Роль микроокружения в развитии и прогрессии рака поджелудочной железы

Рак поджелудочной железы (РПЖ) является крайне агрессивной опухолью с 5-летней выживаемостью менее 5 % [16, 23]. Высокий уровень запущенности (среднероссийский показатель – 59,4 %, а по некоторым регионам – до 80 %), быстрая и стойкая инвалидизация, низкая (от 4 до 12 мес) продолжительность жизни у больных, не получавших специальное лечение, высокая летальность (42,8 %) позволяют рассматривать РПЖ как актуальную проблему современной онкологии [3]. Как ожидается, в следующем десятилетии в США РПЖ станет второй по значимости причиной смерти от онкологических заболеваний [17]. Такие неутешительные прогнозы обусловлены поздней диагностикой РПЖ, связанной с длительным скрытым течением заболевания, склонностью к метастазированию, а также малой эффективностью лечения [23]. Последнее обстоятельство ведет к поиску новых подходов в подавлении опухолевого роста – созданию принципиально новых препаратов, влияющих на генетические механизмы развития опухоли, метаболические изменения в опухолевых клетках, ферментов, обладающих противоопухолевой активностью [15, 16, 17]. Использование таргетных препаратов, направленных на молекулярные изменения в раковых клетках, позволило добиться значительных успехов в лечении меланомы, колоректального рака, рака легких, чего, к сожалению, не наблюдается при РПЖ [16, 23].

С этих позиций одним из перспективных направлений онкологии является изучение микроокружения опухоли [16, 21, 44, 49]. Микроокружение (МО) способствует развитию гипоксии и гиповаскуляризации опухоли, играет ключевую роль в инвазивном росте и метастазировании аденокарциномы поджелудочной железы [13, 21, 40]. По мнению M.V. Apte (2013), неудачи в лечении РПЖ могут быть связаны с игнорированием влияния МО на рост опухоли; его изучение поможет существенно повысить эффективность терапии РПЖ [7]. Интерес к проблеме МО при РПЖ можно проследить и по названиям отечественных и зарубежных публикаций: «Микроокружение опухоли – темная лошадка в противоопухолевой химиотерапии» [1], «Pancreatic cancer: The microenvironment needs attention too!» [6], «Tumor microenvironment – Achilles heel of pancreatic cancer?» [23].

Микроокружение опухоли представляет собой среду, окружающую ткань новообразования, в которой происходит взаимодействие клеточных и внеклеточных элементов. Стромальное МО опухоли поджелудочной железы включает несколько типов клеток, основные из которых: панкреатические звездчатые клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, нервные клетки, клетки воспаления и внеклеточный матрикс, формирующие выраженную десмопластическую реакцию, которая является характерным признаком РПЖ [6, 21, 57, 60]. Последние исследования показывают, что строма опухоли – это не пассивная опора для опухолевых клеток, а активный участник канцерогенеза [13, 15, 35, 40].

