Роль каротиноидов в регуляции устойчивости Spirodela polyrhiza (L.) Schleid кхолодовомушоку

Изучено влияние кратковременного (15 сек., 5, 15, 30 мин) холодового шока (0,1-0,2 ^оС) при освещении ФАР 0,1 мМ/ м² с^-1 на состав каротиноидов Spirodela polyrhiza (L.) Schleid, культивируемого в лабораторных условиях. Выявлено, что сумма каротиноидных пигментов многокоренника при холодовом шоке не изменяется и в среднем составляет 206,9 ± 11,5 мкг/г сырого веса. В ответ на кратковременное охлаждение многокоренника установлено увеличение пула лютеин + зеаксантин (на 5-8%) с одновременным уменьшением содержания виолаксантина (на 16 %). Деэпоксидация виолаксантина происходит в минутных временных диапазонах и глубина превращения не зависит от продолжительности холодового шока. Полученные результаты указывают на то, что пигменты виолаксантинового цикла могут участвовать в реализации транзиторных аварийных систем защиты ФСА путем увеличения доли тепловой диссипации энергии поглощенных квантов света и предотвращения образования синглетного кислорода.

В последние годы развиваются представления, придающие важную роль каротиноидам как антиоксидантам (Miller и др., 1996) и фотопротекторам, влияющим на процессы переноса электронов в ЭТЦ (электронотранспортной цепи) и генерации АФК (активных форм кислорода) в хлоропластах (Бухов, 2004). Каротиноиды, содержащиеся в РЦ (реакционном центре) ФС2, а также входящие в состав ССК (светособирающего комплекса) ФС2 могут обезвреживать хлорофилл в триплетном состоянии, который мог бы образовывать высокореактивный окислитель – синглетный кислород ¹О 2 (Siefermann-Harms, 1987). Имеются данные, что β-каротин, связанный с РЦ защищает белок D1 кислородвыделяющего центра ФС2 от синглетного кислорода (Tefler и др., 1994). Возможно также прямое тушение возбужденного состояния синглетного хлорофилла a , сопровождающееся тепловой диссипацией (Horton и др., 1996 ). В этот процесc вовлечены пигменты ВЦ (виолаксантинового цикла) (Demmig-Adams, 1990).

Целью настоящей работы была проверка предположения об участии каротиноидных пигментов в формировании стресс-реакции Spirodela polyrhiza (L.) Schleid в ответ на кратковременный холодовой шок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект и условия выращивания. В работе использовали культивируемые длительное время в лабораторных условиях растения многокоренника обыкновенного. Для этого они выращивались в питательной среде Гельригеля с половинной дозой солей, при рН 6,1-6,3, круглосуточном освещении ФАР 0,1 мМ/ м² с^-1, температуре и относительной влажности воздуха – 27-30⁰С и 95-100% соответственно.

Проведение опытов по холодовому шоку. Холодовой шок создавали, помещая интактные растения многокоренника обыкновенного в охлажденную до 0,1 –0,2 ^оС питательную среду Гельригеля с четвертичной дозой солей, на 15 сек, 5, 15, 20 мин и освещении ФАР 0,1 мМ/м² с^-1. Температуру поддерживали с помощью термостата MULTITEMP II 2219 (LKB, Швеция). Определение состава пигментов проводили сразу после окончания холодового действия и через 3 часа. Контролем служили растения той же партии, выдержанные при комнатной температуре.

Анализ пигментов. Навеску свежего растительного материала (50 мг) тщательно растирали в фарфоровой ступке с безводным Na2SO4 (около 200 мг) и 10-15 мг СаСО3. Измельченный в порошок растительный материал экстрагировали смесью ацетона и этилового спирта в отношении 3:1. Экстракт объемом 3-4 мл центрифугировали при 2-4 0С. Экстракцию осадка повторяли 2 раза. Прозрачные центрифугаты объединяли и концентрировали под вакуумом при комнатной температуре.

