)
P{CaryP} attP2	y[1] v[1]; P{y[+t7.7]=CaryP}attP2	Контрольная линия для линий с РНК-интерференцией	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#36303)
RNAi-AGO1	y[1] v[1]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP. HM04006}attP2	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции AGO1 под контролем промотора UAS в векторе VALIUM1. Конструкция в третьей хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#31700)
RNAi-AGO2	y[1] sc[*] v[1] sev[21]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP.HMS00108}attP2	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции AGO2 под контролем промотора UAS в векторе VALIUM20. Конструкция в третьей хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#34799)
RNAi-AGO3	y[1] v[1]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP. HMC02938}attP40	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции AGO3 под контролем промотора UAS в векторе VALIUM20. Конструкция во второй хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#44543)
RNAi-piwi	y[1] v[1]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP. HMJ21827}attP40/CyO	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции piwi под контролем промотора UAS в векторе VALIUM20. Конструкция во второй хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#57819)
RNAi-aub (1)	y[1] v[1]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP. JF01390}attP2	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции aub под контролем промотора UAS в векторе VALIUM1. Конструкция во второй хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#31606)
RNAi- aub (2)	y[1] sc[*] v[1] sev[21]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TRiP.HMS00611}attP2	Экспрессирует дцРНК для РНК-интерференции aub под контролем промотора UAS в векторе VALIUM20. Конструкция в третьей хромосоме	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#33728)
GAL4-da	w[*]; P{w[+mW.hs]=GAL4-da.G32}2; P{w[+mW.hs]=GAL4-da.G32}3a	Повсеместная экспрессия GAL4	Центр линий дрозофил в Блумингтоне, США (#55849)

Результаты и их обсуждение

Влияние эноксацина на продолжительность жизни особей Drosophila mela-nogaster дикого типа

Мы изучили влияние активатора РНК-интерференции эноксацина на ПЖ дрозофил линии дикого типа Canton-S . У самцов в двух биологических повторностях из трех (табл. 2) наблюдали увеличение медианной ПЖ дрозофил на 8-20 % (p < 0.05) и возраста 90 % смертности на 3–12 % (p < 0.05) при применении вещества в концентрациях 10-500 мкг/мл. У самок при этих же концентрациях также обнаружен положительный эффект. Медианная ПЖ повысилась на 5-8 % (p < 0.05), а возраст 90 % смертности - на 3-12 % (p < 0.05). На основании наших результатов можно говорить о геропротекторном потенциале эноксацина. Этот результат согласуется с данными других авторов, где показано, что эноксацин продлевает жизнь нематодам [21]. Тем не менее положительный эффект не всегда воспроизводился во всех биологических повторностях и при их совмещении был выражен слабо (табл. 2, рис. 1).

Влияние нокдауна генов Argonaute на эффект эноксацина

Для изучения вклада генов семейства Argonaute в эффект эноксацина мы изучили его влияние на ПЖ особей Drosophila melanogaster с нокдауном генов семейства Argonaute , кодирующих белки

Таблица 2

Параметры продолжительности жизни особей Drosophila melanogaster линии Canton-S при обработке эноксацином

Table 2

Lifespan parameters of Drosophila melanogaster Canton-S lines treated with enoxacin

Повторность	C m	Самцы			Самки
Повторность	C m	M	90 %	N	M	90 %	N
1	Контроль	63	68	136	68	76	143
	1	63	69	143	68	76	152
	5	63	68	142	69	76	142
	10	60**	68	143	68	76	147
	50	61**	67	148	64*	76	156
	100	61**	68	141	64*	74	152
	500	63	68	144	64	76	146
2	Контроль	50	60	144	60	67	136
	1	49	60	144	60	68	112
	5	53	63	125	61	69*	133
	10	53	60	144	63**	71*	143
	50	54***	64*	138	65***	75***	136
	100	55*	62*	134	64*	75**	137
	500	60***	67***	139	62	69	109
3	Контроль	49	60	143	57	67	148
	1	46	57	143	57	64	141
	5	52	64	145	59	72	135
	10	54***	66**	145	61*	71	148
	50	51	64	137	60	68	141
	100	50	61	134	58	67	137
	500	42***	58	121	60*	68	145

Примечания. Cm – концентрация эноксацина, мкг/мл; М – медианная ПЖ (сут); 90 % – возраст 90 % смертности (сут); N – количество особей в выборке.

Условные обозначения. * – различия с контролем статистически значимы при p < 0.05, ** – различия с контролем статистически значимы при p < 0.01, *** – различия с контролем статистически значимы при p < 0.001, достоверность различий для М указана по критерию Геха-на-Бреслоу-Вилкоксона с поправкой Бонферрони, достоверность различий для 90 % – по тесту Ванг-Аллисона с поправкой Бонферрони.

