Роль микро-РНК при солидных опухолях

Последнее десятилетие сопровождается появлением большого количества исследований, посвященных роли малых, не кодирующих белок молекул РНК (микро-РНК) в канцерогенезе. Семейство генов микро-РНК составляет немногим более 1% от всего генома человека, но регулирует экспрессию почти трети всех генов на посттранскрипционном уровне, при этом являясь наиболее консервативным по последовательностям и механизмам экспрессии. Эти 21-нуклеотидные РНК участвуют в большом количестве генетических регуляторных механизмов вирусов, растений, животных и человека. Выявлена ключевая роль микро-РНК в нарушении баланса пролиферации, дифференцировки и программированной клеточной смерти при развитии различных заболеваний, в том числе онкологической патологии. Профиль микро-РНК зачастую различается между клетками различных тканей и опухолей, что в свою очередь может помочь определить органную принадлежность опухолей, предсказать ответ на терапию и определить прогноз течения болезни. В этом обзоре мы анализируем взаимосвязь между профилем экспрессии микро-РНК и фенотипом опухоли, а также обсуждаем возможное применение микро-РНК в клинической практике.

Механизм образования микро-РНК

Путь образования микро-РНК (miRNA) начинается с транскрипции кодирующих генов с помощью РНК полимеразы II. Отмечено, что у млекопитающих более 90% микро-РНК кодируются нуклеотидными последовательностями, которые находятся в интронах (участках ДНК, являющихся частью генов, но не содержащих информации о последовательности аминокислот кодируемого им белка). Для сравнения, только 14% микро-РНК червей и мух кодируются генами, локализованными в интронах [2, 3]. Интрон, состоящий из 400 пар нуклеотидов, вырезается из первичного транскрипта и становится первичной микро-РНК (pri-miRNA). На следующем этапе pri-miRNA под действием РНКазы III, названной Drosha, совместно с другими факторами превращается в «шпильку» — последовательности длиной в 70 нуклеотидов, называющиеся pre-miRNA (рис. 1). При помощи экспортина-5 шпилькообразная pre-miRNA попадает в цитоплазму, где под действием другой РНКазы III, названной Dicer, pre-miRNA расщепляется на короткие фрагменты, которые трансформируются в зрелые микро-РНК [4]. В результате образуются двуцепочечные РНК-дуплексы. Эти 21-нуклео-тидные РНК вовлечены в разнообразные биологические процессы большинства форм жизни (вирусов, растений, животных и человека). В настоящее время описано более 4000 микроРНК в 168 видах организмов [5]. Гены этих некодирующих РНК, составляют более чем 1% от всего генома человека и, как считается, регулируют функцию трети всех генов [6].

Номенклатура микро-РНК

Номер микро-РНК присваивается в соответствии с их открытием. На вид организма, из которого выделена микро-РНК, в названии указывает приставка из 3-4 букв, например: hsa-miR-101 обозначает, что данная микро-РНК выделена из клеток Homo sapiens. Сформировавшиеся микро-РНК обозначаются «miR», тогда как их предшественники обозначаются «mir». Также в названии фигурирует информация о структурной взаимосвязи различных микро-РНК. Например, hsa-miR-101 у человека и mmu-miR-101 у мышей являются ортологами, то есть идентичны по структуре. Паралогические микро-РНК отличаются по одной или двум нуклеотидным последовательностям, что обозначается дополнительным суффиксом в названии (например, mmu-miR-10a и mmu-miR-10b у мышей). Один ген может давать начало нескольким предшественникам микро-РНК, которые будут различаться в названии цифровым суффиксом (например, dme-mir-281-1 и dme-mir-281-2 в Drosophila melanogaster). Название усложняется и в случае, если различные участки одного предшественника дают начало различным микро-РНК (miR-17-5p и miR-17-3p) [1].