Панкреатические звездчатые клетки (ПЗК) человека впервые были описаны N. Watari в 1982 г., а в 1998 г. M.G. Bachem и M.V. Apte получили культуру ПЗК животных и человека. Это открытие позволило получить клетки для дальнейшего исследования их функции и оценки роли стромы поджелудочной железы в развитии рака. Происхождение ПЗК до конца не изучено. Вероятно, что они имеют мезенхимальное, энтодермальное и нейроэктодермальное происхождение. В состоянии покоя в здоровых тканях ПЗК составляют около 4–7 % от популяции клеток поджелудочной железы. Они локализуются вокруг мелких сосудов и протоков поджелудочной железы и являются основными клетками, отвечающими за поддержание нормальной гистологической структуры органа [5]. Последнее свойство реализуется за счет способности ПЗК экспрессировать матриксные металлопротеиназы (ММП) 2, 9 и 13, участвующие в деградации экстрацеллюлярного матрикса, и тканевые ингибиторы металлопротеиназ 1 и 2, которые ингибируют активность ММП. Таким образом поддерживается баланс между синтезом и деградацией экстрацеллюлярного матрикса в тканях здоровой поджелудочной железы [13, 60]. Кроме этого, отмечается способность ПЗК к пролиферации, миграции, синтезу и секреции белков экстрацеллюлярного матрикса: коллагена, фибронектина и ламинина [7, 60]. Переход ПЗК из состояния покоя в активное состояние (активные миофибробласты) происходит под влиянием различных эндогенных веществ, среди которых ведущую роль играют трансформирующий фактор роста β1, тромбоцитарный фактор роста, фактор некроза опухоли-α, фактор роста гепатоцитов, интерлейкины. Их активация наблюдается под действием алкоголя, эндотоксинов, при острых или хронических воспалительных процессах в поджелудочной железе [5, 7, 37]. По принципу аутокринной регуляции выработка вышеперечисленных факторов может приводить к продолжению активации ПЗК [11, 57]. Активированные ПЗК взаимодействуют с опухолевыми клетками, способствуя их миграции, пролиферации и ингибируя апоптоз [6, 36, 60]. В 2008 г. исследования in vivo двух независимых групп ученых США и Австралии показали, что совместное введение мышам клеток опухоли поджелудочной железы и ПЗК способствовало образованию более крупных опухолей с высокой плотностью раковых клеток и быстрым метастазированием, а также переходу звездчатых клеток поджелудочной железы в активное состояние и прогрессированию фиброза [26, 57]. Участие ПЗК в прогрессировании фиброза поджелудочной железы позднее было подтверждено в других исследованиях [5, 6, 13].

Помимо опухолевых клеток, мишенью для ПЗК могут служить эндотелиальные и нервные клетки, β-клетки островков Лангерганса, что ведет к ангиогенезу, нейрогенезу, дисфункции β-клеток и их апоптозу. Влияние ПЗК на иммунную систему проявляется в индуцировании апоптоза Т-лимфоцитов, уменьшении Т-клеточного инфильтрата, что позволяет защитить клетки опухоли от иммунного надзора и приводит к прогрессированию РПЖ [36]. Этому также способствует особенность ПЗК стимулировать пролиферацию клеток поджелудочной железы посредством секреции периостина (остеобласт-специфического фактора 2) [35, 57]. В 2007 г. M. Erkan et al. доказали, что у больных РПЖ, имеющих повышенную экспрессию периостина, наблюдаются снижение показателей выживаемости [22]. В свою очередь, клетки опухоли действуют на ПЗК, вызывая пролиферацию и миграцию последних, участвуют в производстве и деградации внеклеточного матрикса [6, 36, 57]. Опыты in vitro доказали способность клеток опухоли индуцировать синтез коллагена I, V типов и фибронектина звездчатыми клетками, что может способствовать опухолевой прогрессии [8, 60]. Синтез коллагена стимулируется фактором некроза опухоли-α и интерлейкином-10; ингибирование синтеза происходит в ответ на активацию интерлейкина-6 [37].

В последних исследованиях отмечается важная роль ПЗК в процессе метастазирования опухоли. Мигрируя совместно со злокачественными клетками опухоли, звездчатые клетки играют роль важного благоприятного фактора для успешной инвазии и пролиферации опухолевых клеток. Вероятно, что ПЗК через секрецию цитокинов вовлекают местные стромальные клетки в метастатические узлы и тем самым стимулируют рост опухоли [60]. Транскрипционным регулятором ПЗК является витамин-Д-рецептор, экспрессированный в ядрах клеток стромы опухоли поджелудочной железы. Лиганды витамин-Д-рецептора способствуют торможению пролиферации ПЗК. Это приводит к уменьшению фиброза и воспалению в ткани поджелудочной железы и одновременно подавляет сигнальные пути поддержания опухолевого роста, что было доказано M.H. Sherma et al. на моделях экспериментального панкреатита у мышей [52].

