Роль мутантных форм вируса гепатита В в прогрессирующем течении хронического гепатита В

Хронический гепатит В является одной из глобальных проблем мирового здравоохранения. В мире вирусом гепатита В (ВГВ) инфицированы около 350 миллионов человек, и около миллиона носителей вируса ежегодно умирает от печеноч- ной недостаточности, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Основные успехи в лечении хронического гепатита B (ХГВ) связаны с развитием знаний о молекулярно-биологических особенностях вируса [5], [8], [13]. Одним из на-

иболее важных факторов, влияющих на тяжесть течения болезни и эффективность противовирусного лечения, является генотип вируса и структура его генома, которая подвержена постоянным изменениям в результате мутаций [16].

В настоящее время выделяют десять генотипов ВГВ – A–J генотипы [6], [7], [12], [17]. Отмечается зависимость частоты носительства ВГВ, частоты хронизации гепатита, путей передачи вируса, клинического течения ХГВ и эффективности противовирусной терапии (ПВТ) от генотипов вируса [6]. Информации в литературе о распространенности различных генотипов ВГВ на территории Российской Федерации недостаточно, и данная проблема требует дальнейшего изучения [1], [2], [3], 4].

Генетическая гетерогенность вирусной популяции у пациента обусловлена двумя ключевыми факторами: противостоянием вируса иммунной системе хозяина и воздействием ПВТ. Так, под воздействием иммунного прессинга формируются preС/С и preS/S-мутации, приводящие к снижению и/или прекращению синтеза вирусных антигенов (HBeAg, HBsAg), а под влиянием противовирусных препаратов – аналогов нуклео-зидов/нуклеотидов (АН) – происходит возникновение мутаций в гене полимеразы и развивается лекарственная резистентность. В связи с этим чрезвычайную важность для верификации гепатита В, определения клинического течения заболевания и назначения своевременного лечения представляют данные о структуре генома ВГВ.

В последовательности полимеразы ВГВ содержится YMDD-мотив, замены в котором играют основную роль в формировании устойчивости вируса к АН – ламивудину (ЛАМ), адефовиру (АДФ), энтекавиру (ЭТВ), телбивудину (ТБВ). Устойчивость к ламивудину связана с мутациями, приводящими к заменам в полимеразном белке М204V, L180M и др., устойчивость к адефовиру – к заменам N236T, A181V, к энтекавиру – I169T, M250V, T184G, S202I, к телбивудину – M204I/V [14], [15]. Данные изменения генетической структуры вируса не только снижают эффективность лекарственного контроля репликации вируса, но могут усиливать резистентность и изменять клиническое течение ХГВ.

Поскольку геном ВГВ имеет перекрывающиеся рамки считывания, мутации в полимеразном гене могут изменять свойства поверхностных белков. PreS/S-мутации, возникающие самостоятельно или сочетающиеся с полимеразными мутациями, также способны влиять на серологические и клинические особенности ХГВ. Они приводят к изменению структуры HBsAg, снижению или прекращению его секреции из гепатоцита, что, с одной стороны, затрудняет этиологическую верификацию ХГВ, а с другой – способствует развитию окислительного стресса, воспалению, ядерному увеличению числа цирку- лярно замкнутых вирусных ДНК, развитию мутаций и раковой трансформации гепатоцитов на поздних стадиях ХГВ [9], [10], [11]. Клиническое значение preS/S-мутаций ВГВ остается неясным, в связи с чем данная проблема требует всестороннего изучения.

Целью исследования явилось определение распространенности генотипов ВГВ, циркулирующих в России на территории Санкт-Петербурга (СПб), Ленинградской области (ЛО) и Республики Карелия (РК) в период 2008–2013 годов, выявление мутаций, ответственных за развитие устойчивости к АН, а также preS/S-мутаций, влияющих на синтез HBsAg и течение ХГВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 579 больных ХГВ (512 – из СПб и ЛО, 67 – из РК) в период с 2008 по 2013 год. Вирусные антигены HBsAg и HBeAg и антитела к вирусу гепатита В – AbHBs, AbHBe, AbHBco-rIgM, AbHBcorIgG – исследовались методом им-муноферментного анализа с помощью тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест». Выявление ДНК ВГВ и определение вирусной нагрузки из образцов плазмы крови и биоптатов печени проводились методом ПЦР с использованием наборов реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп», «АмплиСенс HBV-Монитор-FRT» и «Ампли-Сенс HBV» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Амплификацию фрагмента генома ВГВ для генотипирования проводили с помощью типоспецифичных праймеров методом, разработанным в НИИ гриппа [3]. Анализ и очистку продуктов ПЦР для секвенирования проводили электрофорезом в 2 %-ном агарозном геле с добавлением бромида этидия (ЦНИИ эпидемиологии, РФ). ДНК из агарозного геля выделяли коммерческим набором QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Секвенирование для определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена полимеразы проводили методом Сэнжера при помощи набора реагентов ABI prism® BigDye™ Terminator v3.1 Kit с использованием оригинальных праймеров на приборе ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems», США) [4]. Анализ последовательностей и построение выравниваний проводили с помощью программы Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США).