Note. Cm - concentration of enoxacin, µg/mL; M - median lifespan (days); 90 % - age of 90 % mortality (days); N - number of individuals in the sample.

Symbols. * - differences with control are statistically significant at p < 0.05; ** - differences with control are statistically significant at p < 0.01; *** - differences with control are statistically significant at p < 0.001, the significance of differences for M is indicated by the Gehan-Breslow Wilcoxon test with Bonferroni correction, the significance of differences for 90 % is indicated by the Wang-Allison test with Bonferroni correction.

Рисунок 1. Кривые выживаемости самцов (А) и самок (Б) Drosophila melanogaster линии Canton-S при обработке эноксацином.

Условные обозначения. * p < 0.05, ** p < 0.01 – критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Бонферрони.

Figure 1. Survival curves for male (A) and female (Б) Canton-S Drosophila melanogaster treated with enoxacin.

Symbols. * p < 0.05, ** p < 0.01 – Kolmogorov-Smirnov test with Bonferroni correction.

биогенеза малых РНК, включая микроРНК ( AGO1 ), киРНК ( AGO2 ), пивиРНК ( AGO3, aub, piwi ).

У самцов с нокдауном гена AGO2 обнаружен положительный эффект эноксацина в концентрациях 1, 10 и 50 мкг/мл в одной из повторностей (табл. 3, рис. 2). Также увеличение ПЖ при потреблении эноксацина наблюдали у мух с РНК-интерференцией aub® (при 0.5-50 мкг/мл вещества) и piwi (при 0.1-1 мкг/мл) (табл. 3, рис. 3). В перечисленных случаях медианная ПЖ была увеличена на 6–23 % (р < 0.05), а возраст 90 % смертности - на 5-23 % (р < 0.05). Эти данные указывают на то, что активность генов AGO2 , aub и piwi у самцов не снижает эффект эноксацина по сравнению с линией дикого типа.

У самцов с нокдауном AGO1, AGO3 и aub(1) эноксацин в изучаемых концентрациях либо имел менее выраженный и разнонаправленный эффект (между повторностями) на длительность жизни, либо воспроизводимо снижал медианную ПЖ на 3–13 % (p < 0.05) и возраст 90 % смертности на 5–17 % (p < 0.05). Данный результат говорит о возможном участии этих генов, отвечающих за биогенез и функционирование микроРНК и пивиРНК, в геропротекторном действии эноксацина.

У самок воспроизводимый положительный эффект энок-сацина наблюдался только при концентрации 0.5 мкг/мл у дрозофил с нокдауном aub(1) (р < 0.05). В остальных генотипах эноксацин либо укорачивал жизнь мух, либо не оказывал воспроизводимого влияния на изучаемые параметры ПЖ. Наибольшее снижение медианной ПЖ на 6–21 % (р < 0.05) и возраста 90 % смертности на 9-19 % (р < 0.05) при применении эноксацина обнаружено у дрозофил с РНК-интерференцией гена AGO1.

В то же время у дрозофил без нокдауна генов Argonaute наблюдали снижение параметров ПЖ на 1–35 % (p < 0.05) во всех исследуемых концентрациях.

Эноксацин является индуктором факторов РНК-интерференции, который нацелен, в первую очередь, на механизм биогенеза микроРНК [21, 23]. В исследованиях на клеточных культурах продемонстрировано, что это вещество способно усиливать опосредованную микроРНК деградацию мРНК и способствует биогенезу микроРНК и эндогенных киРНК [23]. В частности, эноксацин улучшает процессинг микроРНК путем связывания с TAR РНК-свя-зывающим белком 2 (TRBP) [21, 27]. Также он вовлекает Dicer совместно с AGO2 в процессинг предшественников микроРНК и способствует последующей загрузке регуляторных молекул в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC) [23].

Эноксацин является многообещающим средством для лечения некоторых заболеваний, в том числе связанных со старением. Он ингибирует рост многих типов раковых клеток in vitro и in vivo, включая остеосаркому [36], меланому [37], рак предстательной железы [26], поджелудочной железы [38], легкого [39], щитовидной железы [40], шейки матки [41]. Кроме того, это вещество останавливает прогрессирование аутоиммунного процесса в тканях желчевыводящих путей [42], а также уменьшает вызванное диетой (с высоким содержанием жиров 60 %) ожирение у мышей, нормализует уровень глюкозы в крови и снижает симптомы бокового амиотрофического склероза [43, 44]. Эноксацин имеет низкий уровень токсичности, поскольку избирательно блокирует рост раковых клеток, не затрагивая здоровые клетки [45], безопасен для людей и широко применяется для лечения бактериальных инфекций мочевыводящих путей. Тем не менее на мышах было показано, что эноксацин не влияет на микробиоту кишечника (на содержание бактерий и распределение типов бактерий в кале) [43]. Дополнительно он оказывает противовирусное действие через усиление РНК-интерференции некоторых патогенных молекул с помощью киРНК, вплоть до потенциальной активности против SARS-CoV-2 [46-48].

