Роль морфологических и генетических особенностей строения рецепторов эстрогенов альфа в развитии резистентности к эндокринотерапии тамоксифеном у пациенток с люминальным раком молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) – гетерогенная группа опухолей. Согласно молекулярно-генетической классификации, предложенной C.M. Perou et al. [13], одним из определяющих критериев разделения РМЖ на подтипы является наличие в опухолевой ткани рецепторов к эстрогену и прогестерону. Опухоли, экспрессирующие рецепторы, относятся к люминальным и составляют 70–80 % всех случаев РМЖ [12, 13]. Основным компонентом адъювантного лечения люминального рака молочной железы является антиэстрогенная терапия, базисным препаратом которой остается тамоксифен [6, 14].

Считается, что главным предсказательным критерием эффективности эндокринной терапии является сам факт наличия рецепторов эстрогенов альфа (ERα) в ткани опухоли. В качестве дополнительных рассматриваются степень экспрессии ERα (доля опухолевых клеток, имеющих рецепторы) и интенсивность их окрашивания. Установлено, что высокие значения этих показателей ассоциированы с лучшей эффективностью лечения [5]. При стандартной оценке рецепторного статуса, как правило, не учитывается такой параметр, как характер распределения рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли. Тем не менее показано, что гетерогенное распределение рецепторов ассоциировано с неблагоприятным исходом заболевания – высокой вероятностью лимфогенного и гематогенного метастазирования [1]. Однако предсказательная значимость этого параметра не изучалась.

Несмотря на относительно благоприятный клинический прогноз при люминальном типе РМЖ, по данным литературы, у 10–20 % больных на фоне проведения адъювантной гормонотерапии тамоксифеном отмечается прогрессирование заболевания уже в первые 12 мес от начала лечения, а в последующие годы этот показатель увеличивается до 20–40 % [5, 12, 15]. Изучение причин неэффективности терапии тамоксифеном развивается по двум направлениям. В качестве первого рассматривают реализацию различных путей активации рецепторов эстрогенов. Классический геномный путь активации осуществляется посредством взаимодействия эстрадиола с активационным центром AF-2 (activating functions – AF-2) рецептора. На эту же мишень воздействует и тамоксифен, являясь конкурентным антагонистом эстрадиола [8]. Реализация неклассического геномного пути активации рецепторов эстрогенов альфа (ERα) происходит под воздействием ряда ростовых факторов (IGF-1, EGFR, Her-2/neu, TGF-β), способных активировать домен AF-1 ERα, который не блокируется тамоксифеном, что также может обусловливать неэффективность гормонотерапии [12, 15].

В качестве второй возможной причины резистентности к терапии тамоксифеном обсуждается наличие изменений ультраструктуры самих рецепторов эстрогенов в результате однонуклеотидных полиморфизмов. Установлены области транскрипции гена рецепторов эстрогенов, ответственные за строение активационных центров AF-1 и AF-2 [4, 11]. Так, наличие полиморфизма rs2077647 (C/T) в первом экзоне гена ERα, который локализуется в А/В домене, ассоциировано со структурными изменениями функциональной области транскрипционной активации центра AF-1. Полиморфизм же rs2228480 (G/A) (594Thr) в 8 экзоне, располагающемся в E/F регионе, соответствует лиганд-зависимой функциональной области транскрипции центра AF-2. Структурные изменения в активационных центрах могут приводить к нарушению функции самих рецепторов. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что мутации в 8 экзоне гена ERα делают невозможным связывание тамоксифена с центром AF-2, тем самым обусловливая его неэффективность и, следовательно, нецелесообразность проводимой антиэстрогенной терапии [4]. Однако эти работы немногочисленны и в большей степени носят поисковый характер, что определяет целесообразность изучения обозначенной проблемы.

Целью исследования явилось изучение взаимосвязи экспрессии рецепторов эстрогенов альфа и полиморфных вариантов гена ERα с эффективностью антиэстрогенной терапии тамоксифеном у больных люминальным раком молочной железы.