Качественный состав каротиноидов анализировали методом ТСХ. Суммарный экстракт пигментов наносили на пластинку Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ (10 х 10 см, Россия). Для хроматографии использовали систему растворителей этанол – бензол – ацетон – петролейный эфир ( 0,3 : 1 : 2 : 6,7 ). Элюаты каротинов в хлороформе, ксантофиллов в этаноле идентифицировали по спектрам поглощения, полученным на спектрофотометре Shimadzu UV-240 (Япония). Количественное содержание каждого из пигментов рассчитывали по основному максимуму поглощения: β-каротина при 464 нм, лютеина-446 нм, виолаксантина-442 нм, неоксантина-438 нм (Сахарова, 1969), используя удельные коэффициенты экстинкции (Lichtenthaller, Wellburn, 1983).

Определения проводили в опытах, каждый из которых состоял из 3 параллельных биологических повторностей. В таблицах приведены средние арифметические значения с их стандартными ошибками ( n = 3).

Таблица 1. Влияние холодового шока (0,1-0,2 ^оС) на содержание индивидуальных каротиноидов

(мкг/г сырого веса) и их соотношения (% от суммы каротиноидов) в Spirodela polyrhiza (L.) Schleid сразу после действия

Дата Вариант опыта β-каротин Неоксантин Виолаксантин Лютеин + зеаксантин Сумма каротиноидов мкг/г % мкг/г % мкг/г % мкг/г % мкг/г 15.04.05 контроль 58.5 ± 2.3 26.5 37.1 ± 1,5 16.8 19.7 ± 0.8 8.9 105.4 ± 4.2 47.8 220.7 ± 8.6 опыт 1 58.8 ± 2.4 26.9 31.1 ± 1.2 14.3 19.4 ± 0,8 8.9 108.9 ± 4.4 49.9 218.2 ± 8.5 18.10.04 контроль 61.2 ± 2.5 33.0 30.6 ± 1.2 16.5 10.0 ± 0.5 5.4 83.7 ± 3.9 45.1 185.5 ± 7.2 опыт 2 59.0 ± 2.4 - - - 7.6 ± 0.5 - 90.4 ± 4.1 - - 19.10.04 контроль 63.9 ± 2.6 31,3 34.3 ± 1.4 16.9 11.4 ± 0.5 5.6 94.4 ± 3.8 46.3 204.0 ± 7.9 опыт 2 67.0 ± 2.4 29.6 38.1 ±1.5 16.8 11.1 ± 0.6 4.9 111.3 ± 4.5 48.9 227.5 ± 8.9 07.04.05 контроль 56.7 ± 2.3 28.6 37.3 ± 1.5 18.8 17.1 ± 0.7 8.6 87.4 ± 3.5 44.0 198.5 ± 7.7 опыт 2 54.8 ± 2.2 27.3 34.3 ± 1.4 17.1 14.4 ± 0.6 7.2 97.3 ± 3.9 48.4 200.8 ± 7.8 21.10.04 контроль 63.0 ± 2.6 31.8 33.6 ± 1,3 16.9 10.9 ± 0.5 5.5 90.8 ± 4.1 45.8 198.3 ± 7.9 опыт 3 61.9 ± 2.5 28.9 39.8 ± 1.6 18.6 9.1 ± 0.4 4.3 103.1 ± 4.6 48.2 213.9 ± 7.9 20.04.05 контроль 60.8 ± 2.4 29.5 39.8 ± 1.6 19.3 19.6 ± 0.8 9.5 85.8 ± 3.4 41.7 206.0 ± 8.0 опыт 3 61.5 ± 2.5 29.0 34.7 ± 1.4 16.4 18.3±0.7 8.6 97.4 ± 3.9 46.0 211.9 ± 8.3 12.04.05 контроль 58.6 ± 2.3 27.8 42.1 ± 1.7 20.0 15.9 ± 0.6 7,5 94.0 ± 3.8 44.7 210.6 ± 8.2 опыт 4 65.4 ± 2.6 31.4 34.2 ± 1.4 16.4 12.7 ± 0,5 6,1 95.8 ± 3.8 46.1 208.1 ± 8.1 примечание: вариант опыта: 1, 2, 3, 4– продолжительность холодового шока 15 с, 5, 15, 30 мин соответственно