Механизм действия микро-РНК

Микро-РНК регулируют экспрессию генов путем ингибирования трансляции или разрушения специфических транскриптов матричной РНК (мРНК). Посттранскрипционное подавле-

Рисунок 1. Образование микро-РНК

miRNA

Роль микро-РНК при солидных опухолях ние экспрессии генов начинается тогда, когда микро-РНК рекрутирует белковый комплекс RISC (RNA-induced silencing complex). Одна из цепей двухцепочечного дуплекса микро-РНК (ведущая цепь) внедряется в белковый комплекс RISC. Данная структура представляет собой комплекс белков, которые способствуют связи микро-РНК с 3’ — нетранслируемым концом соответствующей мРНК-мишени [4]. Микро-РНК приводят к разрушению мРНК или подавлению трансляции с таргетной мРНК (рис. 2). При этом они способны подавлять трансляцию посредством различных механизмов: как на этапе инициации, так и в процессе элонгации. Механизм прекращения трансляции также зависит от степени комплементарности связывающихся областей микро-РНК и мРНК. Деградация мРНК включает такие процессы, как деаденилирование, декапирование и экзонуклеарное расщепление молекулы мРНК [7]. Однако до конца механизм действия микро-РНК еще не изучен.

тации, так и метилирования генов, кодирующих микро-РНК [8]. Большинство этих генов локализуется в хрупких сайтах и участках генома, что и объясняет их частую делецию или амплификацию в клетках злокачественных опухолей. В основополагающем исследовании, проведенном группой Croce, было выявлено, что частая делеция участка хромосомы 13q14 в клетках хронического лимфолейкоза приводит к нарушению работы двух микро-РНК: микро-РНК-15a, микро-РНК-16-1 [9]. Эти микро-РНК представляют собой первые микро-РНК онкосупрессоры, которые были открыты при исследовании функций микро-РНК в канцерогенезе. В дальнейшем исследования показали, что нарушение экспрессии микро-РНК в опухолевых клетках является распространенным явлением по сравнению с клетками нормальных тканей [10]. Это определяет необходимость дальнейших исследований изменений, ведущих к формированию опухолевого фенотипа.

Рисунок 2. Механизм действия микро-РНКК

Роль микро-РНК при онкологической патологии

Микро-РНК в «здоровых» клетках являются одним из основных регуляторов экспрессии генов, принимающих участие практически во всех процессах ее жизнедеятельности, поведении, размножения и развития. Злокачественные опухоли характеризуются неконтролируемым делением клеток, фенотип которых определяется нарушением экспрессии различных генов. Поэтому неудивительно, что образование микро-РНК часто нарушено в клетках различных опухолей. Аберрантная экспрессия микро-РНК может являться результатом как му-

Классификация опухолей по профилю микро-РНК

Около 4% всех опухолей имеют неясную гистопринадлежность. В здоровом организме профиль экспрессии микро-РНК зачастую имеет тканеспецифичный характер, также он специфичен для фазы развития организма и уровня дифференцировки клеток [10]. Ряд исследований показал различия в экспрессии микро-РНК между опухолевыми и неизмененными клетками, при этом в опухоли сохраняется и экспрессия тканеспецифичных микро-РНК [10, 11]. Поэтому микро-РНК могут помочь в определении природы опухолей неясной ги- стопринадлежности. В одном из исследований образцы 336 первичных и метастатических опухолей были классифицированы по экспрессии 48 микро-РНК, что позволило при «слепом» пересмотре образцов опухолей с уже определенным гистологическим подтипом правильно определить тканевую принадлежность опухоли в 86% случаев, включая 76% метастатических опухолей [12].