Второй важной клеточной составляющей МО РПЖ являются фибробласты. Переходу нормальных фибробластов в опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ) могут способствовать клетки опухоли поджелудочной железы. Механизм этого преобразования до конца не изучен. Среди факторов, способствующих образованию ОАФ, выделяют ростовые факторы и секрецию мРНК клетками опухоли [24, 45]. Накопленные данные свидетельствуют о том, что ОАФ способствуют росту опухоли, активно взаимодействуя с раковыми клетками. К механизмам канцерогенеза, которые поддерживаются ОАФ, относят увеличение ангиогенеза, пролиферацию и инвазию опухоли, а также ингибирование апоптоза опухолевых клеток [11, 12, 44]. Эти эффекты опосредованы через экспрессию и секрецию многочисленных факторов роста, интерлейкины и белки внеклеточного матрикса, такие как трансформирующий фактор роста β, ММП, фактор роста фибробластов 2, белки скелетон и палладин [12, 44]. Немаловажная роль в этом процессе отводится фибробласт-активирующему белку (ФAБ), относящемуся к семейству сериновых протеаз. Впервые он был выделен как белок, экспрессированный на мембране клеток астроцитомы и саркомы [30]. Работы последних лет убедительно доказывают роль ФAБ в канцерогенезе [30, 33]. Высокая экспрессия этого белка в фибробластах и клетках опухоли была убедительно связана с выраженной десмоплазией и худшим прогнозом выживания больных, страдающих РПЖ [32, 53]. Второй белок, участвующий в канцерогенезе и вырабатываемый фибробластами МО опухоли, – остеонектин. Это кислый секретируемый белок, богатый цистеином, который синтезируется многими типами клеток и в здоровом организме принимает участие в процессах заживления ран, миграции клеток и межклеточном взаимодействии. Выявлена его экспрессия и в опухолевых тканях. Низкий уровень экспрессии остеонектина определяется при раке яичников, колоректальном раке и РПЖ [4]. Избыточная экспрессия остеонектина в клетках МО опухоли поджелудочной железы способствует ингибированию ангиогенеза и стимулирует клетки опухоли к инвазии и метастазированию [41]. В рандомизированных исследованиях доказана связь между сверхэкспрессией остеонектина и низкой выживаемостью больных РПЖ, что свидетельствует о прогностической значимости этого белка [54]. Ограничение его экспрессии гемцитабином приводило к увеличению отдаленной выживаемости [54]. Выявление гиперэкспрессии остеонектина в раковых клетках при РПЖ, напротив, не влияет на показатели [28].

Взаимосвязь между ПЗК и ОАФ была установлена при совместном культивировании этих клеток со злокачественными клетками РПЖ, что приводило к увеличению инвазивных свойств опухоли [50]. Однако не все так однозначно в отношении роли фибробластов в канцерогенезе РПЖ. В обзорной статье A. Neesse et al. приводят данные, что ОАФ могут скорее сдерживать, чем поощрять, рост опухоли [40]. Более того, в другом исследовании было выявлено, что фиброз, наблюдаемый как на ранних, так и на поздних стадиях развития РПЖ, связан с повышением уровня коллагена 1-го типа, миофибробластов и выполняет защитную роль. Высокие уровни ОАФ связаны с более позитивным прогнозом у больных [43]. В целом ясного ответа на вопрос о роли ОАФ при РПЖ на сегодняшний день нет. Стоит отметить, что терапевтические под- ходы, направленные на модуляцию функциональной роли ОАФ, требуют тщательного анализа.

