Роль молекулярно-генетической диагностики в выборе терапии при опухолях билиарного тракта

Опухоли билиарного тракта – группа новообразований, анатомически подразделяющаяся на внутрипеченочные холангиокарциномы (опухоли внутрипеченочных желчных протоков), внепеченочные холангиокарциномы и опухоли желчного пузыря. Внепеченочные карциномы, в свою очередь, делятся на опухоли желчных протоков ворот печени, располагающиеся до или в месте слияния общего и пузырного протоков (другое название новообразований этого типа – опухоль Клацкина), и дистальные холангиокарциномы. Холангиокар-цинома (ХК) – достаточно редкое заболевание в большинстве стран мира, где стандартизованный по возрасту показатель заболеваемости составляет менее 2 на 100 000 населения, однако такие новообразования встречаются значительно чаще в регионах, эндемичных в отношении печеночного сосальщика [1, 2]. Другими важными факторами риска ХК являются инфекции вирусами гепатита B и C, а также некоторые хронические заболевания печени и органов билиарной системы [1, 3]. Рак желчного пузыря (РЖП) также относится к группе редких опухолей желудочно-кишечного тракта. Основным фактором риска для этого заболевания является желчекаменная болезнь, с распространенностью которой, а также с доступностью холецистэктомии связывают различия в частоте выявления РЖП в различных странах [2–4]. Злокачественные новообразования органов билиарного тракта характеризуются высокой летальностью, с общей 5-летней выживаемость ниже 25 % [5, 6]. Отсут- ствие специфических симптомов на ранних стадиях заболевания приводит к тому, что в большинстве случаев болезнь выявляется на этапе, когда радикальное хирургическое лечение уже невозможно или не приводит к полному удалению опухоли.

В лечении распространенного или неоперабельного билиарного рака в качестве первой линии терапии на протяжении более 10 последних лет применялась комбинация препаратов гемцитабина и цисплатина [6, 7]. В 2022 г. опубликованы результаты исследования III фазы TOPAZ-1, согласно которым добавление дурвалумаба (ингибитора контрольных точек иммунного ответа) к стандартной схеме гемцитабин + цисплатин приводило к достоверному увеличению медианы общей продолжительности жизни с 11,5 до 12,8 мес и медианы безрецидивной выживаемости с 5,7 до 7,2 мес [8]. При этом в группе пациентов, получавших дурвалумаб, почти 25 % были живы спустя 24 мес исследования, по сравнению с 10 % в группе пациентов, получавших плацебо. В некоторых клинических рекомендациях именно эту схему уже предлагается использовать в качестве предпочтительной первой линии терапии [9, 10]. На основании данных клинического исследования III фазы, KEYNOTE-966, опубликованных в июне 2023 г., можно утверждать, что и другой ингибитор белка запрограммированной гибели клеток PD-1 (англ. – Programmed cell death 1), пембролизумаб, обладает сопоставимой эффективностью и может применяться в той же схеме, что и дурвалумаб, при лечении опухолей билиарного тракта [11].

До последнего времени не существовало схем терапии с доказанной эффективностью для применения во второй и последующих линиях. Лишь в 2021 г. опубликованы результаты исследования, показавшего небольшое преимущество схемы FOLFOX (оксалиплатин с 5-фторурацилом и фолинатом кальция), во второй линии в сравнении с симптоматической терапией: наблюдалось увеличение медианы общей продолжительности жизни с 5,3 до 6,2 мес [12]. Ввиду низкой эффективности стандартной химиотерапии при опухолях билиарного тракта большое внимание уделяется возможности использования таргетных препаратов у тех пациентов, в новообразованиях которых обнаруживаются соответствующие генетические маркеры. В настоящем обзоре будут рассмотрены клинически значимые генетические изменения, характерные для опухолей билиарного тракта, связанные с ними возможности таргетной терапии и методы молекулярно-генетического тестирования, используемые для их выявления.

Молекулярные маркеры, имеющие значение для всех опухолей билиарного тракта: амплификация гена HER2 , мутации BRAF V600E и KRAS G12C

Случаи амплификации/гиперэкспрессии гена HER2 (ERBB2) выявляются в 15–20 % случаев РЖП и ХК внепеченочной локализации и менее чем в 5 % случаев внутрипеченочной ХК [3, 13]. Как правило, статус гена HER2 определяется с использованием иммуногистохимического анализа (ИГХ) или флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). При этом HER2 -амплификация подтверждается методом FISH лишь в 60 % опухолей с гиперэкспрессией рецептора HER2, обнаруженной при помощи ИГХ [13]. Тестирование HER2 -амплификаций и гиперэкспрессии мРНК этого гена возможно и при помощи методов, основанных на ПЦР, а также с использованием секвенирования нового поколения (англ. – next generation sequencing, NGS). Однако ввиду того, что для анализа этими методами используется нуклеиновые кислоты, извлеченные из образца ткани, содержащего как опухолевые, так и нормальные клетки, возможно получение ложно-негативного результата при низком содержании опухолевых клеток в образце, а также в случаях со значительной внутриопухолевой гетерогенностью.

