Роль эпителиально-мезенхимального перехода и аутофагии в противоопухолевом ответе клеточных линий меланомы на таргетное ингибирование MEK и MTOR киназ

Несмотря на достигнутые успехи в лечении меланомы, проблема возникновения резистентности и дальнейшей опухолевой прогрессии остается актуальной. Опухолевая прогрессия может быть рассмотрена как многоступенчатый эволюционный процесс, который позволяет опухолевым клеткам на разных этапах преодолевать неблагоприятные условия и физиологические барьеры, сдерживающие рост, за счет приобретения новых функций. Этот процесс адаптации включает в себя изменение клеточных функций и взаимодействие между несколькими клеточными путями. Предполагается, что аутофагия и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) тесно связаны между собой и играют ключевую роль в опухолевой прогрессии, являясь основными биологическими процессами в опухоли. Аутофагия – эволюционно сложившийся процесс лизосомальной утилизации белков и органелл для поддержания своего гомеостаза и жизнедеятельности при неблагоприятных условиях окружающей среды или нехватке питательных веществ и энергии в клетках, предотвращая накопление токсинов внутри клетки [1]. В последнее время участие ЭМП и аутофагии и их взаимосвязь в опухолевой прогрессии активно изучаются [2]. ЭМП является ведущим механизмом инвазии и метастазирования опухолей, в результате которого эпителиальные клетки теряют апикальнобазальную полярность и межклеточные контакты с последующей реорганизацией цитоскелета [3]. Ключевым событием в процессе ЭМП является утрата центральной молекулы межклеточных адгезионных контактов – Е-кадхерина. При ЭМП также происходит так называемое переключение кадхе-ринов, «cadherin switch» – снижение экспрессии Е-кадхерина и повышение уровня N-кадхерина, характерного для мезенхимальных клеток, вименти-на, фибронектина, матриксных металлопротеиназ, а также высвобождение β-катенина, его ядерная транслокация, что, собственно, способствует эпителиально-мезенхимальной трансформации [3–5].

Белок RAS представляет собой небольшую ГТФазу, которая регулирует последующую активацию сигнальных путей, включая MAPK и PI3K и, следовательно, вовлечена в прогрессирование меланомы [6, 7]. Изоформа NRAS мутирована примерно у 15–25 % пациентов с меланомой [6]. Наиболее распространенными мутациями являются замены лизина или аргинина на глютамин [8]. Нижестоящий белок BRAF представлен мутантной формой в 50–70 % случаев меланомы. BRAF-активация может индуцировать подвижность клеток меланомы, его активация связана с увеличением экспрессии Twist1 и Zeb1, что приводит к большей инвазии меланомных клеток [5]. Кроме того, мутация BRAF потенцирует путь NFκB, который, в свою очередь, стимулирует экспрессию MMP, увеличивая миграционную способность, и индуцирует экспрессию SNAIL, известного драйвера метастазирования [9, 10].

Митоген-активированная протеинкиназа (MEK) является нисходящим эффектором BRAF и потенциальной мишенью для терапии меланомы [11]. Однако недавние данные свидетельствуют о том, что ингибирование МЕК может фактически увеличить инвазивный потенциал в меланоме [12]. Известно, что PI3K/AKT/mTOR-сигнальный путь играет значительную роль в ЭМП при меланоме. Структурная активация PI3K/AKT приводит к последующей экспрессии мезенхимальных белков, репрессии E-кадхерина и усиленной миграции клеток меланомы [13, 14]. Активация PI3K/AKT-пути регулируется белком PTEN. Стоит отметить, что PTEN часто мутирован при меланоме, и потеря его функций ведет к резистентности к лекарственной терапии и плохому прогнозу [15]. Дальнейшая активация комплекса mTOR-mTORC1 индуцирует ЭМП путем активации p7026 киназы 1 (S6K1). Таким образом, mTOR-путь является потенциальной мишенью для терапии меланомы, нацеленной на блокирование ЭМП.