В исследовании на нематодах Caenorhabditis elegans было показано, что эноксацин в концентрации 100 мкг/мл способен увеличивать ПЖ [21, 49]. На особях Drosophila melanogaster линии дикого типа Canton-S мы также показали, что эноксацин в концентрациях 10-500 мкг/мл способен увеличивать медианную и максимальную ПЖ до 20 %. Тем не менее этот эффект не всегда воспроизводился между биологическими повторностями. Более того, мы изучили эффекты эноксацина на трансгенных дрозофилах (но без нокдауна генов Argonaute ), содержащих конструкции P{CaryP}attP2 и P{CaryP}attP40 вместе с драйвером da-GAL4 . У этих мух наблюдали снижение ПЖ на 1–35 %

Параметры продолжительности жизни особей Drosophila melanogaster с нокдауном генов Argonaute при обработке эноксацином

Table 3

Lifespan parameters of Drosophila melanogaster specimens with Argonaute gene knockdown upon enoxacin treatment

Генотип	Повторность	C m	Самцы			Самки
Генотип	Повторность	C m	M	90%	N	M	90%	N
1	2	3	4	5	6	7	8	9
GAL4-da>RNAi-AGO1	1	Контроль	49	60	145	64	71	156
		0,1	46	57	142	70***	74*	154
		0,5	52**	63	148	67***	73	142
		1	52	61	149	65**	71	154
		5	53**	63	150	64	71	152
GAL4-da>RNAi-AGO2	1	Контроль	35	46	143	64	73	154
		0,1	35	49	153	63	72	150
		0,5	35	49	154	65	72	151
		1	35	46	152	63	72	152
		5	35	44	155	63	73	162
GAL4-da>RNAi-AGO3	1	Контроль	28	35	148	49	57	139
		0,1	24***	35*	151	43***	57	151
		0,5	26	37**	154	49	56	139
		1	27	40***	121	45	56	145
		5	29**	40	112	47	51*	148
GAL4-da>RNAi-Aub (1)	1	Контроль	49	60	150	63	73	153
		0,1	52***	64**	158	59	73	155
		0,5	49	63	156	64**	78*	152
		1	46	57	153	63	77	144
		5	49	64	154	63	73	147
GAL4-da>RNAi-Aub (2)	1	Контроль	42	53	148	71	78	144
		0,1	43	56	137	66***	74**	155
		0,5	49***	56	146	70	78	158
		1	45*	56	151	65***	74***	156
		5	49**	57	157	70	77*	156
GAL4-da>RNAi-piwi	1	Контроль	42	52	92	52	63	147
		0,1	48*	58*	92	52	64	112
		0,5	50***	57	93	54	63	118
		1	47*	64***	108	55*	66	117
		5	47***	61**	138	54	64	51
Gal4-da > P{CaryP} attP40	1	Контроль	70	78	161	70	78	159
		0,1	66**	77*	162	70*	78	168
		0,5	70	78	163	63	77	167
		1	67*	77	160	64	77	162
		5	65*	77*	162	67	77	155
Gal4-da>P{CaryP}attP2	1	Контроль	58	72	150	46	74	152
		0,1	53**	65*	150	37*	77	154
		0,5	55	72*	161	57	77	156
		1	58	72	153	53	78**	153
		5	53***	65***	155	74***	81***	150
GAL4-da>RNAi-AGO1	2	Контроль	52	64	158	71	78	163
		0,1	54	64	154	65**	78	156
		0,5	51	64	155	64***	71**	158
		1	47***	60**	159	57***	64**	155
		5	46***	60	156	56***	63**	158
		10	48***	60	156	57***	68*	159
		50	53	63	158	68	75	62