Недавно предложена к применению новая классификационная система, основанная на анализе данных экспрессии микро-РНК с помощью вычислительных исследований, называемая SFSSClass [Simultaneous Feature (miRNA) and Sample (tissue) Selection] [13]. Авторы создали данную классификационную технику, основываясь на предшествующих исследованиях. Проведя анализ литературы, посвященной изучению микро-РНК в опухолевой ткани, исследователи смогли определить «модули» микро-РНК с наиболее часто измененной экспрессией в различных опухолях. Было идентифицировано около 100 тканеспецифичных микро-РНК. Авторы применили данный набор микро-РНК для определения органопринадлежности низкодифференцированных опухолей, показав ее более высокую точность в сравнении с использованием мРНК [14].

Таким образом, у микро-РНК имеется значительный потенциал для использования с целью выявления органной принадлежности низкодифференцированных опухолей и метастатических опухолей с невыявленным первичным очагом.

Микро-РНК при некоторых солидных опухолях

Принимая во внимание, что профили экспрессии микро-РНК различаются между клетками нормальных и опухолевых тканей, исследователи поставили вопрос о возможности определения различий между подтипами опухолей и их специфическими онкогенными свойствами по профилю экспрессии микроРНК. При проведении исследований отмечено, что профиль экспрессии микро-РНК связан с наличием или отсутствием специфических онкогенных мутаций. Обнаружились связи между нарушениями регуляции микро-РНК и мРНК-мишенями [15]. Все это позволяет распутать некоторые уникальные генные связи.

Рак молочной железы

Рак молочной железы традиционно классифицируется на 4 подтипа: базально-подобный, люминальный А, люминальный В и HER-2 позитивный. Данная классификация основана на различии в экспрессии генов. Выявлено, что ряд микро-РНК неодинаково экспрессируются при базальном и люминальном подтипе рака молочной железы [16]. Эстроген-рецеп-тор положительные опухоли, прогестерон-ре-цептор положительные опухоли и HER-2/neu-положительные опухоли также различаются профилем экспрессии микро-РНК [17-20].

Некоторые микро-РНК, которые ассоциированы с люминальным или базальным подтипом, отражают их эпителиальную и миоэпителиальную природу, соответственно. К примеру, изменения экспрессии микро-РНК-200 ассоциировано с люминальным подтипом [21].

Члены семейства микро-РНК-200 регулируют поддержание клеткой эпителиального фенотипа путем ингибирования цинковых пальцев генов ZEB1 и ZEB2, которые способствуют эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) — процессу, который определяет способность опухолевых клеток к метастазированию [21]. Низкие значения микро-РНК-200 при базально-подобном подтипе рака молочной железы могут явиться объяснением высокого метастатического потенциала таких опухолей [22]. Кроме этого, представители семейства микро-РНК-200 участвуют в негативной регуляции клеточной инвазии, которая обусловлена сигналами с рецептора эпидермального фактора роста. Поэтому низкая экспрессия микро-РНК-200 ассоциирована с высоким потенциалом опухолевых клеток к инвазии [23].

Также при тройном негативном раке молочной железы отмечается выраженное снижение экспрессии микро-РНК-145 [24]. Данная молекула преимущественно экспрессируется в нормальных миоэпителиальных клетках. Снижение экспрессии микро-РНК-145 определяется в гиперпластических протоках и является одной из причин структурной пере-

Роль микро-РНК при солидных опухолях стройки миоэпителиальной ткани молочной железы [25].

При введении микро-РНК-145 извне в культуру клеток рака молочной железы отмечается усиление апоптоза опухолевых клеток [26]. Также микро-РНК-145 может подавлять способность клетки к инвазии и метастазированию путем снижения посттранскрипционной экспрессии гена метастазирования — MUC-1 (муцин-1) [27].

Для опухолей молочной железы с метастазами в регионарные лимфоузлы или с высоким пролиферативным индексом характерно повышение экспрессии let-7, что позволяет выделить группу больных с неблагоприятным прогнозом [28]. Ген Let-7 дает начало большому семейству микро-РНК, является одной из первых открытых микро-РНК. Данная молекула участвует в регуляции функций генов ras и c-myc [46].