Особенности клинического течения ХГВ изучены у 67 пациентов с ХГВ. Оценивались печеночные тесты: уровень аланинаминотрансферазы (АЛАТ), аспартатаминотрансферазы (АСАТ), альбумина, гамма-глобулинов, IgA, IgM, IgG, щелочной фосфатазы (ЩФ). Определялся индекс гистологической активности (ИГА) по Knodell с оценкой паренхиматозного повреждения (ПП) (1–4 балла), портального воспаления (ПВ) (1–4 балла), перипортальных некрозов (ПН) (1–10 баллов) и фиброз (Ф) по Metavir (0–4 балла).

Протокол исследования выполнялся согласно Хельсинкской декларации, от всех пациентов было получено информированное согласие на исследование. Оценивались t-критерий Стьюдента, тест Манна – Уитни, статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета Statistica 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди обследованных 579 пациентов хроническим гепатитом ВГВ был выявлен у 323 (55,8 %). У пациентов из СПб и ЛО ВГВ был определен у 256 (50 %) человек, кроме этого были выявлены случаи инфицирования несколькими гепатовирусами: у 21 (4 %) пациента – сочетанное инфицирование ВГВ и вирусом гепатита С, у 5 (1 %) – ВГВ и вирусом гепатита D. Уровень вирусной нагрузки у этих пациентов был преимущественно низкий: менее 104 копий/мл у 161 (62,9 %) больного, 104–106 – у 29 (11,3 %) и лишь у 40 (15,6 %) он составлял более 106 копий/мл. У пациентов из Карелии ВГВ был обнаружен у всех 67 (100 %) пациентов: у 26 – в сыворотке крови и ткани печени, вирусная нарузка у них составила 2,9 ± 0,8×104 копий/мл, у 41 пациента – только в ткани печени.

Генотип ВГВ был определен у 226 (70,0 %) пациентов: у 203 (79,3 %) из СПб и ЛО и у 23 (34,3 %) из РК (табл. 1). Наиболее распространенным в СПб и ЛО оказался ВГВ генотипа D (у 163 (80,2 %) больных), для которого характерна более низкая вирусная нагрузка. В Карелии также преобладал ВГВ генотипа D – у 20 (87,0 %) пациентов. В целом доля генотипа D в структуре больных ХГВ составила 81,0 %, доля генотипа А была существенно ниже – 16,4 %.

Таблица 1 Распределение генотипов вируса гепатита В среди больных ХГВ в Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия

Генотип / Регион	D		A		A+D		ни А, ни D		Всего, чел.
	чел.	%	чел.	%	чел.	%	чел.	%
Санкт-Петербург и Ленинградская область	163	80,2	35	17,2	5	2,5	0	0	203
Республика Карелия	20	87,0	2	8,7	1	4,3	0	0	23
Всего	183	81,0	37	16,4	6	2,7	0	0	226

Для определения мутаций устойчивости к АН методом секвенирования по Сенжеру у 49 человек (30 из СПб и ЛО, 19 – из РК) была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена полимеразы. Полученные последовательности гена и предсказанные последовательности полимеразного и поверхностных белков сравнены с референсными из международной базы данных GenBank.

Мутация устойчивости rtM204I/V (rt – reverse transcriptase) была обнаружена лишь у одного человека. Интересно отметить, что у этого пациента было зарегистрировано изменение аминокислотной последовательности под воздействием терапии ламивудином. В 2006 году ему была проведена трансплантация печени с неверифицированным гепатитом, с 2007 года был выявлен HBsAg, в связи с чем он последовательно получал ламиву-дин и телбивудин. После приема в течение года ламивудина были выявлены замены rtM204I и rtN236K, еще через шесть месяцев лечения ла-мивудином были обнаружены замены rtM204V, rtL80I, rtL180M, rtA181V и rtN236K, после 14 месяцев лечения телбивудином были определены замены rtM204V, rtV173L, rtL180M, rtA181C. С 2012 года пациент получал 1 мг энтекавира, в результате чего выявлялась волнообразная виремия и лишь после добавления тенофовира вирусная нагрузка снизилась до уровня менее 300 копий/ мл. У других 13 пациентов также были выявлены первичные (приводящие к развитию лекарственной устойчивости) и вторичные (компенсаторные) мутации устойчивости к АН и паттерн-мутации устойчивости к противовирусным препаратам (табл. 2). Всего различные мутации в гене полимеразы были выявлены у 14 (28,5 %) пациентов.