Иммунные/воспалительные клетки являются составной частью стромального МО опухоли поджелудочной железы и способствуют прогрессии опухоли, устойчивости ее к химиотерапии и метастазированию [25, 38]. Исследование воспалительных (иммунных) инфильтратов стромы РПЖ у людей показало присутствие в них макрофагов, тучных клеток и Т-лимфоцитов [25, 38, 56]. Как известно, предшественниками макрофагов являются моноциты, циркулирующие в периферической крови. Под действием хемоаттрактантов, таких как фактор роста эндотелия сосудов, тромбоцитарный фактор роста, эндотелин, происходит их миграция в ткани опухоли [9]. Здесь макрофаги претерпевают существенные фенотипические изменения, отражающиеся на их функциях. Активированные под действием Т-лимфоцитов хелперов 1-го типа (Th1) макрофаги 1-го типа (классический путь активации) приобретают способность активно фагоцитировать и подавлять рост опухоли, в то время как макрофаги 2-го типа, активированные по альтернативному пути (под действием Т-лимфоцитов хелперов 2-го типа – Th2), могут способствовать опухолевой прогрессии [2, 27]. Проопухолевые эффекты макрофагов 2-го типа могут быть сведены к стимуляции ангиогенеза, облегчению инвазии и метастазирования опухоли, подавлению противоопухолевого иммунного ответа и защите опухолевых клеток от химиотерапии [2, 38]. При исследовании клеточного состава МО опухоли определялись как макрофаги 1-го типа, локализованные в хорошо оксигенированных участках, так и 2-го типа, с преобладающим нахождением в области гипоксии [14, 27]. Данные последних лет показывают возможность преобразования противоопухолевых макрофагов 1-го типа, выявляемых при хроническом панкреатите или в доклинической стадии развития опухоли, в проопухолевые макрофаги при прогрессировании роста злокачественной ткани [27]. Участие опухоль-ассоциированных макрофагов в формировании выраженной десмопластической реакции стромы через активацию ПЗК было доказано в исследовании A. Schmid-Kotsas et al. [51]. Существуют данные, что блокада хемокиновых рецепторов CCR1, экспрессированных макрофагами в МО опухоли, снижает процессы образования фиброза наряду с повышением продолжительности жизни [42].

Анализ субпопуляций Т-лимфоцитов, полученных из инфильтратов стромы, выявил наличие СD4+ (относительное увеличение числа), СD3+, СD45+; CD8+, продуцирующих ИФН-γ, а также Т-хелперов, продуцирующих ИЛ-17 [56]. Однако наличие этих клеток в МО опухоли еще не свидетельствует об их активной борьбе с опухолью, что вполне можно было бы ожидать, учитывая функции иммунной системы. Последние исследования показали недостаточную эффекторную функцию Т-лимфоцитов вследствие их функционального истощения, возникающего из-за часто повторяющегося действия агрессивных факторов [56]. Исследования последних лет, посвященные изучению клеток иммунной системы в МО опухоли, доказали корреляционную связь между выживаемостью пациентов и содержанием макрофагов (CD68+, CD163+, CD204+), нейтрофилов (CD66b+) в МО опухоли [29, 55]. Индуцировать иммунную толерантность в МО опухоли способны экзосомы, выделяемые клетками опухоли, Т- и В-лимфоцитами, макрофагами, что ведет к опухолевой инвазии и метастазированию [58]. Этот процесс может опосредоваться через подавление эффекторной функции CD8+Т-клеток и NK-клеток, что показано в различных исследованиях [34].

Десмоплазия. При РПЖ строма занимает до 90 % объема опухоли и, с одной стороны, ограждает здоровые ткани от инвазии злокачественных клеток, с другой – является барьером для проникновения лекарственных препаратов [15, 21, 47, 57, 60]. Такое значительное формирование плотного стромального компонента носит название десмоплазии или десмопластической реакции [27]. Именно в выраженной стромальной реакции заключается уникальность гистологической структуры РПЖ. Как было сказано выше, в развитии десмоплазии играют важную роль клетки МО опухоли. Изучение влияния ростовых факторов на этот процесс доказало активное участие фактора роста гепатоцитов (ФРГ). Несмотря на то, что с момента его открытия прошло более 25 лет [39], роль этого фактора остается не до конца выясненной. ФРГ представляет гликопротеин и вырабатывается стромальными клетками мезенхимального происхождения. Являясь сильным митогенным фактором, ФРГ стимулирует регенерацию ткани печени, легких, активирует пролиферацию эпителиоцитов, меланоцитов, кардиомиоцитов и клеток эндотелия сосудов [39]. Реакция клеток на ФРГ инициируется связыванием с его специфическим рецептором – трансмембранной тирозинкиназой, кодируемой протоонкогеном c-Met. Однако гиперактивация этого пути через сверхэкспрессию ФРГ клетками МО опухоли и c-Met-рецептора на клетках опухоли приводит к усилению активности различных сигнальных путей, способствующих прогрессированию злокачественного процесса [20]. Исследования L.W. Qian et al. показали, что экспрессия ФРГ в стромальных тканях коррелировала с усилением инвазии раковых клеток поджелудочной железы только при высокой экспрессии c-Met [46]. Поэтому модуляция активности c-Met может препятствовать дальнейшему развитию рака и подавлению метастазирования [10, 20]. Участие ФРГ в развитии десмоплазии в опухоли до сих пор не ясно и может заключаться в усилении активности различных ростовых факторов, таких как трансформирующий фактор роста β1, тромбоцитарный фактор роста, фактор некроза опухоли-α и интерлейкинов-1 и 6, что будет приводить к активации ПЗК с поддержанием выраженной десмопластической реакции [48].