Таким образом, в будущем станет возможно с помощью небольшого набора микроРНК определять подтип рака молочной железы и, более того, предсказывать биологические свойства опухоли. Нужно отметить, что в настоящее время для этого необходимо знать профиль экспрессии сотен мРНК (матричных РНК), что еще более подчеркивает вероятную значимость предиктивных способностей микро-РНК по сравнению с мРНК.

Рак яичников

При раке яичников разными исследовательскими группами по изучению микроРНК получены отличные друг от друга результаты. В ряде исследований значимая роль при раке яичников отводилась семейству микро-РНК-200. Отмечено, что в клетках рака яичников микро-РНК-200а, микро-РНК-141, микро-РНК-200c и микро-РНК-200b гиперэк-спрессированы, тогда как экспрессия микро-РНК-199а, микро-РНК-140, микро-РНК-145 и микро-РНК-125b1 снижена относительно нормальной ткани яичника [29, 30] (таблица 1). Также выявлено, что вследствие гипометилирования в опухолевой ткани яичников отмечается повышение экспрессии таких микро-РНК, как микро-РНК-203, микро-РНК-205 и микроРНК-21 [29]. Микро-РНК-200а и микро-РНК-200с гиперэкспрессированы в трех гистоло- гических типах: серозном, эндометриоидном и светлоклеточном раке, тогда как повышение уровня микро-РНК200b и микро-РНК-141 характерно только для эндометриоидного и серозного гистотипов. Таким образом, авторы с помощью сигнатур микро-РНК предложили не только отличать рак яичников от нормальной ткани, но и дифференцировать светлоклеточный гистологический тип рака яичников от других подтипов [29]. Этими же авторами показано отсутствие различий профиля микроРНК между опухолями с различной степенью дифференцировки и стадией заболевания. Авторы сделали вывод, что изменение экспрессии микро-РНК играет роль в развитии рака яичников, но не в прогрессировании заболевания.

При раке яичников также отмечена гиперэкспрессия микро-РНК-214, которая, как считают, ассоциирована с резистентностью опухолевых клеток к цисплатину [31]. Более того, механизм действия микро-РНК-214 связан, вероятно, с подавлением трансляции белка PTEN, что приводит к активации Akt сигнального пути. Возможно, с помощью микро-РНК удастся пролить свет на развитие резистентности к препаратам платины у больных раком яичников.

В другом исследовании, проведенном в MSKCC, на архивном материале 62 больных раком яичников определяли сигнатуру микроРНК. В этой работе получены противоположные данные вышеописанным исследованиям. Не было выявлено гиперэкспрессии представителей семейства микро-РНК-200. С другой стороны, выделено 19 микро-РНК с повышенной экспрессией. Из них только 2 обладало значимым влиянием на выживаемость — микроРНК-410 и микро-РНК-645. Данный набор из 2 микро-РНК был валидирован на 123 больных. При многофакторном анализе обе микро-РНК оказывали влияние на продолжительность жизни независимо от стадии болезни, степени дифференцировки опухоли, возраста и объема циторедуктивной операции [32]. Медиана продолжительности жизни при высокой экспрессии данных микро-РНК составила 70 месяцев, при низкой экспрессии — 40 месяцев. При анализе возможных патогенетических мишеней для микро-РНК-410 и микро-РНК-645 наибольшее значение придается мРНК генов транскрипционного фактора NF- κ B и фермен-

Таблица 1. Микро-РНК при раке яичников

Микро-РНК	Мишень — мРНК гена	Клиническое значение	Ссылка
микро-РНК-200а микро-РНК-200b микро-РНК-200с микро-РНК-141	PTPN12 (для микро-РНК-200b)	Ассоциирована с гистотипом опухоли	29, 30
микро-РНК-214	PTEN	Высокая экспрессия ассоциирована с резистентностью к химиотерапии	31
микро-РНК-410	NF- κ B, HDAC1	Высокая экспрессия ассоциирована с низкой выживаемостью	32
микро-РНК-645	NF- κ B, HDAC1	Высокая экспрессия ассоциирована с низкой выживаемостью	32

та гистон-деацетилазы (HDAC1), участвующего в эпигенетической регуляции. Таким образом, сделано предположение, что микро-РНК семейства 200 участвуют в процессе канцерогенеза, тогда как микро-РНК-410 и микро-РНК-645, по-видимому, уже отражают биологический характер опухоли.