Целью исследования явилось изучение влияния ко-ингибирования МЕК и mTOR на выживаемость, возможность формирования 3D-сфероидов и миграционные способности клеточных линий меланомы, а также взаимосвязь этих изменений с маркерами ЭМП и аутофагии.

Материал и методы

Клеточные линии

Клетки метастатической меланомы Mel MTP и Mel Z были получены из опухолевого материала пациентов, проходивших лечение в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина [16]. Клеточные линии культивировали в RPMI-1640 (Gibco, США) с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС, HyClone, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 10 МЕ/мл пенициллин-стрептомицина (ПанЭко, Россия) при 37 °C в атмосфере с 5 % CO2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3–4 дня.

Оценка цитотоксичности

Клеточные линии (8×104 кл/лунка) вносили в 96-луночный планшет. Через 24 ч заменяли среду и добавляли рамамицин и/или биниметиниб и инкубировали в течение 48 ч при 37 °С и 5 % СО2. Затем вносили раствор МТТ (3- [4,5-диметилтриазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромид, Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Образовавшиеся кристаллы диформазана элиюриовали с клеточных мембран ДМСО (200 мкл/лунка). Результат оценивался спектрофотометрически при длине волны 570 нм на анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США). Выживаемость клеток рассчитывали по фомруле: (OD экспериментальной группы – OD контрольной группы) / OD контрольной группы × 100 %.

Иммуноблоттинг

Клетки (2×106) лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 % дезоксихолата натрия, 0,1 % SDS, 10 мкл/мл ингибирующего коктейля, 1 мМ PMSF, 100 мкмоль/л ДТТ (рН 7,5) в течение 40 мин при +4 оС, центрифугировали при 13 400 об/мин 15 мин при +4 ºС. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (Sigma-Aldrich, США) на спектро-флуориметре Multiscan FC (595 нм). Электрофорез образцов, содержавших по 40–60 мкг белка, проводили в 10 % SDS-полиакриламидном геле, белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (BioRad, США) методом полусухого электропереноса в системе Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, США) при 1А и 25В в течение 30 мин. Для предотвращения неспецифической сорбции нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали 5 % раствором сухого молока («Applichem», Германия) в TBS-T Мембрану инкубировали с первичными антителами LC3B (Novus Biologicals, Великобритания), р62/ SQSTM1 (Cell Signaling, США), Беклин 1 (Cell Signaling, США), E-кадхерин (Dako, Дания), N-кадхерин (Dako, Дания), β-катенин (NeoMarkers, Великобритания), Виментин (Dako, Дания) и β-актином (Sigma, США) в течение ночи при +4 оС, отмывали раствором ТBS-T при комнатной температуре, инкубировали 1,5 ч с вторичными антивидовыми антителами, конъюгированными пероксидазой хрена (Amersham, США). Затем добавляли хемилюминесцентный субстрат Clarity ECL (Bio-Rad, США). Хемилюминесцентную реакцию регистрировали на ChemiDoc Touch (Bio-Rad, США). Денситометрический анализ проводился с помощью программы ImageJ (NIH, США).

Иммуноцитохимическое исследование

Клетки наращивали на стеклах до 80 % монослоя, далее фиксировали в спирте и ацетоне, инкубировали с первичными антителами к E-кадхерину (Dako, Дания), N-кадхерину (Dako, Дания), β-катенину (NeoMarkers, Великобритания), Виментину (Dako, Дания), матриксным металлопротеиназам 2 (Abcam, Великобритания) и 9 (Santa Cruz, США) при 4 ºС в течение 18 ч. Клетки промывали и инкубировали с вторичными антивидовыми антителами, меченными флуорохромом AlexaFluor®488 (Life Technologies, США), а затем с Хекстом 33258 (ПанЭко, США). Клетки заключали под покровные стекла с использованием полимерной среды Fluorescent mounting medium (Dako, Дания). Интенсивность окрашивания оценивали на клеточном анализаторе InCell Analyzer 6000 с использованием программного обеспечения InCell Investagator.