При выявлении амплификации или гиперэкспрессии гена HER2 пациенту с билиарным раком может быть назначена таргетная терапия комбинацией препаратов трастузумаб и пертузумаб [9, 10]. Данные препараты представляют собой антитела к двум разным участкам рецептора HER2. В исследовании MyPathway медиана времени до прогрессирования у предлеченных пациентов с опухолями билиарного тракта, получавших терапию комбинацией препаратов трастузумаб и пертузумаб, соста- вила 4 мес, а медиана общей продолжительности жизни – 10,9 мес [14]. Трастузумаб дерукстекан (конъюгат моноклональнального антитела с химиопрепаратом) и занидатамаб (биспецифическое антитело) также показали эффективность при лечении HER2-положительных билиарных опухолей в клинических испытаниях второй фазы [15, 16].

Активирующие точечные мутации в гене HER2 могут быть обнаружены при анализе ДНК опухоли с использованием NGS. Таргетные препараты из группы ингибиторов HER2 демонстрируют активность и в отношении новообразований с такими мутациями [17].

Мутация BRAF V600E встречается в 1–2 % всех опухолей билиарного тракта, наиболее часто – во внутрипеченочных ХК [18, 19]. Для анализа мутации BRAF V600E в клинике обычно используют стандартные молекулярно-генетические подходы, такие как ПЦР и секвенирование методом Сэнгера. Кроме того, данная мутация может быть выявлена с помощью диагностических NGS-панелей или полноэкзомного секвенирования опухолевой ДНК. Результаты клинического исследования второй фазы ROAR продемонстрировали клиническую эффективность комбинации препаратов дабрафиниба и траметиниба при лечении BRAF V600E-позитивных опухолей нескольких редких локализаций [20]. Медиана периода до прогрессирования для 43 пациентов с билиарным раком в этом исследовании составила 9 мес, а медиана общей продолжительности жизни – 13,5 мес. Монотерапия препаратом вемурафениб также может быть эффективна у этой категории пациентов [21].

Мутация KRAS G12C, хотя и является редкой в спектре KRAS -мутаций, выявляемых в билиарных опухолях, тем не менее обнаруживается не менее чем в 1 % новообразований этого типа [19, 22]. В клиническом исследовании второй фазы адаграсиба – специфичного ингибитора KRAS с мутацией G12C – частичные ответы наблюдались у 5/12 (41,7 %) пациентов с опухолями билиарного тракта, а продолжительность безрецидивной выживаемости составила 8,6 мес [22]. Тестирование мутации KRAS G12C не представляет сложности и может проводиться с использованием стандартных молекулярногенетических подходов (ПЦР, секвенирование по Сэнгеру), а также NGS. Другие мутации в генах KRAS и BRAF часто обнаруживаются в опухолях билиарного тракта, но не имеют очевидного клинического значения в настоящее время.

Новые мишени для таргетной терапии, характерные для внутрипеченочных холангиокарцином: транслокации с участием гена FGFR2 и мутации в гене IDH1

В период с 2019 по 2022 г. для клинического применения одобрены 4 препарата из нового класса селективных ингибиторов рецепторов фактора роста фибробластов (англ. – fibroblast growth factor receptor, FGFR). Первый из них – эрдафитиниб, получивший ускоренное одобрение FDA в 2019 г., предназначен для лечения уротелиальной карциномы с определенными нарушениями в генах FGFR2 и FGFR3 [23], хотя в рамках клинических испытаний он также демонстрировал эффективность и при опухолях билиарного тракта [24]. Другие три препарата – пемигатиниб, инфигратиниб и фути-батиниб – зарегистрированы для лечения местнораспространенной или метастатической ХК с перестройками (транслокациями) гена FGFR2 [24]. При этом все перечисленные препараты обладают выраженной активностью в отношении рецепторов FGFR1-3, а эрдафитиниб и футибатиниб – также и FGFR4. В клинических испытаниях II фазы частота объективных ответов при применении пемигатини-ба и инфигратиниба у пациентов с перестройками FGFR2 составила 35,5 и 23,1 %, а медиана времени до прогрессирования – 6,9 и 7,3 мес соответственно [25, 26]. Объективные ответы при использовании футибатиниба в рамках клинического испытания были зарегистрированы у 42 % пациентов, а медиана времени до прогрессирования оказалась равной 9 мес [27]. Футибатиниб, в отличие от других препаратов из этой группы, является необратимым ингибитором киназ FGFR. В некоторых случаях он демонстрирует активность у пациентов с вторичной резистентностью, развившейся на фоне лечения другими FGFR-ингибиторами [24, 27]. Следует отметить, что назначение всех FGFR-ингибиторов до сих пор проводилось только в качестве второй и последующих линий терапии. В настоящее время ведутся испытания, имеющие целью оценить эффективность применения FGFR-ингибиторов в качестве терапии первой линии [24].