Таблица 2

Первичные и вторичные мутации гена полимеразы, потенциально ответственные за устойчивость к противовирусным препаратам

Аминокислотные замены		Санкт- Петербург	Республика Карелия	Устойчивость к АН
я я Я н 2 Я я п	L80I	1		ЛАМ
	L80V	1	1
	V173L	2
	L180M	3		ЛАМ/ ЭТВ
	A181V	1		A181TVS ЛАМ/ТБВ
	A181C	2
	A181S		1
	M204I	1		ЛАМ
	M204V	3		ЛАМ/ ТБВ/ ЭТВ
	N236K	6	3	N236T АДФ
2 я я я я я Ss m	V84G	1	2	АДФ
	R192H	1		ЛАМ
	Q215H	4	1	ЛАМ/ АДФ
	Q215S		1
	Q215R	1
	Q215P	1
	I233N	3		АДФ/ТБВ
Я я я 2 я & Й	M204I+N236K	1		ЛАМ
	M204V+L80I+L180M+ +A181V+N236K	1		ЛАМ
	M204V+V173L+L180M+ +A181C	2		ЛАМ
	A181S+Q215H		1	ЛАМ
	L80V+N236K		1	ЛАМ/АДФ
Итого, n		35	11

Проведенный анализ S-гена показал, что мутации в полимеразе влияют и на поверхностный белок (табл. 3). Так, обнаруженные замены в 173, 181 и 204 положениях обратной транскриптазы приводили к замене аминокислоты в 164, 172/173 и 195/196 положениях S-белка соответственно. Данные мутации были выявлены у 2 (4,1 %) пациентов, которые и определили у них снижение концентрации HBsAg до недетектируемого уровня.

Таблица 3

Изменения в последовательности белка S под действием мутаций устойчивости

Полимераза (обратная транскриптаза)	Поверхностный белок (S)
rtM204I	sW196L
rtM204V	sW196L+sI195M
rtM204V	sI195M
rtV173L	sE164D
rtA181V	sL173F
rtA181S	sW172C
rtA181C	sL173V+sW172C

С целью определения роли preS/S-мутаций в развитии печеночно-клеточного воспаления и фиброза и влияния длительности такой инфекции на активность ХГВ были сформированы три группы больных. В I группу вошли пациенты с HBsAg-позитивным ХГВ с виремией с уровнем вирусной нагрузки 2,9 ± 0,8 × 10⁴ копий/мл

(1,2–4,4×104 копий/мл), мужчин было 13 (50,0 %), женщин – 13 (50,0 %), возраст – 39,7 ± 6,3 года, срок заболевания – 12,9 ± 5,5 года (табл. 4). Во II группу вошли пациенты с признаками preS/S-мутантного ВГВ с HBsAg-негативным ХГВ, сопоставимые с больными I группы по половому составу (мужчин – 15 (53,6 %), женщин – 13 (46,4 %)), возрастному составу (40,5 ± 7,3 года) и по срокам заболевания (13,5 ± 4,8 года). В III группу вошли пациенты с HBsAg-негативным ХГВ, но более старшего возраста (51,8 ± 3,7 года), с достоверно более давним заболеванием (25,2 ± 5,3 года) и давно произошедшей сероконверсией по HBsAg, чтобы оценить влияние длительности существования preS/S-мутантного ВГВ на прогрессирование ХГВ.

У пациентов II группы с preS/S-мутантным ВГВ по сравнению с пациентами I группы несмотря на отсутствие виремии появлялась тенденция к увеличению маркеров печеночноклеточного повреждения и воспаления: увеличивались уровни АЛАТ, Ig А, M, G, возрастал ИГА и фиброз. По мере увеличения длительности ХГВ и возраста у пациентов III группы происходил достоверный рост активности АЛАТ, АСАТ, появлялись признаки внутрипеченочного холестаза – увеличивалась ЩФ, прогрессировала печеночно-клеточная недостаточность – уменьшался уровень альбумина, протромбина, увеличивались показатели мезенхимально-воспалительного