Другое интересное направление в микроРНК — определение сигнатур микро-РНК в эк-зосомах плазмы крови. Экзосомы и эндосомы — органеллы размером 50-100 нм, активно секретирующиеся путем экзоцитоза. Как считается, они играют важную роль в активации Т-лимфоцитов и, вероятно, обладают иммуносупрессивной функцией [33]. Одно из первых исследований, посвященных определению микроРНК в экзосомах, проводилось на образцах крови больных раком яичников. В сыворотке крови пациенток с различными стадиями рака яичников, а также в крови здоровых женщин и женщин с доброкачественными опухолями яичников определяли уровень циркулирующих экзосом. Было показано, что в сыворотке крови больных раком яичников концентрация экзосом была выше, чем у больных с доброкачественными опухолями и в группе здоровых женщин. Также отмечено, что женщины с более распространенными стадиями болезни имели и более высокие уровни циркулирующих в крови экзосом. Главной целью исследования явилось доказательство того, что микро-РНК, которые гиперэкспрессированы в опухоли, определяются и в циркулирующих в крови экзосомах. Исследователям удалось выявить, что из 218 микро-РНК, определяемых в опухолевой ткани 50 больных, уровень 175 микро-РНК достоверно не отличался от уровней микро-РНК в циркулирующих в крови экзосомах. Двенадцать микроРНК определялись в более низких концентрациях в экзосомах, а концентрация 31 микро-РНК была выше в экзосомах по сравнению с опухолевой тканью. Эти микро-РНК не были выявлены в группе контроля и определялись в значительно более низких концентрациях в экзосомах при доброкачественных опухолях яичников. Авторы не уточняют количество больных, у которых отмечалось совпадение по определенным микро-РНК, однако указывают, что наибольшая корреляция между уровнями микро-РНК в опухолевой клетке и в экзосомах была отмечена для 8 микро-РНК: микро-РНК-21, микро-РНК-141, микро-РНК-200a, микро-РНК-200b, микро-РНК-200c, микро-РНК-203, микро-РНК-205, и микроРНК-214 [34].

Авторы предложили использовать профиль экзосомальных микро-РНК для скрининга в выявлении бессимптомного рака яичников и в выявлении рецидива болезни. Несмотря на предварительный характер результатов исследования, данное сообщение дает надежду на выявление нового биомаркера при раке яичников.

Рак толстой кишки

В процессах канцерогенеза опухолей толстой кишки описано как усиление, так и подавление или полное прекращение экспрессии различных микро-РНК [35-38]. Schetter с коллегами выявили, что ряд микро-РНК (микро-РНК-106а, микро-РНК-181b и микро-

Роль микро-РНК при солидных опухолях

РНК-203) имеют более высокие показатели экспрессии в клетках рака толстой кишки в сравнении с неизмененной слизистой оболочки толстой кишки. Но нельзя однозначно утверждать, что данные изменения были ответственны за развитие опухоли, а не были просто ассоциированными с опухолью [39].

В одном из исследований была изучена роль микро-РНК-143 и микро-РНК-21 в 11 образцах аденокарцином толстой кишки и неизмененной слизистой оболочки толстой кишки от одних и тех же больных. Отмечено, что среди пациентов моложе 50 лет безотносительно к стадии заболевания чаще наблюдались более низкие показатели экспрессии микро-РНК-143. Тогда как для пациентов старше 50 лет и с более высокой степенью инвазии опухоли и метастазами в лимфоузлы были характерны более высокие уровни микро-РНК-21 [40]. С этого начались публикации большого количества работ, посвященных микро-РНК-21 при раке толстой кишки.