Транслокации/перестройки с участием гена FGFR2 характерны для ХК внутрипеченочной локализации, где их частота составляет 10–15 %, и практически не встречаются в других опухолях билиарной системы [19, 24]. Кроме транслокаций, чувствительность к терапии FGFR-ингибиторами демонстрируют опухоли с определенными миссенс-мутациями (F276C, C382R) и делециями во внеклеточном домене гена FGFR2, не приводящими к сдвигу рамки считывания [28–30]. Фу-тибатиниб, кроме того, эффективен и в отношении некоторых мутаций, расположенных в киназном домене рецептора, – именно такие мутации часто бывают связаны с вторичной резистентностью к FGFR-ингибиторам [24, 27]. Миссенс-мутации и делеции в гене FGFR2 также выявляются преимущественно во внутрипеченочных ХК, но их частота существенно ниже по сравнению с FGFR2-транслокациями [19]. Ввиду большого разнообразия генов-партнеров транслокации с участием гена FGFR2, как правило, выявляют с использованием методов на основе NGS. Более подробно вопрос тестирования различных на- рушений в генах семейства FGFR рассмотрен в отдельном обзоре [31].

Мутации в гене IDH1 также выявляются почти исключительно во внутрипеченочных ХК, где их частота, по данным разных исследований, может составлять от 5 до 30 % (редко – до 50 %) [32]. Наблюдаемая вариабельность частоты IDH1 -мутаций может объясняться различиями в этиологии опухолей билиарного тракта между регионами, где проводились исследования. Так, в опухолях, развившихся на фоне инфицирования печеночным сосальщиком, мутации в гене IDH1 выявляются относительно редко [32].

В 2021 г. в США и в 2023 г. в Европе зарегистрирован препарат ивосидениб – первый ингибитор мутантного белка IDH1 для применения в качестве второй или последующей линии терапии при местнораспространенной или метастатической ХК с мутацией в гене IDH1 . В исследовании III фазы ClarIDHy данный препарат позволил увеличить медиану безрецидивной выживаемости с 1,4 до 2,7 мес по сравнению с плацебо, что также сопровождалось увеличением медианы общей продолжительности жизни до 10,8 мес (медиана общей продолжительности жизни в группе пациентов, получавших плацебо, после учета перехода пациентов из одной группы в другую, оказалась равной 6 мес) [33]. При этом частота объективных ответов составляла лишь 2 %, что объясняется механизмом действия препарата: ивосидениб способствует дифференцировке опухолевых клеток, но не обладает прямым цитотоксическим действием. В исследовании ClarIDHy стабилизация наблюдалась у 51 % пациентов, получавших ивосидениб, против 28 % пациентов, получавших плацебо.

Почти все мутации, обнаруживаемые в гене IDH1, затрагивают единственный кодон – 132 [32]. Благодаря этому тестирование мутаций IDH1 не представляет трудности и может проводиться при помощи стандартных лабораторных методик, основанных на ПЦР и/или секвенировании по Сэнгеру. Спектр IDH1 -мутаций в ХК отличается от такового в глиомах, для которых также характерны мутации в генах IDH1 и IDH2 . Наиболее частой заменой, выявляемой в ХК, является R132C (64 % от всех IDH1 -мутаций), реже обнаруживаются варианты R132L (14 %), R132G (12 %), R132S (4 %), R132H (3 %) и R132V (<1 %) [32]. Данные о спектре IDH1 -мутаций необходимо учитывать при выборе и/или разработке методов молекулярно-генетического анализа ХК. Так, антитела к IDH1 с мутацией R132H, часто использующиеся при анализе глиом, где эта мутация является доминирующей, будут практически бесполезны при анализе ХК, где та же аминокислотная замена является минорной. Мутации за пределами кодона 132 выявляются менее чем в 1 % IDH1 -позитивных ХК и, с большой вероятностью, не имеют функционального или клинического значения.