РЕЗУЛЬТАТЫ

В таблице 1 представлены данные о количественном составе каротиноидных пигментов многокоренника для разных вариантов опытов. Большую долю в сумме каротиноидов составляли лютеин + зеаксантин , затем β-каротин и неоксантин, меньше всего содержалось виолаксантина. Однако для апрельских контрольных растений в целом характерно более повышенное относительное содержание виолаксантина – 8,6 %, неоксантина – 18,7 % и несколько пониженное содержание β-каротина (28,1 %) по сравнению с осенними, что является проявлением эндогенных сезонных ритмов. В связи с этим обстоятельством, а также по причине наличия такого фактора, как суточный ход изменений долевого содержания каротиноидов, определение пигментного состава в контрольных и опытных растениях проводили в одно и то же время.

Растения после проведения холодового шока по внешним признакам не отличались от контрольных. Суммарное содержание каротиноидов при холодовом шоке практически не менялось, и оставалась в пределах коэффициента вариации для контрольных растений (206,9 ± 11,5 мкг/г сырого веса). Охлаждение многокоренника в течение 15 с, практически не влияло на пигментный состав ВЦ. Однако увеличение продолжительности холодового шока до 5, 15, 30 мин приводило к достоверному возрастанию пула лютеин + зеаксантин при одновременном снижении содержания виолаксантина во всех опытах не зависимо от сезона года. Уменьшение долевого содержания виолаксантина у подвергнутых холодовому шоку растений составляло в среднем 16 % по сравнению с контрольными растениями, тогда как пул пигментов лютеин + зеаксантин возрастал на 5-8 %. Глубина и направленность изменений пигментного состава не зависели от продолжительности холодового шока. Во всех вариантах опытов после холодового шока количественные соотношения каротиноидов при комнатной температуре довольно быстро восстанавливались и через 3 часа были сопоставимы с показателями у контрольных растений (табл.2). Таким образом, у многокоренника в ответ на кратковременные холодовые воздействия возникают быстрые обратимые реакции с участием пигментов ВЦ..

Таблица 2. Содержание индивидуальных каротиноидов (мкг/г сырого веса) и их соотношения (% от суммы каротиноидов) в Spirodela polyrhiza (L.) Schleid через 3 часа после холодового шока (0,1-0,2 оС)

Дата Вариант опыта β-каротин Неоксантин Виолаксантин Лютеин + зеаксантин Сумма каротиноидов мкг/г % мкг/г % мкг/г % мкг/г % мкг/г 07.04.05 контроль 56.7 ± 2.3 28.6 37.3 ± 1.5 18.8 17.1 ± 0.6 8.6 87.4 ± 3.5 44.0 198.5 ± 7,7 опыт 1 61.5 ± 2.5 30.4 37.4 ± 1.5 18.6 12.6 ± 0.5 6.3 90.0 ± 3.6 44.7 201.5 ± 7,9 13.04.05 контроль 44.6 ± 1.8 22.9 37.4 ± 1.5 19.2 20.2 ± 0.8 10.4 92.5 ± 3.7 47.5 197.7 ± 7,7 опыт 2 41.3 ± 1.7 21.9 38.6 ± 1.5 20.5 19.5 ± 0.8 10.3 89.3 ± 3.5 47.3 188.7 ± 7,4 13.04.05 контроль 44.6 ± 1.8 22.9 37.4 ± 1.5 19.2 20.2 ± 0.8 10.4 92.5 ± 3.7 47.5 194.7 ± 7,7 опыт 3 51.3 ± 2.1 23.0 42.1 ± 1.7 18.9 25.8 ± 1.0 11.6 103.9 ± 4.2 46.6 223.1 ± 8,7 примечание: вариант опыта: 1, 2, 3, – продолжительность холодового шока 5, 15, 30 мин соответственно