Ингибирование микро-РНК-21 приводит к снижению пролиферации клеток рака толстой кишки, что сопровождалось подавлением экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2. Интересно, что при аденомах также отмечена гиперэкспрессия микро-РНК-21 в сравнении с клетками прилегающей неизмененной слизистой [41, 42]. С помощью ПЦР анализа определялся уровень экспрессии микро-РНК-21 в 60 образцах рака толстой кишки и 40 образцах нормальной ткани. Выявлено, что повышенный уровень экспрессии микро-РНК-21 в опухоли был ассоциирован с более низкими показателями общей выживаемости (р=0,043) [44]. Ранее в предклинических работах сообщалось, что более высокая экспрессия микро-РНК-21 была связана с такими признаками опухоли, как высокий потенциал инвазии, способность к интравазации и метастазированию [45]. Также выявлено, что при воздействии антисмысловых последовательностей микроРНК-21, подавляющих ее функционирование, пролиферация в клеточных линиях рака толстой кишки с подавлением экспрессии р53 и в линиях, клетки которых экспрессируют мутантный тип р53, не изменялась. В клетках с диким типом р53 наблюдалось снижение пролиферации на 20% после трансфекции антисмысловых последовательностей микроРНК-21 [44].

В другом исследовании авторы показали, что уровень экспрессии микро-РНК-21 в строме опухоли повышается с увеличением стадии заболевания. Отмечено, что при высоких значениях микро-РНК-21 в строме опухоли продолжительность жизни больных раком толстой кишки меньше. Исследователям удалось выделить микро-РНК-21 из парафиновых блоков тканей опухоли 187 больных раком толстой кишки 2 стадии (130 — ободочная кишка, 67 — прямая кишка). В течение 5 лет у 63 пациентов было зарегистрировано прогрессирование болезни. Отмечена статистически значимая обратная взаимосвязь между экспрессией микро-РНК-21 и временем до прогрессирования (р<0,01) среди больных раком ободочной кишки, но не раком прямой кишки. По данным многофакторного анализа, данное влияние экспрессии микро-РНК-21 на время до прогрессирования оказалось независимо от других клинических параметров (возраста, пола, общего числа лейкоцитов, статуса гена KRAS и микро-сателлитной нестабильности). Таким образом, авторам с помощью определения экспрессии микро-РНК-21 в строме опухоли удалось выявить подгруппу пациентов со 2 стадией рака ободочной кишки, которые имели неблагоприятный прогноз течения болезни [43].

Таким образом, уровень микро-РНК-21 как в опухолевых клетках, так и в строме опухоли можно рассматривать как потенциальный прогностический биомаркер, позволяющий определить неблагоприятный прогноз у пациентов с диссеминированным раком толстой кишки.

Другой интересной микро-РНК при раке толстой кишки является микро-РНК-106а. Выявлено, что снижение уровня микро-РНК-106а ассоциировано с более низкими показателями времени до прогрессирования и продолжительности жизни больных раком толстой кишки, а также и со стадией заболевания. Микро-РНК-106а действует как опухолевый супрессор, поэтому обратно коррелирует с уровнем экспрессии онкогена E2F1. Снижение уровня микро-РНК-106а ассоциировано с более короткой продолжительностью жиз-ни[45]. Это наблюдение позволяет сделать вывод о возможном использовании определения микро-РНК-106а в качестве прогностического маркера при раке толстой кишки.

Выявлено, что при различных мутациях генов в опухолевых клетках меняется и профиль экспрессии микро-РНК. Так для клеток рака толстой кишки с мутацией генов KRAS и/или BRAF характерно повышение экспрессии таких микро-РНК, как микро-РНК-31, микро-РНК-96, микро-РНК-135 [46]. Роль этих и других микро-РНК при раке толстой кишки представлена в таблице 2.