Материал и методы

В исследование были включены 97 пациенток с люминальным раком молочной железы T1–2N0–1M0 стадии, средний возраст – 54,35 ± 0,87 года. В состоянии менопаузы лет находились 55 больных, у 42 менструальный цикл был сохранен. Во всех наблюдениях опухоли были представлены инвазивной протоковой карциномой. Пациентки получили комбинированное лечение в виде оперативного вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. По показаниям проводилась послеоперационная лучевая терапия и/ или адъювантная химиотерапия (по схеме FAC). Обязательным компонентом адъювантной терапии явился прием тамоксифена в стандартной дозировке (20 мг/сут). Сроки наблюдения за больными составили от 24 до 130 мес.

Отдаленные результаты лечения оценивались по факту прогрессирования заболевания в виде появления отдаленных метастазов. В зависимости от этого были сформированы 2 группы пациентов: без признаков прогрессирования (n=60) и с прогрессированием заболевания (n=37). Группы были сопоставимы по основным клинико-морфологическим параметрам и объему проведенного лечения.

Исследовались образцы опухолевой ткани. Подготовка материала и патоморфологическое исследование осуществлялись по стандартной методике. Экспрессию к рецепторам эстрогенов альфа изучали иммуногистохимическим методом, применяли антитела фирмы «Dako» (клон 1D5, RTU, мышиные). Оценка экспрессии к рецепторам эстрогенов альфа проводилась количественным методом гисто-счета (Histo-Score). При этом определялась степень экспрессии (доля позитивных клеток) и её интенсивность (показатель экспрессии в баллах). Дополнительно оценивался характер распределения рецепторов в опухолевой ткани [2]. Если отмечалось равномерное распределение рецепторов, независимо от интенсивности окрашивания экспрессию расценивали как гомогенную. При наличии участков с позитивной и негативной экспрессией, а также с различной степенью выраженности – экспрессию рассматривали как гетерогенную.

Для оценки ультраструктуры ERα проводилось выделение ДНК из опухолевых образцов путем депарафинизации срезов с помощью наборов QIaamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen). Качественный и количественный анализ ДНК проведен на спектрофотометре NanoDrop-1000 («NanoDrop», США). Изучение полиморфных вариантов в 8 экзоне гена рецептора выполнено с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Последовательность праймеров и проб подбирали при помощи программы OligoAnalysisVector NTI с использованием генетического банка данных (. Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл включала 100 нг геномной ДНК; 0,5–1,5 мкл специфической пары праймеров и проб с концентрацией 1 о.е./мл; 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата; 1,2–2,0 мкл буфера (60 мМTris-HCl (pH 8,5 при 25°C), 1,5 мМ MgCl2; 25 мМKCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон X-100) и 0,5–1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы («Ме-диген», Новосибирск). Программа амплификации предполагала предварительную денатурацию при 95°С в течение 2 мин, с последующими 40 циклами денатурации при 95°С (10 сек), отжига при специфической температуре для каждой пары праймеров (30 сек) на амплификаторе ICycler IQ5 («Bio-Rad», США).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ № 2288, от 24.12.93), на основании разрешения локального комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 8».

Результаты исследования и обсуждение

На первом этапе исследования были проанализированы стандартные показатели рецепторного статуса. Оценивалась связь степени и интенсив-

Таблица 1

Взаимосвязь интенсивности экспрессии E α с исходом заболевания

Показатели	Больные РМЖ без прогрессирования (n=38)	Больные РМЖ с прогрессированием (n=29)	р
Степень экспрессии	74,55 ± 3,72 %	68,97 ± 5,22 %	0,016
Интенсивность экспрессии, Ед.	140,83 ± 12,26	117 ± 17,4	0,031

Таблица 2

Связь характера распределения E α с частотой отдаленного метастазирования

Характер распределения ERα	Больные РМЖ без прогрессирования (n=60)	Больные РМЖ с прогрессированием (n=37)
Гетерогенный	35 (58,3 %)	32 (86,5 %)
Гомогенный	25 (41,7 %)	5 (13,5 %)
р=0,03; χ2=4,38

Таблица 3

Соотносимость свойств рецепторов E α с частотой отдаленного метастазирования

Характеристики опухоли	Больные РМЖ без прогрессирования (n=45)	Больные РМЖ с прогрессированием (n=26)
«Благоприятные»	25	5
«Неблагоприятные»	20	21
р=0,006; χ2=7,48

Таблица 4

распределение аллелей 8 экзона гена E α в зависимости от исхода заболевания

Генотип 8 экзона гена ERα	Больные РМЖ без прогрессирования (n=45)	Больные РМЖ с прогрессированием (n=26)
Дикий аллель (G)	49*	30
Мутантный аллель (A)	5	14
р=0,01; χ2=6,52

ности экспрессии рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли с исходом заболевания (табл. 1). Установлено, что в группе пациентов без признаков прогрессирования заболевания степень и интенсивность экспрессии ERα были значимо выше. Эти данные согласуются с результатами, ранее полученными другими авторами [5, 7, 9].