Формирование сфероидовс использованием RGD-пептида

Формирование сфероидов проводили, как описано ранее [17]. Стоковый раствор cyclo-RGDfK(TPP) пептида (400 мкМ) готовили растворением лиофилизированного порошка в питательной среде RPMI-1640 без сыворотки и последующей стерилизацией через одноразовый фильтр (Millipore, 0,22 мкм), стоковый раствор хранили в морозильной камере при -20 оС не более трех месяцев. Клетки рассеивали на 96-луночные планшеты в концентрации 2×104 клеток на лунку в 100 мкл питательной среды RPMI-1640 + 10 % ТЭС и помещали в CO2-инкубатор. Через 2–4 ч из лунок удаляли старую питательную среду и вносили 100 мкл полной среды, содержащей 10–100 мкМ пептида, и вновь помещали в CO2-инкубатор. За изменениями в характере роста и морфологии клеток наблюдали с помощью оптического микроскопа.

Оценка инвазии сфероидов в Матригель

Сфероиды клеточной линии Mel Z, полученные на основе RGD-пептидов, собирали в 15 мл пробирку и откручивали в течение 10 мин при 1500 об/мин. Далее отбирали супернатант, к осадку клеток добавляли 1 мл Матригеля (BD Bioscience, Бельгия), аккуратно ресуспендировали и добавляли по 50 мкл в охлажденный 96-лучный планшет. Планшет инкубировали при 37 °C 10 мин для полимеризации Матригеля, а затем добавляли 100 мкл полной питательной среды, содержащей рапамицин (250 нM) и/или биниметиниб (2,5 µM) или оставляли интактными. Инвазия клеток в Матригель оценивалась через 2–3 дня с помощью светового микроскопа.

Оценка миграционной способностиклеток в камере Бойдена

Клетки меланомы (2,5×105/мл) прединкубирова-ли с рамамицином (250 нМ) и/или биниметинибом (2 µM) в течение 4 ч, затем переносили в камеру Бойдена в 300 мкл бессывороточной среды, содержащей химиопрепараты, помещали в 24-луночный планшет, содержащий 750 мкл среды с 10 % ТЭС для создания условий для миграции клеток через поры камеры Бойдена, и оставляли на 24 ч при 37 °C в атмосфере с 5 % CO2. Затем мембрану фиксировали 3 % формальдегидом в течение 5 мин с последующей фиксацией в метаноле, после чего клетки окрашивали 0,5 % раствором кристаллического фиолетового в течение 30 мин. Количество мигрировавших клеток с нижней стороны мембраны камеры Бойдена считали в 5 различных полях (×40) под световым микроскопом Nikon 80i.

Статистический анализ

Все эксперименты были выполнены в трех повторах. Статистический анализ и графический интерфейс представлены с использованием программного обеспечения GraphPad Prizm v.5.0. (GraphPad, США). Для достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. Значение р≤0,05 считалось статистически достоверным.

Результаты

Изучение экспрессии маркеров ЭМП на клеточных линиях меланомы

Mel Z и Mel MTP

Изначально мы изучили базальную экспрессию E-кадхерина, N-кадхерина, β-катенина, виментина, MMP2 и ММР9 на 2 клеточных линиях метастатической меланомы Mel Z, несущей мутацию в гене BRAF , и линии c мутантным NRAS – Mel MTP. Установлено, что обе клеточные линии отличаются более высоким базальным уровнем маркеров мезенхимальности: виментина, N-кадхерина и ММР2 по сравнению с эпителиальным маркером Е-кадхерином. Уровень экспрессии β-катенина и ММР9 был заметно ниже (рис. 1).

Ранее нами был изучен уровень базальной аутофагии по уровню экспрессии Беклин 1 в исследованных клеточных линиях [18]. Было показано, что клеточная линия Mel Z имела низкий уровень базальной аутофагии, а Mel MTP – высокий. Таким образом, на уровне базальной экспрессии корреляции между уровнем аутофагии и ЭМП не отмечено.