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы предполагаем, что увеличение пула лютеин + зеаксантин в минутных временных интервалах происходит за счет образования дополнительных количеств зеаксантина из виолаксантина путем деэпоксидации. Изменения в содержании пигментов ВЦ в указанных временных интервалах могут наблюдаться в результате взаимных переходов - реакций деэпоксидации и эпоксидации, и обусловлены изменениями рН в мембране тилакоидов (Demmig-Adams и др., 1996). Таким образом, наблюдаемое увеличение пула лютеин + зеаксантин путем синтеза дополнительных количеств пигментов исключается. Это подтверждается также нашими данными, так как сумма каротиноидов многокоренника в ходе опытов остается практически постоянной (табл.1).

На наш взгляд последовательность событий можно представить следующим образом. В ответ на резкое снижение температуры возникает дисбаланс между фотофизическими (которые практически не зависят от температуры) с одной стороны, и температурозависимыми процессами переноса электронов, фотофосфорилирования в хлоропластах. При этом свет становится «избыточным», не изменяясь по абсолютной интенсивности. Каждый поглощенный квант может либо индуцировать электронный транспорт в ФСА, либо диссипировать в тепло, либо высветиться в виде кванта флуоресценции (Бухов, 2004). По-видимому, при пониженных температурах необходимость в увеличении доли тепловой диссипации возрастает.

При низких температурах фотофосфорилирование ADP и транспорт протонов в строму через тилакоидную мембрану замедляется, что ведет в закислению люмена. Существенную активность при пониженных температурах проявляет также хлоропластная ATPазная помпа, которая осуществляет обратный транспорт протонов из стромы в люмен (Demmig-Adams и др., 1996). Тем не менее, для поддержания минимально необходимого уровня протонного градиента в тилакоидных мембранах существенный вклад вносят альтернативные пути ЭТЦ хлоропластов (Neubauer, Yamamoto1992; Heber, Walker, 1994 и др.).

Избыток ионов водорода в люмене, по-видимому, активирует VDE (деэпоксидазу виолаксантина), характерным свойством которой является оптимум активности при пониженных рН. Согласно данным последних лет, обратимый ВЦ, функционирующий в липидном матриксе тилакоидов, осуществляет рецепцию и трансдукцию стрессорного сигнала (Hieber и др., 2004). Ионы водорода являются материальными носителями стрессорного сигнала. Предпологают, что рецептор, отслеживающий возбужденное состояние хлорофилл-белковых комплексов, представляет собой фермент VDE. Зеаксантин, образующийся из виолаксантина, выполняет роль вторичного мессенджера (посредника), который связывается с белками-мишенями в ССК ФС1 и 2. Функции зеаксантина в множественных связывающих сайтах на молекулярном уровне в полной мере не исследованы. По данным Ма с сотр. ( Ma и др., 2003) зеаксантин увеличивает долю тепловой диссипации поглощенных квантов света путем тушения возбужденных синглетных состояний хлорофилла в ССК ФС2. Тем самым предотвращается образование избыточных количеств синглетного кислорода (^S1O 2 или ¹O 2 ) в ФС 2 по реакции (Havaux, Niyogi, 1999):

T1Хл + ТoO2 → SoХл + S1O2

В защите незакаленных растений от холодового шока – быстрого снижения температуры – принимают участие системы, вызывающие термогенез и локальное повышение температуры (Колесниченко , Войников, 2003). Полученные нами результаты позволяют сделать предположение о том, что «фотофизическая» часть фотосинтеза, включающая поглощение энергии света, процессы миграции и преобразования энергии с участием пигментов ВЦ, несомненно, принимает участие в термогенезе и может иметь большое значение в устойчивости растений Севера к низким положительным температурам.