Большое клиническое значение отводится возможности прогнозирования ответа на специфическое лечение. Ряд микро-РНК коррелируют с негативным ответом на специфическое лечение. В различных опухолях экспрессия микро-РНК-21 является индикатором неблагоприятного прогноза [53, 54] и также ассоциирована с плохим ответом на адъювантную терапию при аденокарциномах [42]. Высокие уровни микро-РНК-125b при раке молочной железы предсказывают отсутствие ответа клеточных линий опухоли при применении так-санов [56]. Аналогичные сообщения представлены и в отношении микро-РНК-21 при раке поджелудочной железы и чувствительностью опухоли к гемцитабину [57].

Эти находки подчеркивают важность этого альтернативного направления в изучении развития резистентности к различным препаратам.

Микро-РНК и лечение

Разработаны различные подходы к применению микро-РНК в терапии опухолей. Первый путь — комбинация стандартной терапии с препаратами, влияющими на экспрессию микро-РНК. К примеру, экспрессия микроРНК-21 в гемцитабин-резистентных клетках рака поджелудочной железы может уменьшаться под действием аналогов куркумина, приводя к реактивации гена PTEN, являющегося опухолевым супрессором [58]. Также авторы отмечают повышение экспрессии микро-РНК-200с при обработке культуры гемцитабин-ре-зистентных клеток аналогами куркумина, что, возможно, приводит к обратной эпителиальномезенхимальной трансформации. Это, по мнению авторов, может сопровождаться возвра-

Таблица 2. Некоторые микро-РНК при раке толстой кишки

Ми-РНК	Экспрессия микро-РНК	Мишень — мРНК гена	Биологическое и клиническое значение	Ссылка
микро-РНК-21	Повышена	Bcl-2, TIMP, PDCD4	Ассоциировано с высокой стадией, N+, M1, низкой ОВ, клеточной пролиферацией, васкуляризацией опухоли	42, 44
Let-7	Снижена	RAS, c-myc	Повышение клеточной пролиферации	46
Let-7 g*	Повышена	TGFR-2, RAS, cyclin-D, cytochrome c	Повышение клеточной пролиферации и подавление апоптоза	47, 48
микро-РНК-125b	Повышена	VEFG, VEGFR, IGFR-1	Снижение клеточной пролиферации и ангиогенеза, но ассоциирована с резистентностью к терапии	49
микро-РНК-137	Повышена	TGF2I	Поддержание опухолевого фенотипа	49
микро-РНК-34а	Снижена	E2F, p53	Ингибирование клеточного роста	50
микро-РНК-106а	Снижена	E2F	Ассоциировано с более высокой стадией, снижением ВДП и ОВ	45, 51

*Let-7 g — представитель семейства микро-РНК let-7, ОВ — общая выживаемость, ВДП- время до прогрессирования.

Роль микро-РНК при солидных опухолях щением чувствительности к гемцитабину [59]. Таким образом, комбинация стандартной терапии с препаратами, влияющими на экспрессию микро-РНК, может быть эффективной стратегией при лечении злокачественных опухолей.

Второе направление — применение антисмысловых последовательностей микро-РНК (анти-микро-РНК). Антисмысловая последовательность — короткая однонитевая последовательность нуклеотидов, комплементарная молекуле микро-РНК. После связывания с нуклеотидной последовательностью микроРНК последняя не может распознавать свою мишень — мРНК, в результате чего возобновляется синтез белка с мРНК-мишени. Первое сообщение о терапевтическом применении антисмысловых микро-РНК появилось в начале 2008 года [60]. Анти-микро-РНК, конъюгированные с холестеролом, обладают способностью ингибировать микро-РНК in vivo в организмах мышей. Введение таких антисмысловых олигонуклеотидов эффективно ингибирует зрелые микро-РНК в печени в течение 23 дней. Ингибирование микро-РНК-21 и микро-РНК-200b привело к увеличению чувствительности клеток холангиоцеллюлярного рака к гемцитабину, а снижение экспрессии микро-РНК-141 — к подавлению клеточного роста [61]. В другом исследовании введение антисмысловых последовательностей микроРНК-16 (часто экспрессирована при различных опухолях) приводит к полному исчезновению микро-РНК-16 во всех тканях у мышей, за исключением головного мозга [62].