1	2	3	4	5	6	7	8	9
GAL4-da>RNAi-AGO2	2	Контроль	35	44	151	73	78	140
		0,1	36	49	151	72	79	159
		0,5	36	44	154	70	78	154
		1	38*	48	150	70	77	155
		5	35	47	145	68***	77	164
		10	38	50*	151	67***	74	156
		50	37**	50**	153	71	79	156
GAL4-da>RNAi-AGO3	2	Контроль	37	46	86	52	64	149
		0,1	33***	42***	84	51**	60*	149
		0,5	34*	44	83	54	64	153
		1	36*	42*	127	52	61	158
		5	39	46	141	54	62***	164
		10	36***	40***	136	53**	60***	157
		50	36	44	147	49***	60***	152
GAL4-da>RNAi-Aub (1)	2	Контроль	64	74	152	71	81	157
		0,1	64	72	152	78***	86	155
		0,5	64	72	162	79***	86	155
		1	61	71	187	72	81	153
		5	60**	70***	159	71	82	144
		10	60**	69	148	71	82	157
		50	60***	68**	162	68	78	147
GAL4-da>RNAi-Aub (2)	2	Контроль	45	57	154	79	86	144
		0,1	45	58	149	79	86*	156
		0,5	46	58	165	78	86***	154
		1	49**	57	151	78	85***	157
		5	50***	61*	155	71***	78***	157
		10	47	60***	145	71***	82***	128
		50	47	60*	154	74***	82***	156
GAL4-da>RNAi-piwi	2	Контроль	47	61	73	63	72	116
		0,1	57*	65	80	61*	69	106
		0,5	53	62	76	60***	67***	81
		1	58***	68	72	60**	70*	95
		5	51	61	68	59**	70	124
		10	46	60	89	64	74	110
		50	50	60	100	63	69	148
Gal4-da > P{CaryP} attP40	2	Контроль	64	75		65	79	150
		0,1	57***	68***	156	57**	75*	163
		0,5	57***	70***	158	60	79	156
		1	60**	70	159	49***	77	142
		5	51***	68	154	49***	68***	152
		10	56***	67***	117	42***	67***	154
		50	57***	67***	152	60***	68***	156
Gal4-da>P{CaryP}attP2	2	Контроль	50	65	155	80	89	153
		0,1	51	64	157	78*	86*	138
		0,5	51	64	152	74***	86***	155
		1	44**	64	168	70***	83***	158
		5	47	64	186	56***	79***	152
		10	54	64	148	64***	76***	138
		50	48	64	161	67***	82***	160
GAL4-da>RNAi-AGO1	3	Контроль	49	60	157	67	78	142
		10	50	58	161	63**	74	153
		50	51**	63	164	66	74	160
GAL4-da>RNAi-AGO2	3	Контроль	31	44	158	59	73	149
		10	32	44	156	63	71	155
		50	32	44	159	65***	78*	159

1	2	3	4	5	6	7	8	9
GAL4-da>RNAi-AGO3	3	Контроль	30	43	157	48	52	157
		10	27***	41*	157	43***	55	162
		50	27***	41*	161	49***	57*	160
GAL4-da>RNAi-Aub (1)	3	Контроль	65	78	160	78	94	160
		10	57***	69***	157	71***	85***	159
		50	57***	65***	161	78	87	154
GAL4-da>RNAi-Aub (2)	3	Контроль	44	51	159	67	78	160
		10	44*	56	159	63***	73	159
		50	44	53	157	70***	80**	156
GAL4-da>RNAi-piwi	3	Контроль	48	62	147	55	63	145
		10	50	60	160	55	63	154
		50	47	60	155	56	68*	167
Gal4-da > P{CaryP} attP40	3	Контроль	63	71	155	56	78	153
		10	56***	64***	157	51**	70**	153
		50	57***	64*	145	64	78	160
Gal4-da>P{CaryP}attP2	3	Контроль	53	65	161	78	91	147
		10	45***	57***	157	78***	81***	155
		50	49***	63**	160	80	88	160

Примечания. Cm – концентрация эноксацина, мкг/мл; М – медианная ПЖ (сут); 90 % – возраст 90 % смертности (сут). N – количество особей в выборке. Условные обозначения. * – различия с контролем статистически значимы при p < 0.05; ** – различия с контролем статистически значимы при p < 0.01, *** – различия с контролем статистически значимы при p < 0.001, достоверность различий для М указана по критерию Гехана-Бреслоу-Вилкоксона с поправкой Бонферрони, достоверность различий для 90 % указана по тесту Ванг-Аллисона с поправкой Бонферрони.

Note. Cm - concentration of enoxacin µg/mL; M - median lifespan (days); 90 % - age of 90 % mortality (days); N - number of individuals in the sample. Symbols. * - differences with control are statistically significant at p < 0.05; ** - differences with control are statistically significant at p < 0.01; *** -differences with control are statistically significant at p < 0.001, the significance of differences for M is indicated by the Gehan-Breslow Wilcoxon test with Bonferroni correction, the significance of differences for 90 % is indicated by the Wang-Allison test with Bonferroni correction.

Рисунок 2. Кривые выживаемости особей Drosophila melanogaster с нокдауном генов подсемейства Argonaute при обработке эноксацином.