Редкие генетические изменения в рецепторных тирозинкиназах: транслокации с участием генов NTRK1-3 , RET , ALK и ROS1 , аберрации гена MET

В 2018–19 гг. для клинического применения одобрены 2 препарата, предназначенные для лечения любых типов опухолей с активирующими транслокациями генов рецепторных тирозинкиназ NTRK1 , NTRK2 или NTRK3 – ларотректиниб и энтректиниб. Оба препарата, относящиеся к низкомолекулярным ингибиторам тирозинкиназ, продемонстрировали в клинических испытаниях высокую частоту объективных ответов – 57 и 75 % соответственно [34, 35]. Ответы на лечение данными препаратами, как правило, были длительными (более полугода), и, кроме того, лечение сопровождалось относительно низкой частотой нежелательных побочных явлений. Как и в большинстве типов опухолей, транслокации с участием генов NTRK1-3 в ХК встречаются очень редко, менее чем в 0,5 % случаев [36]. Тем не менее единичные случаи NTRK -позитивных ХК были включены в клинические испытания ларо-тректиниба и энтректиниба и продемонстрировали ответы на лечение, сопоставимые с другими типами новообразований [34, 35].

Ввиду редкости перестроек с участием генов семейства NTRK для скрининга на их наличие часто используют ИГХ, чувствительность и специфичность которой зависят от того, какой именно ген участвует в перестройке, и от типа опухоли [36]. Из-за большого количества генов-партнеров ПЦР редко применяется для тестирования NTRK -транслокаций. При этом метод, основанный на сравнении экспрессии 3’/5’-концевых фрагментов мРНК генов NTRK1-3 при помощи ПЦР в реальном времени, также может быть использован как метод скрининга для отбора опухолей на исследование с использованием NGS [37]. Наиболее информативными являются методы выявления NTRK -транслокаций, основанные на высокопроизводительном секвенировании РНК, в том числе подходы с использованием таргетного обогащения [36, 37].

Данные о частоте перестроек с участием гена RET в опухолях билиарного тракта в литературе отсутствуют: по-видимому, такие события крайне редки. В то же время четыре случая ХК с RET -транслокациями оказались включены в клинические испытания двух препаратов из нового класса селективных RET-ингибиторов – пралсетиниба и селперкатиниба, и в 3/4 (75 %) случаев зарегистрированы частичные ответы на лечение [38, 39]. Опубликованы единичные отчеты о клинических случаях опухолей билиарного тракта с ALK - и ROS1 -транслокациями: применение таргетных ингибиторов киназ ALK и ROS1 в этих случаях сопровождалось выраженными клиническими ответами [40–42].

С учетом потенциальной пользы, которую могут получить некоторые пациенты при назна- чении высокоэффективных препаратов из группы низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ, целесообразным представляется включение последовательностей генов RET, ALK и ROS1 в таргетные NGS-панели, предназначенные для анализа опухолей билиарного тракта. Возможен также отбор пациентов на тестирование сложными и дорогостоящими методами (FISH, NGS) при помощи скрининговых методик, таких как ИГХ и анализ несбалансированной экспрессии 3’/5’-концевых фрагментов мРНК с помощью ПЦР в реальном времени. Следует отметить, что спектр выявляемых перестроек в билиарных опухолях может значительно отличаться от такового при раке легкого. Поэтому тестирование только известных вариантов RET-, ALK- и ROS1-транслокаций с использованием ПЦР или ампликонных NGS-панелей, предназначенных для исследования опухолей легкого, может приводить к получению ложно-отрицательных результатов.

Из нарушений, затрагивающих ген MET , в опухолях билиарного тракта описаны амплификации и перестройки. Частота обоих видов нарушений невелика: для амплификаций она составляет 1–2 %, для перестроек – около 0,5 % [19, 43, 44]. На примере единичных клинических наблюдений была показана возможность успешного применения таргетных ингибиторов киназы MET при лечении опухолей билиарного тракта c геном MET , активированным посредством амплификации или транслокации [45, 46]. Анализ амплификаций и транслокаций гена MET может производиться с использованием методов NGS или FISH. В качестве метода скрининга MET -амплификаций может использоваться ИГХ, однако этот подход, по-видимому, отличается достаточно низкой специфичностью [43].