Рис. 1. Иммуноцитохимическое исследование экспрессии маркеров ЭМП на клеточных линиях меланомы Mel MTP и Mel Z

Рис. 2. Изменение цитотоксичности биниметиниба в присутствии или отсутствии рапамицина на клеточных линиях меланомы Mel Z и Mel MTP определено методом МТТ после 48-часовой инкубации с препаратами (p<0,05)

Цитотоксичность комбинации биниметиниба и рапамицина

Далее мы изучили действие биниметиниба и/или рапамицина на выживаемость клеточных линий меланомы. Величина IC50 биниметиниба составила 3,8 ± 0,2 µМ для линии Mel Z и 10,2 ± 0,4 µМ – для Mel MTP (p<0,05), величина IC50 рапамицина составила 300 ± 15 нM для обеих клеточных линий (p<0,05). Для изучения действия комбинации препаратов на выживаемость клеток меланомы биниметиниб и рапамицин брали в соотношении 10:1. Все комбинации демонстрировали усиленный антипролиферативный эффект по сравнению с монорежимами рапамицина и биниметиниба, однако синергизм действия 2 препаратов, определяемый по комбинационному индексу (КИ) методом Chou-Talalay [19], отмечался только при концентрациях 5 µМ биниметиниба и 0,5 µМ рапамицина и 2,5 µМ биниметиниба и

0,25 µМ рамамицина (таблица, рис. 2). При более низких концентрациях отмечалась незначительная аддитивность взаимодействия препаратов (данные не представлены). Для дальнейших исследований брали биниметиниб и рамамицин в концентрациях 2,5 µМ и 250 нМ, которые приводили к 10–15 % ингибированию роста по сравнению с бинимети-нибом в монорежиме.

Цитотоксичность комбинации биниметиниба и рапамицина в 3D-сфероидах

Опираясь на данные о цитотоксичности препаратов в монослойной культуре (2D-культуре), мы исследовали эффективность комбинации в 3D-сфероидах, которые представляют собой более близкую к in vivo клеточную модель. Клетки Mel Z формировали плотные сфероиды с диаметром в среднем 100 µм, клетки Mel MTP имели

Таблица

Антипролиферативная активность (% от контроля) биниметиниба, рапамицина или их комбинации в соотношении 10:1, КИ – комбинационный индекс, посчитанный по методу Chou-talalay

(КИ<1 – антагонизм, >1 – антагонизм, =1 – аддитивность)

	Mel Z	Mel MTP
Биниметиниб	Рапамицин	Биниметиниб +	Биниметиниб	Рапамицин	Биниметиниб +
		рапамицин			рапамицин

Концен-	Выжива-	Концен-	Выжива-	Выжива-	КИ	Концен-	Выжива-	Концен-	Выжива-	Выжива-	КИ
трация,	емость	трация,	емость	емость		трация,	емость	трация,	емость	емость
мкМ		нМ				мкМ		нМ
5	48 %	500	16 %	19 %	0,95	5	67 %	500	28 %	23 %	0,99
2,5	60 %	250	80 %	47 %	0,45	2,5	75 %	250	77 %	68 %	0,8
1,25	58 %	125	95 %	59 %	0,97	1,25	71 %	125	98 %	68 %	1,25

Рис. 3. Влияние комбинации биниметиниба и/или рапамицина на 3D-клеточные линии меланомы: А – антипролифератив-ная активность биниметиниба, рапамицина или их комбинации в 3D-сфероидах клеточных линий Mel MTP и Mel Z методом МТТ после 48 ч инкубации с препаратами; Б – изучение инвазивности 3D-сфероидов клеток Mel Z, имплантированных в Матригель, через 48 ч после воздействия биниметиниба и/или рапамицина

гроздевидную форму. Минимальное количество cyclo-RGDfK(TPP) пептида для формирования сфероидов составило 100 µМ для Mel Z и 50 µМ для Mel MTP. Неожиданным оказался тот факт, что биниметиниб в монорежиме был нетоксичным для клеток линии Mel Z по сравнению с монослойной культурой (95 % выживаемость в 3D-сфероидах против 60 % в 2D-культуре), при этом в Mel MTP токсичность биниметиниба была сопоставима с 2D-культурой (75 и 69 % соответственно). При комбинации с рапамицином в клеточной линии Mel Z сохранялся усиленный антипролифератив-ный эффект по сравнению с биниметинибом, а в линии Mel MTP отмечалось усиление токсичности на 20 % (рис. 3А).