Условные обозначения. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 – критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Бонферрони.

Figure 2. Survival curves of Drosophila melanogaster individuals with Argonaute subfamily gene knockdown treated with enoxacin.

Symbols. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 – Kolmogorov-Smirnov test with Bonferroni correction.

Gal4-da>RNAi-piwi

■ - Контроль

0.1 мкг/мл 0.5 мкг/мл — — 1 мкг/мл — 5 мкг/мл • -10 мкг/мл - - 50 мкг/мл

" - Контроль

0.1 мкг/мл 0.5 мкг/мл 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл — ■ • 50 мкг/мл

Возраст, сут

Рисунок 3. Кривые выживаемости особей Drosophila melanogaster с нокдауном генов подсемейства PIWI при обработке эноксацином.

Условные обозначения. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 – критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Бонферрони.

Figure 3. Survival curves of Drosophila melanogaster individuals with PIWI subfamily gene knockdown treated with enoxacin.

Symbols. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 – Kolmogorov-Smirnov test with Bonferroni correction.

------ Контроль *++ ......... 0.1 мкг/мл

*** -----о.5мкг/мл ** — — — 1 мкг/мл *** — ^5 мкг/мл *** — . —10 мкг/мл *** — • • 50 мкг/мл

11 - Контроль

0.1 мкг/мл

0.5 мкг/мл

— — 1 мкг/мл — — 5 мкг/мл — ■ - 10 мкг/мл — ■ • 50 мкг/мл

Контроль 0.1 мкг/мл 0.5 мкг/мл 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл

Контроль 0.1 мкг/мл 0.5 мкг/мл — 1 мкг/мл — 5 мкг/мл ■ -10 мкг/мл ■ • 50 мкг/мл

Контроль 0.1 мкг/мл 0.5 мкг/мл 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл

■ Контроль

0.1 мкг/мл

0.5 мкг/мл 1 мкг/мл

— — 5 мкг/мл — - - 10 мкг/мл — - • 50 мкг/мл

при всех концентрациях индуктора РНК-интерференции. Это говорит о том, что действие эноксацина на старение и ПЖ организма может зависеть от комплекса внешних и внутренних факторов, и требуется детальное изучение лежащих в его основе механизмов.

Согласно результатам работы на нематоде, эноксацин действует на продолжительность жизни и старение через пути митогормезиса и SKN-1/Nrf2, снижая при этом уровень miR-34-5p [21,49]. Также в качестве мишени данного соединения у нематод описан РНК-специфическая аденозиндеаминаза (ADAR). При утрате функции ADAR у червей исчезал положительный эффект применения эноксацина [49]. Тем не менее, ввиду специфики организации аппарата биогенеза малых РНК у червей, до конца неясно, связан ли механизм действия эноксацина только с микроРНК, либо он также опосредован функционированием киРНК и пивиРНК.

У Drosophila melanogaster есть пять генов семейства Argonaute , относящиеся к двум подсемействам - Argonaute (AGO1, AGO2) и PIWI (AGO3, aub, piwi) , которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов и транспозонов. Мы оценили вклад конкретных генов Argonaute , специфичных для разных типов малых РНК молекул, в эффект эноксацина на длительность жизни дрозофил. Ген AGO1 повсеместно экспрессируется в ходе развития, его белок обеспечивает активность связывания микроРНК, регулирует экспрессию генов, подавляя трансляцию [50]. AGO2 также повсеместно экспрессируется, а его белок выполняет функцию защиты от транспозонов и вирусов путем связывания с киРНК и участвует в формировании комплекса RISC [51]. Белки подсемейства PIWI (AGO3, Aub, piwi) необходимы для репрессии транспозонов зародышевой линии, однако ген piwi экспрессируется также в соматических клетках гонад дрозофилы [50–52].

В данном исследовании мы обнаружили, что у особей Drosophila melanogaster с нокдауном гена AGO1 эноксацин имел либо отрицательный, либо слабый положительный эффект на ПЖ. Полученный результат указывает на вклад механизма биогенеза микроРНК в спектр биологических активностей этого соединения, что согласуется с указанными выше литературными данными, полученными на клеточных культурах и нематодах.

Дрозофилы с РНК-интерференцией гена AGO2 реагировали на эноксацин схожим образом с линией дикого типа Canton-S . Эноксацин оказывал либо положительное действие, либо не вызывая статистически значимых изменений ПЖ. По-видимому, механизм биогенеза киРНК в меньшей степени определяет геропротекторную активность данного вещества, что согласуется с результатами анализа, проведенного на нематодах [49].