В последние годы активно исследуется вопрос о степени выраженности десмопластической реакции в метастазах. C.J. Whatcott et al. при исследовании уровня маркеров десмоплазии при РПЖ отметили их повышение как в первичной опухоли, так и в отдаленных метастазах [59]. Изучение механизмов развития фиброзных изменений в метастазах, определение степени участия в этих процессах клеток МО позволит с большим успехом применять химиотерапевтические препараты [59].

Большое число исследований последних лет было посвящено изучению значения экстрацеллюлярного матрикса МО в росте и инвазии опухоли. Экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ) представляет собой неклеточную составляющую, состоящую из волокнистых белков, полисахаридов (гиалуроновая кислота), гликопротеинов (фибронектин) и воды. ЭЦМ играет важную роль в дифференциации, ремоделировании и гомеостазе здоровых органов [23]. Состав ЭЦМ не является постоянным, а может меняться в зависимости от воздействия внешних факторов, состояния окружающих клеток, наличия опухолевого процесса [21, 49]. В тканях поджелудочной железы в поддержании нормальной структуры ЭЦМ принимают участие ПЗК и фибробласты, вырабатывающие и организующие коллаген I и III типов, фибронектин, ламинин, эластин и гиалуроновую кислоту [7, 33, 49, 60]. При РПЖ компоненты внеклеточного матрикса претерпевают структурные и функциональные изменения и начинают активно участвовать в развитии опухоли [21, 31]. В частности, выявлено участие коллагена I типа в развитии резистентности к гемцитабину, используемому для лечения РПЖ [19], коллагена V типа в прогрессировании опухолевого процесса [8]. Повышение гиалуроновой кислоты в строме РПЖ приводит к значительному повышению давления интерстициальной жидкости, что в конечном итоге приводит к гиповаскуляризации и снижению сосудистой проницаемости в опухоли [31].

Понимание роли стромальных компонентов МО в опухолевой прогрессии имеет важное значение для разработки новых методов терапии РПЖ. К приоритетным направлениям относятся влияние на активность ПЗК и фибробластов [11, 16, 18, 35], активация клеток иммунной системы в МО опухоли [13, 17], влияние на компоненты ЭЦМ [23, 49], внутриклеточные сигнальные пути [13, 24, 47], клеточный метаболизм [13, 16, 17]. Учитывая выраженность десмоплазии при РПЖ, а также ее двойственную роль в прогрессии злокачественного процесса, интерес представляют механизмы, модулирующие ее состояние, а не простое ее уничтожение [11, 47].

Таким образом, опухолевое МО представляет гетерогенную систему, состоящую из различных типов клеток, белковых молекул. РПЖ характеризуется специфической десмопластической реакцией, выражающейся в формировании значительного стромального компонента. Эта особенность привела к тому, что исследования МО РПЖ начались одними из первых по сравнению с исследованиями других злокачественных новообразований. Срав- нительно недавно начался новый этап в понимании функциональной роли МО, заключающийся в выявлении его новых противоопухолевых качеств, что отдаляет перспективу использования МО в качестве мишени для терапевтических интервенций. Дальнейшее исследование МО необходимо для лучшего понимания механизмов развития злокачественных новообразований, а также для разработки новых терапевтических стратегий при РПЖ.