При изучении интенсивности экспрессии рецепторов в зависимости от характера их распределения оказалось, что при гомогенном распределении средняя интенсивность экспрессии составила 208 ± 10,54, тогда как при гетерогенном она была существенно ниже – 98,66 ± 9,4. Различия статистически значимы (р=0,0003). При оценке связи характера распределения рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли с отдаленными результатами лечения установлено, что у пациенток с прогрессированием заболевания гетерогенное распределение отмечено в 86,5 % (табл. 2), в то время как при благоприятном исходе оно наблюдалось в 58,3 % случаев (р=0,0072; χ2=7,22). Полученные результаты позволяют полагать, что такой морфологический параметр, как характер распределения рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли больных РМЖ, определенным образом сопряжен с эффективностью антиэстрогенной терапии тамоксифеном. В литературе представлены данные, свидетельствующие лишь об ассоциации гетерогенного распределения ERα с неблагоприятным исходом заболевания (высокой вероятностью лимфогенного и гематогенного метастазирования) [1]. Предсказательная значимость этого параметра ранее не оценивалась.

Учитывая высокую сопряженность уровня экспрессии ERα и характера их распределения с отдаленными результатами лечения, был проведен анализ совместного использования этих показателей. К условно благоприятным отнесены опухоли, в которых степень экспрессии ERα была ≥70 % в сочетании с гомогенным характером распределения рецепторов (n=30), к неблагоприятным – при наличии в новообразовании степени экспрессии рецепторов <70 % с гетерогенным характером распределения (n=41). Оказалось, что при одновременном сочетании таких неблагоприятных характеристик опухоли, как низкая экспрессия ERα и их гетерогенное распределение достоверно чаще наблюдается прогрессирование заболевания (табл. 3, р=0,006; χ2=7,48).

При оценке наличия полиморфизма rs2228480 (G/A) в 8 экзоне гена Erα в образцах опухолевой ткани, полученных от 49 пациентов, он был выявлен в 19,4 %. Интересно отметить, что у больных, в опухолевых клетках которых определялась гомогенная окраска рецепторов, случаев мутации отмечено не было, в то время как при гетерогенном их распределении мутации 8 экзона были определены в 25,7 % наблюдений (р=0,014; χ2=6,09). Наличие данной мутации было соотнесено с прогрессированием заболевания. У больных с неблагоприятным исходом частота встречаемости мутантного аллеля (А) в ткани опухоли оказалась достоверно выше (табл. 4, р=0,01; χ2=6,52).

Наличие мутации в 8 экзоне гена ERα рассматривается в литературе в качестве неблагоприятного прогностического фактора для РМЖ [10, 11]. Так, S. Abbas et al. изучали однонуклеотидные полиморфизмы в областях rs2077647 (1 экзон), rs1801132, rs2228480 (8 экзон) в гене ERα и кодона 392 в гене ERβ. Было показано, что у женщин с ранним менархе (до 12 лет) и наличием полиморфизмов во всех трех участках гена рецепторов эстрогенов альфа риск развития рака молочной железы составляет 60,4 % (р=0,001), а у пациенток с установленным диагнозом РМЖ было отмечено более частое поражение регионарных лимфатических узлов (р=0,033) [3].

Заключение

Полученные результаты позволяют полагать, что такие показатели, как характер распределения рецепторов эстрогенов альфа и наличие мутации в 8 экзоне гена ERα в ткани опухоли, наряду со стандартными параметрами (степень и интенсивность экспрессии рецепторов), можно рассматривать в качестве дополнительных предсказательных критериев эффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном у пациенток с люминальным типом рака молочной железы. Определение этих показателей в биопсийном или операционном материале может позволить индивидуализировать целесообразность назначения тамоксифена.