Особи с нокдауном генов подсемейства PIWI демонстрировали неожиданные эффекты эноксацина на ПЖ. В ряде случаев эноксацин вызывал снижение ПЖ у дрозофил с нокдауном AGO3, aub и piwi, что может указывать на вклад пивиРНК и генов PIWI в эффекты эноксацина и детерминирование жизнеспособности взрослого организма в целом. Этот вопрос требует детального изучения. В первую очередь, в связи с тем, что в настоящее время предполагается, что решающую роль пивиРНК имеет в за- родышевой линии и половых клетках [53, 54]. Тем не менее, в работе на раковых клетках человека было показано, что эноксацин может восстанавливать активность PIWIL3 (представитель подсемейства белков PIWI, обеспечивающих выработку пивиРНК) через микроРНК [28].

Список литературы Роль генов семейства Argonaute в эффектах активатора РНК-интерференции эноксацина на продолжительность жизни Drosophila melanogaster

Yao, Q. The roles of microRNAs in epigenetic regulation / Q. Yao, Y. Chen, X. Zhou // Curr Opin Chem Biol. – 2019. – Vol. 51. – P. 11-17.
Yang, J. H. Loss of epigenetic information as a cause of mammalian aging / J. H. Yang, M. Hayano, P. T. Griffin [et al.] // Cell. – 2023. – Vol. 186, № 2. – P. 305-326.e27.
Sen, P. Epigenetic mechanisms of longevity and aging / P. Sen, P. P. Shah, R. Nativio [et al.] // Cell. – 2016. – Vol. 166, № 4. – P. 822-839.
Huang, X. A. A major epigenetic programming mechanism guided by piRNAs / X. A. Huang, H. Yin, S. Sweeney [et al.] // Dev Cell. – 2013. – Vol. 24, № 5. – P. 502-516.
Duempelmann, L. Small RNAs in the transgenerational inheritance of epigenetic information / L. Duempelmann, M. Skribbe, M. Bühler // Trends Genet. – 2020. – Vol. 36, № 3. – P. 203-214.
Sankrityayan, H. Diabetic nephropathy: The regulatory interplay between epigenetics and microRNAs / H. Sankrityayan, Y. A. Kulkarni, A. B. Gaikwad // Pharmacol Res. – 2019. – Vol. 141. – P. 574-585.
Iorio, M.V. Interplay between microRNAs and the epigenetic machinery: an intricate network / M. V. Iorio, C. Piovan, C. M. Croce // Biochim Biophys Acta. – 2010. – Vol. 1799, № 10-12. – P. 694-701.
Moazed, D. Small RNAs in transcriptional gene silencing and genome defence / D. Moazed // Nature. – 2009. – Vol. 457, № 7228. – P. 413-420.
Peters, L. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing / L. Peters, G. Meister // Mol Cell. – 2007. – Vol. 26, № 5. – P. 611-623.
Jia, D. D. The regulatory function of piRNA/PIWI complex in cancer and other human diseases: The role of DNA methylation / D. D. Jia, H. Jiang, Y. F. Zhang [et al.] // Int J Biol Sci. – 2022. – Vol. 18, № 8. – P. 3358-3373.
Kim, V.N. Biogenesis of small RNAs in animals / V.N. Kim, J. Han, M.C. Siomi // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2009. – Vol. 10. – P. 126-139.
Proshkina, E. N. Genome-Protecting Compounds as Potential Geroprotectors / E. N. Proshkina, M. V. Shaposhnikov, A. A. Moskalev // Int J Mol Sci. – 2020. – Vol. 21, № 12. – P. 4484.
Memari, F. Epigenetics and Epi-miRNAs: Potential markers/ therapeutics in leukemia / F. Memari, Z. Joneidi, B. Taheri [et al.] // Biomed Pharmacother. – 2018. – Vol. 106. – P. 1668-1677.
Cheng, Y. Targeting epigenetic regulators for cancer therapy: mechanisms and advances in clinical trials / Y. Cheng, C. He, M. Wang [et al.] // Signal Transduct Target Ther. – 2019. –Vol. 4. – P. 62.
Audia, J. E. Histone modifications and cancer / J. E. Audia, R. M. Campbell // Cold Spring Harb Perspect Biol. – 2016. – Vol. 8, № 4. – P. a019521.
Yang, X. Targeting DNA methylation for epigenetic therapy / X. Yang, F. Lay, H. Han [et al.] // Trends Pharmacol Sci. – 2010. – Vol. 31, № 11. – P. 536-546.
Siklos, M. Therapeutic targeting of chromatin: status and opportunities / M. Siklos, S. Kubicek // FEBS J. – 2022. – Vol. 289, № 5. – P. 1276-1301.