Третий путь применения микро-РНК в терапии опухолей — использование самих микро-РНК для подавления опухолевого роста. Scott с соавторами удалось снизить инвазию и миграцию клеток рака молочной железы с помощью микро-РНК-125 [63].

Четвертым путем воздействия на экспрессию микро-РНК может служить применение других эпигенетических механизмов — модификация гистонов или метилирование ДНК. Так, при раке яичников гипометилирование ДНК ответственно за гиперэкспрессию микроРНК-21, микро-РНК-203 и микро-РНК-205 [29]. В будущем такие препараты, как ингибиторы деацетилазы гистонов и деметилирующие агенты, могут быть применены для восстановления экспрессии соответствующих микро-

РНК, что приведет к реверсии опухолевого фенотипа в фенотип нормальной клетки.

Таким образом, перед онкологами открывается большое перспективное направление в терапии онкологических заболеваний.

Перспективы и ограничение применения микро-РНК в онкологии

Доказана возможность первичной идентификации микро-РНК с помощью определения широкого спектра профиля экспрессии генов. Этот подход значительно упростился в результате внедрения таких новых методов, как микрочипирование микро-РНК, высокоэффективное глубокое секвенирование и цитофлуориметри-ческий анализ с сортировкой клеток на бусах [64, 65]. С помощью данных методов расширился спектр микро-РНК, выявляемых в опухолевых клетках. Таким образом, для расшифровки сложной сети взаимосвязей патогенетических путей в опухолевых клетках рекомендуется совместное определение профиля экспрессии генов микро-РНК и мРНК параллельно с изучением модели экспрессии транскрипционных факторов [67]. Тем не менее, среди различных методов генетической диагностики применение методов по определению сигнатур микро-РНК имеет ряд преимуществ над методами по определению профилей экспрессии традиционной мРНК, так как стабильность образцов с микроРНК выше, чем мРНК [66].

Несмотря на все преимущества применения микро-РНК в клинической практике, в настоящий момент имеются следующие ограничения. Так, Blenkiron с соавторами сообщили о низком соответствии результатов своих исследований по взаимоотношению экспрессии микро-РНК и цитоморфологических факторов с результатами предшествующих исследований [17]. Такие различия обычно обусловлены особенностями опухолевого материала или методов подготовки препарата, дизайном эксперимента и/или анализом данных [68]. Кроме этого, использование различных методов для нормализации данных может объяснять некоторую вариабельность в результатах различных исследований [69]. Другим объяснением таких несоответствий между исследовательскими группами может являть- ся возможность быстрого изменения уровня микро-РНК при стрессе и гипоксии [70, 71], так как время взятия и транспортировки материала могут влиять на уровень микро-РНК.

Использование микро-РНК в качестве биомаркера, который способен предсказывать риск развития рака, является еще более значимым, так как в настоящее время таких известных маркеров очень мало. Некоторые исследователи сообщили, что уровень экспрессии некоторых микро-РНК может отличаться между представителями различных этнических групп и при различных опухолях [72]. Поэтому рекомендуется валидировать, полученные данные об экспрессии микро-РНК на больных со сходными характеристиками.

Тем не менее, результаты недавних исследований вселяют оптимизм. И в настоящее время первичной целью является всесторонняя валидация полученных результатов и унификация методов выделения микро-РНК, что позволит внедрить анализ микро-РНК в диагностику и лечение онкологических заболеваний.