Маркеры чувствительности к иммунотерапии

Опухоли билиарного тракта в целом плохо отвечают на монотерапию PD-1/PD-L1-ингибиторами [47]. Тем не менее могут существовать определенные группы пациентов, для которых данный вид терапии эффективен. В качестве маркеров чувствительности к иммунотерапии обычно рассматривают экспрессию PD-L1, высокую опухолевую мутационную нагрузку (англ. – tumor mutational burden, TMB) и микросателлитную нестабильность (англ. – microsatellite instability, MSI).

Экспрессию маркера PD-L1, как правило, оценивают при помощи ИГХ. Для этой цели могут быть использованы различные антитела, кроме того, различаются и критерии, используемые при оценке результатов. Это приводит к широкой вариабельности результатов, получаемых в разных исследованиях. В среднем, по данным метаанализа, положительными в отношении экспрессии PD-L1 являются около четверти всех опухолей билиар- ного тракта [48]. Однако иммуногистохимический статус PD-L1 при этом типе новообразований, по-видимому, не связан с ответом на лечение ингибиторами контрольных точек иммунного ответа как при назначении их в качестве монотерапии, так и в комбинации с гемцитабином и цисплатином [8, 11, 47].

Одним из показаний к назначению пемброли-зумаба является высокий уровень мутационной нагрузки в опухоли: 10 и более мутаций на 1 млн оснований (Мб) ДНК [49]. Определение мутационной нагрузки возможно только при помощи NGS. Показатель TMB может быть рассчитан на основании данных экзомного или таргетного секвенирования, однако используемая для этой цели таргетная панель должна покрывать не менее 1 Мб геномных последовательностей. Критерии и методы расчета TMB между исследованиями часто различаются.

Следует обратить внимание на то, что клиническое испытание KEYNOTE-158, по результатам которого высокий показатель TMB при любом типе опухоли был принят в качестве показания к назначению препарата, не включало ни одного случая билиарного рака с TMB ≥10 [49]. Это объясняется относительной редкостью таких случаев: по данным метаанализа, менее 5 % опухолей билиарного тракта имеют высокий уровень TMB [48]. В то же время исследование, проведенное D.J. McGrail et al. [50], показало, что значение TMB положительно коррелирует с ответом на иммунотерапию не во всех типах опухолей. В частности, те опухоли, при которых повышение мутационной нагрузки не сопровождалось увеличением инфильтрации CD8+ Т-лимфоцитами, не демонстрировали повышенной чувствительности к терапии ингибиторами контрольных точек даже при высоких значениях TMB. ХК, по результатам данного исследования, были отнесены именно к такому типу новообразований. Можно заключить, что в настоящее время отсутствуют убедительные доказательства эффективности иммунотерапии ингибиторами контрольных точек опухолей билиарного тракта с высоким уровнем TMB.

Микросателлитная нестабильность в опухолях билиарного тракта также обнаруживается достаточно редко, всего в 1–2 % случаев [19, 48]. Феномен MSI, проявляющийся в изменении длин микросателлитных повторов, является отражением дефекта системы репарации неспаренных оснований ДНК (англ. – deficient mismatch repair, dMMR) в опухолевых клетках. Распространенным методом тестирования MSI служит анализ длин нескольких выбранных микросателлитных повторов при помощи ПЦР и последующего капиллярного электрофореза. Иммуногистохимическое окрашивание основных белков, участвующих в репарации неспаренных оснований ДНК (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2), является методом анализа dMMR и часто используется в клинических лабораториях для опосредованного выявления MSI-позитивных опухолей. На практике по ряду причин результаты, получаемые при помощи этих двух методов, могут различаться. В качестве референтной методики теоретически может служить NGS, т. к. этот подход позволяет исследовать множество микросателлитных маркеров одновременно. Однако пока NGS редко используется для этой цели за рамками научных исследований, что связано отчасти с отсутствием стандартных подходов к анализу и интерпретации получаемых данных. Обнаружение MSI в опухоли имеет большое значение ввиду высокой чувствительности этой категории новообразований к иммунотерапии с использованием ингибитора PD-1 пембролизума-ба. Так, по результатам клинического испытания второй фазы KEYNOTE-158 объективные ответы наблюдались у 40,9 % предлеченных пациентов с MSI/dMMR-позитивным билиарным раком, а медиана выживаемости без прогрессирования и медиана общей выживаемости составили 4,2 и 19,4 мес соответственно [51]. Кроме того, опухоли билиарного тракта входят в спектр новообразований, ассоциированных с синдромом Линча [52]. Выявление MSI/dMMR в опухоли, в особенности у молодых пациентов и у людей с отягощенным семейным анамнезом, требует проведения генетического консультирования и поиска возможных наследственных мутаций в генах системы репарации неспаренных оснований ДНК.