Morera, L. Targeting histone methyltransferases and demethylases in clinical trials for cancer therapy / L. Morera, M. Lübbert, M. Jung // Clin Epigenetics. – 2016. – Vol. 8. – P. 57.
Dai, E. Epigenetic modulation of antitumor immunity for improved cancer immunotherapy / E. Dai, Z. Zhu, S. Wahed [et al.] // Mol Cancer. – 2021. – Vol. 20, № 1. – P. 171.
Cao, J. Cancer epigenetics, tumor immunity, and immunotherapy / J. Cao, Q. Yan // Trends Cancer. – 2020. – Vol. 6, № 7. – P. 580-592.
Felicetti, T. Modulating microRNA processing: enoxacin, the progenitor of a new class of drugs / T. Felicetti, V. Cecchetti, G. Manfroni // J Med Chem. – 2020. – Vol. 63, № 21. – P. 12275-12289.
Zhang, S. Targeting microRNAs with small molecules: from dream to reality / S. Zhang, L. Chen, E. J. Jung [et al.] // Clin Pharmacol Ther. – 2010. – Vol. 87, № 6. – P. 754-758.
Shan, G. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing / G. Shan, Y. Li, J. Zhang [et al.] // Nat Biotechnol. – 2008. – Vol. 26, № 8. – P. 933-940.
Zhao, R. Designing strategies of small-molecule compounds for modulating non-coding RNAs in cancer therapy / R. Zhao, J. Fu, L. Zhu [et al.] // J Hematol Oncol. – 2022. – Vol. 15, № 1. – P. 14.
Wang, K. Epigenetic regulation of aging: implications for interventions of aging and diseases / K. Wang, H. Liu, Q. Hu [et al.] // Signal Transduct Target Ther. – 2022. – Vol. 7, № 1. – P. 374.
Sousa, E. Enoxacin inhibits growth of prostate cancer cells and effectively restores microRNA processing / E. Sousa, I. Graca, T. Baptista [et al.] // Epigenetics. – 2013. – Vol. 8, № 5. – P. 548-558.
Melo, S.A. Small molecule enoxacin is a cancer-specific growth inhibitor that acts by enhancing TAR RNA-binding protein 2-mediated microRNA processing / S. A. Melo, A. Villanueva, C. Moutinho [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 2011. – Vol. 108, № 11. – P. 4394-4399.
Abell, N. S. Click quantitative mass spectrometry identifies PIWIL3 as a mechanistic target of RNA interference activator enoxacin in cancer cells / N. S. Abell, M. Mercado, T. Caneque [et al.] // J Am Chem Soc. – 2017. – Vol. 139, № 4. – P. 1400-1403.
Marco, A. Regulatory RNAs in the light of Drosophila genomics / A. Marco // Brief Funct Genomics. – 2012. – Vol. 11, № 5. – P. 356-365.
Xia, B. Transgenerational programming of longevity and reproduction by post-eclosion dietary manipulation in Drosophila / B. Xia, J.S. de Belle // Aging. – 2016. – Vol. 8, № 5. – P. 1115–1134.
Hilton, J. F. An algorithm for conducting exact Smirnov tests / J. F. Hilton, C. R. Mehta, N. R. Patel // Computational Statistics & Data Analysis. – 1994. – Vol. 17, № 4. – P. 351–361.
Martinez, R. L. A pretest for choosing between logrank and wilcoxon tests in the two-sample problem / R. L. M. C. Martinez, J. D. Naranjo // Metron. – 2012. – Vol. 68, № 2. – P. 111–125.
Wang, C. Statistical methods for testing effects on «maximum lifespan» / C. Wang, Q. Li, D. T. Redden [et al.] // Mech Ageing Dev. – 2004. – Vol. 125, № 9. – P. 629-632.
Armstrong, R.A. When to use the Bonferroni correction / R.A. Armstrong // Ophthalmic and Physiological Optics. – 2014. – Vol. 34, № 5. – P. 502–508.
Han, S. K. OASIS 2: online application for survival analysis 2 with features for the analysis of maximal lifespan and healthspan in aging research / S. K. Han, D. Lee, H. Lee [et al.] // Oncotarget. – 2016. – Vol. 7, № 35. – P. 56147-56152.
Luo, X. Enoxacin inhibits proliferation and invasion of human osteosarcoma cells and reduces bone tumour volume in a murine xenograft model / X. Luo, X. Liu, Q. Tao [et al.] // Oncol Lett. – 2020. – Vol. 20, № 2. – P. 1400-1408.
Valianatos, G. A small molecule drug promoting miRNA processing induces alternative splicing of MdmX transcript and rescues p53 activity in human cancer cells overexpressing MdmX protein / G. Valianatos, B. Valcikova, K. Growkova [et al.] // PLoS One. – 2017. – Vol. 12, № 10. – P. e0185801.