Биниметиниб и рапамицин снижают инвазию, но не миграцию клеток меланомы in vitro

Мы изучили способность биниметиниба и/или рапамицина к уменьшению инвазии клеток на 3D-сфероидах, имплантированных в Матригель, для чего клетки линии Mel Z были преинкубированы с биниметинибом (2,5 мкМ) и/или рапамицином (250 нМ) в течение 48 ч. Рапамицин и биниме-тиниб в монорежиме снижали инвазию Mel Z в Матригель. Более того, комбинированное действие препаратов приводило к более значительному ингибированию инвазии по сравнению с биниме-тинибом и рапамицином отдельно (рис. 3Б).

Влияние комбинации биниметиниба и рапа-мицина на миграционную способность клеток меланомы было изучено по способности клеток проходить 8 мкМ мембрану камеры Бойдена. Клетки преинкубировали с препаратами в течение 4 ч, после чего их вносили в камеру Бойдена в бес-сывороточной среде с 2,5 мкМ биниметинибом и/ или 250 нМ рапамицином. Через 24 ч получали изображения мигрировавших через камеру Бойдена клеток и подсчитывали количество проми-грировавших клеток в присутствии препаратов под световым микроскопом в 5 полях (рис. 4). Снижение миграционной активности под действием препаратов относительно контроля было более значительным в клетках линии Mel Z по сравнению с Mel MTP. Однако не выявлено различий в миграционной способности под действием биниметиниба, рамамицина и их комбинации ни в одной из двух клеточных линий. Более того, ко-инкубация с биниметинибом и рапамицином в клеточной линии Mel Z приводила к усиленной миграции клеток, что может быть объяснено более агрессивным фенотипом этих клеток и как следствие повышенной подвижностью.

Изучение экспрессии маркеров ЭМП и аутофагии под действием комбинации рапамицина и биниметиниба

Для оценки степени участия маркеров ЭМП и аутофагии в снижении опухолевой пролиферации

Рис. 4. Миграционная способность клеточных линий Mel MTP и Mel Z в камере Бойдена после 24-часовой инкубации c биниметинибом (2,5 мкМ) и/ или рапамицином (250 нМ). Количество мигрировавших клеток в камере Бойдена подсчитывали в 5 различных полях (×40) под световым микроскопом

Рис. 5. Иммуноблоттинг экспрессии Беклина 1, LC3B, p62, Е-кадхерина, Ν-кадхерина, β-катенина и виментина после воздействия биниметиниба и/или рапамицина на клеточных линиях меланомы Mel MTP и Мel Z под действием рамамицина и/или биниметини-ба мы исследовали экспрессию E-кадхерина, N-кадхерина, β-катенина, виментина, LC3BI/II, р62/SQSTM1 и Беклин 1. Активность каждого рецептора определяли методом вестерн-блотинга с использованием соответствующих антител. Как показано на рис. 5, в клетках Mel Z комбинация препаратов снижала экспрессию маркеров аутофагии Беклин 1, р62/SQSTM1, LC3BII и маркеров мезенхимальности N-кадхерина и β-катенина, препараты в монорежиме не влияли на степень активации белков. При этом уровень виментина оставался неизменным. Схожая картина наблюдалась и в другой линии меланомы Mel MTP, где комбинация препаратов также подавляла активацию N-кадхерина, β-катенина и LC3BII. Однако не происходило сколько-нибудь значимой блокировки р62/SQSTM1 и виментина по сравнению с контролем. При исследовании обеих клеточных линий не отмечено значимых различий в экспрессии Е-кадхерина.