Интригующие результаты были получены в недавно опубликованной работе W.Z. He et al. [53]. У 39/341 (11 %) пациентов с ХК внутрипеченочной локализации в этом исследовании было обнаружено присутствие РНК вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ) в опухоли. Авторы провели также ретроспективный анализ, по результатам которого оказалось, что применение PD-1/PD-L1-ингибиторов у ВЭБ-позитивных (ВЭБ+) пациентов сопровождалось очень значительным увеличением медианы общей выживаемости – с 12,5 до 24,9 мес по сравнению с ВЭБ+ пациентами, в терапии которых не использовались PD-1/PD-L1-ингибиторы. В этом исследовании ВЭБ не был обнаружен ни в одной из 149 внепеченочных ХК, а также ни в одной из 208 опухолей желчного пузыря. Если результаты, полученные в работе W.Z. He et al. [53], будут подтверждены в независимых исследованиях, присутствие ВЭБ в ткани опухоли может быть признано еще одним маркером чувствительности к иммунотерапии при раке билиарного тракта наряду с MSI.

Нарушения в генах системы репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации

Дефицит гомологичной рекомбинации (англ. – homologous recombination deficiency, HRD) – вид геномной нестабильности, при котором клетка те- ряет способность аккуратно восстанавливать ДНК при возникновении в ней двунитевых разрывов, используя в качестве матрицы сестринскую хроматиду [54]. Альтернативный механизм репарации таких повреждений – негомологичное воссоединение концов (англ. non-homologous end joining, NHEJ) – часто приводит к появлению делеций, транслокаций и других мутаций в месте разрыва ДНК. Герминальные мутации в генах – участниках процесса гомологичной рекомбинации, таких как BRCA1, BRCA2, PALB2 и RAD51C, являются причиной наследственных опухолевых синдромов. В опухолях у носителей таких мутаций часто обнаруживается инактивация или утрата второй копии поврежденного гена (т.н. потеря гетерозиготности) – именно это событие, как предполагают, приводит к дефициту гомологичной рекомбинации, накоплению соматических мутаций и развитию рака. В спорадических опухолях разных локализаций также часто обнаруживаются мутации в генах системы гомологичной рекомбинации. При этом следует учитывать, что для развития дефицита гомологичной рекомбинации в опухолевых клетках необходима инактивация обеих копий одного из генов, участвующих в репарации ДНК. Считается, что опухоли с дефицитом гомологичной рекомбинации (HRD-позитивные опухоли) отличаются высокой чувствительностью к терапевтическим агентам, вызывающим повреждения ДНК, таким как производные платины, ингибиторы топоизомераз, алкилирующие агенты и PARP-ингибиторы.

Для выявления HRD-положительных новообразований обычно применяется один из следующих подходов. Мутации в генах репарации ДНК, как наследственные, так и соматические, могут быть выявлены при помощи таргетного или экзомного секвенирования ДНК. Для подтверждения наличия HRD в опухоли при этом рекомендуется проводить тест на потерю гетерозиготности, которая может выражаться как в утрате второй копии гена за счет ее делеции в ДНК, так и в значительном снижении (или полном отсутствии) ее экспрессии на уровне РНК. Фенотипическим проявлением HRD служит характерный профиль геномных нарушений, который может быть определен по данным полногеномного секвенирования опухолевой ДНК или же при помощи таргетного секвенирования с использованием специальных NGS-панелей и инструментов биоинформатической обработки данных. Однако нужно учитывать, что подобные тесты разрабатываются и используются преимущественно для анализа опухолей молочной железы и яичников, и их способность выявлять HRD-положительные опухоли других локализаций в настоящее время плохо изучена.