Nishi, K. Enoxacin with UVA irradiation induces apoptosis in the AsPC1 human pancreatic cancer cell line through ROS generation / K. Nishi, M. Kato, S. Sakurai [et al.] // Anticancer Res. – 2017. – Vol. 37, № 11. – P. 6211-6214.
Cao, S. RNA helicase DHX9 may be a therapeutic target in lung cancer and inhibited by enoxacin / S. Cao, R. Sun, W. Wang [et al.] // Am J Transl Res. – 2017. – Vol. 9, № 2. – P. 674-682.
Ramirez-Moya, J. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness / J. Ramirez-Moya, L. Wert-Lamas, G. Riesco-Eizaguirre [et al.] // Oncogene. – 2019. – Vol. 38, № 27. – P. 5486-5499.
McDonnell, A. M. Enoxacin and epigallocatechin gallate (EGCG) act synergistically to inhibit the growth of cervical cancer cells in culture / A. M. McDonnell, H. M. Pyles, E. S. Diaz-Cruz [et al.] // Molecules. – 2019. – Vol. 24, № 8. – P. 1580.
Itoh, A. Enoxacin up-regulates microRNA biogenesis and down-regulates cytotoxic CD8 T-cell function in autoimmune cholangitis / A. Itoh, D. Adams, W. Huang [et al.] // Hepatology. – 2021. – Vol. 74, № 2. – P. 835-846.
Rocha, A. L. Enoxacin induces oxidative metabolism and mitigates obesity by regulating adipose tissue miRNA expression / A. L. Rocha, T. I. de Lima, G. P. de Souza [et al.] // Sci Adv. – 2020. – Vol. 6, № 49. – P. eabc6250.
Emde, A. Dysregulated miRNA biogenesis downstream of cellular stress and ALS-causing mutations: a new mechanism for ALS / A. Emde, C. Eitan, L. L. Liou [et al.] // EMBO J. – 2015. – Vol. 34, № 21. – P. :2633-2651.
McDonnell, A. M. Enoxacin and epigallocatechin gallate (EGCG) act synergistically to inhibit the growth of cervical cancer cells in culture / A. M. McDonnell, H. M. Pyles, E. S. Diaz-Cruz [et al.] // Molecules. – 2019. – Vol. 24, № 8. – P. 1580.
Xu, Y.P. Zika virus infection induces RNAi-mediated antiviral immunity in human neural progenitors and brain organoids / Y.P. Xu, Y. Qiu, B. Zhang [et al.] // Cell Res. – 2019. – Vol. 29, № 4. – P. 265-273.
Ahmadi, A. In silico analysis suggests the RNAi-enhancing antibiotic enoxacin as a potential inhibitor of SARSCoV-2 infection / A. Ahmadi, S. Moradi // Sci Rep. – 2021. – Vol. 11, №1. – P. 10271.
Lyu, B. Enoxacin shows broad-spectrum antiviral activity against diverse viruses by enhancing antiviral RNA interference in insects / B. Lyu, C. Wang, Y. Bie [et al.] // J Virol. – 2022. – Vol. 96, № 4. – P. e0177821.
Pinto, S. Enoxacin extends lifespan of C. elegans by inhibiting miR-34-5p and promoting mitohormesis / S. Pinto, V. N. Sato, E. A. De-Souza [et al.] // Redox Biol. – 2018. – Vol.18. – P. 84-92.
Lewis, S.H. Duplication and diversification of Dipteran Argonaute genes, and the evolutionary divergence of piwi and Aubergine / S. H. Lewis, H. Salmela, D. J. Obbard // Genome Biol Evol. – 2016. – Vol. 8, №3. – P. 507-518.
Malone, C.D. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary / C.D. Malone, J. Brennecke, M. Dus [et al.] // Cell. – 2009. – Vol. 137, № 3. – P. 522-535.
Nishida, K.M. Gene silencing mechanisms mediated by Aubergine piRNA complexes in Drosophila male gonad / K. M. Nishida, K. Saito, T. Mori [et al.] // RNA. – 2007. – Vol. 13, № 11. – P. 1911-1922.
Perera, B. P. U. Somatic expression of piRNA and associated machinery in the mouse identifies short, tissue-specific piRNA / B. P. U. Perera, Z. T. Tsai, M. L. Colwell [et al.] // Epigenetics. – 2019. – Vol. 14, № 5. – P. 504-521.
Story, B. Defining the expression of piRNA and transposable elements in Drosophila ovarian germline stem cells and somatic support cells / B. Story, X. Ma, K. Ishihara [et al.] // Life Sci Alliance. – 2019. – Vol. 2, № 5. – P. e201800211.

Еще

Статья научная