Таблица 4

Клинико-лабораторные, гистологические и вирусологические показатели у больных ХГВ c HBsAg-емией и с preS/S-мутантным ВГВ без HBsAg с разным возрастом и длительностью заболевания (M±m)

Показатели	I группа HBsAg(+), n=26	II группа HBsAg(–), n=28	III группа HВsAg(–), n=13
Мужчины, n ( %)	13 (50,0 %)	15 (53,6 %)	6 (46,2 %)
Женщины, n ( %)	13 (50,0 %)	13 (46,4 %)	7 (53,8 %)
Возраст, годы	39,7 ± 6,3	40,5 ± 7,3	51,8 ± 3,7*, **
Длительность HBV-инфекции, годы	12,9 ± 5,5	13,5 ± 4,8	25,2 ± 5,3*,**
Вирусная нагрузка, n×104 копий/мл	2,9 ± 0,8	0	0
АЛАТ, МЕ/л	53,1 ± 24,9	82,6 ± 50,8	118,0 ± 40,2*
АСАТ, МЕ/л	40,0 ± 16,7	66,7 ± 25,3	86,5 ± 26,2*
Билирубин, мкмоль/л	35,4 ± 15,1	21,1 ± 18,0	43,3 ± 35,0
Альбумин, г/л	43,5 ± 2,1	41,1 ± 2,2	36,4 ± 3,2*, **
Гамма-глобулины, г/л	13,3 ± 1,8	13,0 ± 2,1	17,6 ± 3,0*, **
ЩФ, Ед/л	124,1 ± 37,9	151,7 ± 66,1	195,9 ± 49,6*
Протромбин, %	84,7 ± 2,5	82,1 ± 2,8	78,2 ± 2,9*
IgA¸ г/л	2,3 ± 0,7	2,6 ± 1,3	3,3 ± 2,3
IgM, г/л	2,2 ± 0,4	2,4 ± 2,0	3,9 ± 2,7
IgG, г/л	15,8 ± 1,8	14,1 ± 2,1	19,7 ± 2,4*, **
ИГА, баллы	6,1 ± 1,6	6,8 ± 1,5	10,2 ± 2,3*
ПП, баллы	2,5 ± 1,3	2,7 ± 1,1	3,0 ± 0,6*
ПВ, баллы	2,2 ± 1,1	2,3 ± 0,9	3,0 ± 1,3
ПН, баллы	1,5 ± 1,0	2,0 ± 1,2	3,8 ± 1,2*, **
Фиброз, баллы	1,1 ± 0,6	1,6 ± 1,1	2,9 ± 1,2*, **

Примечание. * – разница достоверна с I группой, ** – разница достоверна со II группой.

процесса – уровень гамма-глобулинов, Ig, воспалительная инфильтрация портальных трактов и перипортальные некрозы. Такая отрицательная динамика печеночных тестов и гистологической картины заболевания свидетельствовала о формировании на фоне хронического гепатита цирроза печени.

ВЫВОДЫ

• 1.    Среди больных хроническим гепатитом В в Санкт-Петербурге, Ленинградской области и Республике Карелия преобладает инфицирован-ность вирусом гепатита В генотипа D (81,0 %), который склонен к развитию мутаций в различных участках генома под действием аналогов нуклеозидов и иммунного прессинга. Генотип А встречается реже: в Санкт-Петербурге и Ленинградской области – у 17,2 % пациентов, в Карелии – у 8,7 %.

• 2.    Первичные, вторичные и паттерн-мутации устойчивости к аналогам нуклеозидов выявлены при секвенировании гена полимеразы у 14

• 3.    PreS/S-мутации обнаружены у 2 (4,1 %) из 49 больных, данные мутации снижают синтез HBsAg, репликативную активность вируса, затрудняя верификацию вирусного гепатита В и способствуя развитию вакцинускользающих штаммов вируса.

• 4.    PreS/S-мутантные варианты вируса гепатита В вызывают умеренно выраженное, но неуклонно прогрессирующее течение некро-тически-воспалительного и фибротического процессов в печени, приводя через 20–30 лет к трансформации хронического гепатита в цирроз печени.

• 5.    Оценка генетической структуры вируса гепатита В имеет важное значение для диагностики, определения схем противовирусного лечения и прогнозирования клинического течения хронического гепатита В.

(28,6 %) из 49 обследованных пациентов. Данные мутации снижают эффективность противовирусной терапии и способствуют прогрессированию хронического гепатита.

ROLE OF HEPATITIS B VIRUS MUTANT FORMS IN PROGRESSIVE COURSE

OF CHRONIC HEPATITIS B