В опухолях билиарного тракта часто (почти в 30 % случаев) обнаруживаются мутации в различных генах, принимающих участие в процессе репарации ДНК посредством гомологичной реком- бинации, в том числе в генах ARID1A, BAP1, ATM, ATR, ATRX, BRCA1/2, RAD51B, RAD51C, WRN, BARD1, BLM, CHEK1/2, FANCA, PALB2, NBN и RAD50 [54]. При этом важно понимать, что не все подобные мутации приводят к развитию HRD. Наиболее последовательно связь между наличием инактивирующих мутаций, фенотипом HRD и ответом на специфическую терапию прослежена для генов BRCA1, BRCA2, PALB2 и RAD51C [54]. Бо́льшая часть мутаций в генах гомологичной рекомбинации ДНК, обнаруживаемых в опухолях билиарного тракта, являются соматическими. Однако, по данным двух исследований, проведенных в США и Японии, 5–7 % всех случаев билиарного рака могут быть связаны с наследственными мутациями в генах BRCA1/2, PALB2, RAD51D и BAP1 [55, 56]. Наиболее часто у пациентов с билиарным раком выявляют наследственные мутации в гене BRCA2. В настоящее время отсутствуют данные проспективных клинических исследований эффективности PARP-ингибиторов и других видов терапии у пациентов с HRD-позитивными билиарными опухолями. В то же время опубликован ряд наблюдений, демонстрирующий успехи применения PARP-ингибитора олапариба, отдельно или в сочетании с пембролизумабом, в единичных клинических случаях. Продолжительные по времени клинические ответы были зарегистрированы у пациентов с наследственными и биаллельными соматическими патогенными мутациями в генах BRCA2 и RAD51C [54, 57–59].

Спектр молекулярно-генетических нарушений, выявленных в опухолях билиарного тракта у российских пациентов Представляют интерес данные, полученные в ходе NGS-исследования российских пациентов с карциномами билиарного происхождения [60]. Авторами разработана NGS-панель для таргетно-го секвенирования РНК, позволяющая выявлять различные нарушения в генах семейства FGFR , IDH1/2, ERBB2, KRAS, NRAS, BRAF и PIK3CA . С помощью этой панели были изучены 165 образцов различных опухолей билиарного тракта. Генетические изменения, затрагивающие ген FGFR2 , были обнаружены у 17/82 (20,7 %) пациентов с ХК внутрипеченочной локализации, у 1/43 (2,3 %) пациентов с внепеченочной ХК, но ни у одного из 40 пациентов с РЖП. В 14 позитивных случаях выявлены транслокации с участием гена FGFR2 , еще в 4 наблюдениях – точечные нуклеотидные замены в этом же гене. Мутации в кодоне 132 гена IDH1 обнаруживались исключительно во внутри-печеночных ХК, где их частота составила 20/82 (24,4 %). Мутации BRAF V600E и KRAS G12C были выявлены у 3/165 (1,8 %) и 4/165 (2,4 %) пациентов с опухолями билиарного тракта соответственно. Амплификация гена HER2 , сопровождаемая его гиперэкспрессией, наблюдалась в 5/165 (3 %)

случаев – у трех пациентов с опухолями желчного пузыря и у двух пациентов с ХК внутрипеченочной локализации. Еще у двух пациентов обнаружены точечные мутации в гене HER2 . Статус MSI в данном исследовании оценивался при помощи ПЦР с последующим капиллярным электрофорезом. MSI-позитивными оказались 3/159 (1,9 %) успешно проанализированных образцов опухолей билиарного тракта.

Помимо собственной NGS-панели, сформированной авторами исследования, 47 внутри-печеночных ХК были подвергнуты таргетному секвенированию ДНК и РНК с использованием набора TruSight Tumor 170 (Illumina, США). Проведенный анализ позволил выявить в 4 случаях мутации в гене BRCA2, две из которых (R2336H и H2623R), согласно информации из базы данных Cl-inVar [], являются патогенными. К сожалению, в рамках данного исследования не проводился параллельный анализ образцов нормальной ткани и, соответственно, отсутствовала возможность определить, являются обнаруженные мутации наследственными или соматическими. Еще в 3 случаях были найдены мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания в генах ABRAXAS1, MRE11 и PALB2, функции которых также связаны с репарацией двуните-вых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. Наиболее часто в исследованных при помощи набора TruSight образцах опухолей выявлялись мутации в генах BAP1 (10 случаев), TP53 (9 случаев) и ARID1A (7 случаев). Высокая частота мутаций этих генов в ХК внутрипеченоч-ной локализации соответствует ранее опубликованным литературным данным [19]. Хотя гены BAP1 и ARID1A важны для осуществления репарации двуцепочечных разрывов ДНК [54], связь мутаций в этих генах с фенотипом HRD на данный момент не установлена.