Обсуждение

Основной причиной, ограничивающей эффективность таргетной терапии при меланоме, являются возникающая резистентность и дальнейшая опухолевая прогрессия. Чаще всего резистентность приобретается за счет реактивации МАРК-сигнального пути или активации альтернативных каскадов, включая PI3K/AKT/mTOR [20]. Оба сигнальных пути PI3K/AKT/mTOR и МАРK могут регулироваться посредством рецепторных тиро-зинкиназ [21].

В данном исследовании мы показали, что комбинация МЕК-ингибитора биниметиниба и mTOR-ингибитора рапамицина имеет большую терапевтическую эффективность по сравнению с препаратами в монорежиме в экспериментах in vitro. Биниметиниб и рапамицин синергично снижали пролиферативную активность как BRAF-мутированной меланомы Mel Z, так и NRAS-мутированной Mel MTP. Более того, данный эффект сохранялся и при изучении эффективности данной комбинации в 3D-сфероидах, которые представляют собой более близкую к in vivo экспериментальную модель. Недавние данные показали, что инактивация PI3K/AKT/mTOR-сигнального пути уменьшает прогрессию меланомы. Предварительные исследования показывают, что ингибитор PI3K, LY-294.002 может уменьшить инвазию и миграцию меланомы за счет снижения фосфорилирования АКТ и увеличения экспрессии MITF [22]. Схожие данные были получены и при других типах опухолей [23].

Нами показано, что частично эффективность комбинации связана со снижением маркеров ЭМП N-кадхерина и β-катенина и снижением аутофагии в клетках меланомы – Беклин 1, р62/SQSTM1 и LC3BII.

Известно, что PI3K/AKT/mTOR играет значительную роль в меланоме ЭМП. Структурная активация PI3K/AKT приводит к последующей экспрессии мезенхимальных белков, репрессии E-кадхерина и усиленной миграции клеток меланомы [13, 14]. mTOR является нисходящим эффектором пути PI3K/AKT. mTOR функционирует как каталитическая единица двух важных белковых комплексов mTORC1 и mTORC2 [25]. Активация mTORC1 индуцирует ЭМП путем активации p7026 киназы 1. Это изменение стимулирует реорганизацию F-актина, фокальную адгезию и экспрессию MMP. Через фосфорилирование AKT, сигнализация TGFβ стимулирует mTORC2, чтобы индуцировать цитоскелетную реорганизацию и миграцию.

Хотя ряд ученых показали, что ингибирование MEK при меланоме может увеличивать инвазию и индуцировать клеточную подвижность, особенно в клеточных линиях, мутантных по BRAF и KRAS [12, 26–28], в нашем исследовании комбинация биниметиниба и рапамицина снижала инвазию клеток, но не миграцию. Стоит отметить, что не все МЕК-ингибиторы индуцируют повышенную инвазию клеток. Так, МЕК-ингибитор траметиниб уменьшал фосфорилирование ERK1/2, но увеличивал активацию AKT и нисходящих эффекторов в NRAS-мутированных клетках SK-MEL-2 посредством EGF-сигналинга [29]. Другой МЕК-ингибитор селуметиниб индуцировал инвазию в клеточной линии A375 по сравнению с контролем за счет усиления экспрессии MMP-2 и MMP-9 и промезенхимальных транскрипционных факторов, таких как Zeb1, Twist, Snail [12, 30]. C другой стороны, U0126 – потенциальный ингибитор МЕК – ингибировал инвазию клеток A375 в клеточных моделях в матригеле за счет снижения экспрессии урокиназы плазминогена и MMP-9 [31].

Недавние исследования показывают, что аутофагия и ЭМП находятся в сложной взаимосвязи в опухолях [2]. Оба процесса регулируются общими молекулярными медиаторами и сигнальными путями, включая TGF, STAT3 и PI3K/AKT/mTOR сигнальный каскад. С одной стороны, аберрантная активация ЭМП требует повышенного уровня аутофагии для поддержания жизнеспособности опухолевых клеток при метастатическом распространении. С другой стороны, аутофагия на ранних стадиях может подавлять рост опухоли, дестабилизируя важнейшие медиаторы ЭМП [2]. Qiang and He показали, что функциональное снижение аутофагии активировало ЭМП посредством