Заключение

Билиарный рак отличается агрессивным течением и резистентностью к большинству видов системной терапии. Тем не менее в последние годы появились новые, более эффективные подходы к лечению этого заболевания. За счет добавления ингибиторов PD-1/PD-L1 к комбинации гемцитабина и цисплатина удалось достигнуть улучшения показателей общей и безрецидивной выживаемости у пациентов, получающих первую линию системной терапии при местнораспространенном и метастатическом билиарном раке [8, 11]. Применение таргетных препаратов при лечении опухолей билиарного тракта во второй линии терапии позволяет добиться, по меньшей мере, двукратного увеличения медианы общей продолжительности жизни: с 5–6 мес (только симптоматическое лечение или использование химиотерапии по схеме FOLFOX) до 10–13 мес (при использовании

HER2-ингибиторов, ингибиторов мутированных белков BRAF и KRAS, FGFR-ингибиторов либо IDH1-ингибитора ивосидениба) [14, 20, 22, 25–27, 33]. Еще бо́льшую эффективность демонстрируют новые препараты из группы NTRK- и RET-ингибиторов в редкой категории пациентов, опухоли которых содержат перестройки с участием этих генов [34, 35, 38, 39]. Обнаружение мутаций в генах, связанных с HRD, в опухолях билиарного тракта может означать, что эти опухоли чувствительны к ДНК-повреждающим агентам и PARP-ингибиторам [54]. Выявление микросателлитной нестабильности имело до последнего времени большое значение, т.к. назначение пембролизума-ба во второй линии терапии при MSI-позитивных опухолях позволяло рассчитывать на существенное увеличение продолжительности жизни пациентов [51]. Однако после того как схемы лечения, включающие комбинации PD-1/PD-L1-ингибиторов с химиопрепаратами гемцитабином и цисплатином, стали входить в новые рекомендации по лечению опухолей билиарного тракта в качестве нового стандарта [9, 10], под вопросом оказалась возможность применения иммунопрепаратов во второй линии терапии в будущем, даже при выявлении в опухоли маркеров чувствительности к ним. Новые направления исследований, целью которых является оптимизация системной терапии билиарного рака, рассматривают возможности применения таргетной терапии в качестве первой линии, а также комбинирование таргетных препаратов с иммунотерапией [24, 47].

Использование таргетной терапии, подобранной с учетом молекулярно-генетических характеристик опухоли, способствует увеличению продолжительности и повышению качества жизни онкологических пациентов. При этом для обоснованного назначения таргетных препаратов при опухолях билиарного тракта требуется проведение комплексной лабораторной диагностики, как правило, с использованием нескольких различных методов. Это связано с высокой гетерогенностью билиарных опухолей и с расширением спектра таргетных препаратов, используемых для их лечения. Таргетируемые молекулярные нарушения наиболее характерны для ХК внутри-печеночной локализации [19, 60]. Чаще всего в этих новообразованиях встречаются перестройки и другие мутации, затрагивающие ген FGFR2, и точечные мутации в гене IDH1. Для анализа транслокаций в настоящее время наиболее часто используется NGS-секвенирование, при этом большей чувствительностью обладают подходы, основанные на секвенировании РНК. При помощи РНК-секвенирования возможно также производить генотипирование и других типов мутаций в экспрессирующихся генах – в первую очередь различных активирующих мутаций в онкогенах. Так, точечные мутации в генах IDH1, KRAS, BRAF, а также FGFR2 и ERBB2 могут быть выявлены при помощи таргетного секвенирования РНК [60]. Однако для анализа инактивирующих мутаций в генах, связанных с HRD, требуется проводить секвенирование ДНК, т. к. экспрессия РНК этих генов в опухоли может отсутствовать. Дополнительные молекулярно-генетические тесты, как правило, используются для анализа ERBB2-амплификации/ гиперэкспрессии и определения статуса MSI, хотя предпринимаются попытки исследовать и эти маркеры при помощи NGS [19, 60]. Поскольку опухоли билиарного тракта часто диагностируются на поздних стадиях, когда новообразование является неоперабельным, для лабораторного анализа может быть доступен только биопсийный материал. При ограниченном количестве материала для исследования наиболее эффективной стратегией является одновременное тестирование как можно большего числа маркеров, возможное лишь с помо- щью технологии NGS. Кроме того, при использовании соответствующих NGS-панелей могут быть выявлены даже очень редкие нарушения, такие как транслокации с участием генов ALK, ROS1, NTRK1-3 и RET, обнаружение которых может существенно повлиять на курс лечения и значительно улучшить прогноз пациента с билиарным раком. В то же время существенная часть клинически значимых молекулярных нарушений в опухолях билиарного тракта может быть изучена и при помощи традиционных молекулярно-биологических методов, таких как ПЦР, ИГХ, FISH и секвенирование по Сэнгеру. При решении вопроса о направлении на анализ опухолевого материала следует учитывать также и то, что не все упомянутые в данном обзоре новые таргетные препараты или их аналоги по состоянию на 2023 г. зарегистрированы и доступны в России.