Роль n-ацетилцистеина в регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

В связи с высокой частотой онкологических заболеваний вызывают интерес исследования по изучению молекулярных механизмов опухолевого роста и выживания малигнизированных клеток. Значительный вклад в регуляцию процесса апоптоза вносят митохондрии, деятельность которых сопряжена с генерацией активных форм кислорода (АФК) при изменении напряжения кислорода в клетке [1–3]. Активные формы кислорода способствуют окислительной модификации белков, участвующих в реализации и регуляции апоптоза [4–7]. Поэтому особого внимания заслуживает изучение триггерных механизмов клеточной гибели опухолевых клеток в условиях гипоксии. В этом случае опухолевая клетка приобретает дополнительные качества, препятствующие реализации апоптотической гибели и способствующие невосприимчивости к химиотерапии [8].

На наш взгляд, актуальным является участие компонентов системы глутатиона в редокс-модуляции внутриклеточного сигналинга и процесса клеточной гибели, что может быть опосредовано формированием дисульфидных связей в молекулах белков, которые способствуют изменению их функциональной активности [4, 9, 10]. В процесс обратимой и необратимой ковалентной модификации могут быть вовлечены ключевые белки-регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, ион-транспортирующие системы, способствующие генетической нестабильности, нарушению дифференцировки и метаболизма опухолевой клетки [7, 11–13].

Целью исследования явилось установление молекулярных механизмов воздействия N-ацетилцистеина на редокс-регуляцию апоптоза опухолевых клеток при гипоксии.

Материал и методы

Материалом для исследования были выбраны опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши C3H/He), полученные из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург, Россия). Культивирование опухолевых клеток проводили монослойным способом в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония) при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 в полной питательной среде α-MEM («БиолоТ», Россия), содержащей 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («БиолоТ», Россия), L-глутамин (0,3 мг/мл) («БиолоТ», Россия) и гентамицин (100 мкг/мл) («Микроген», Россия). Культуру пересаживали каждые 2 дня и поддерживали в логарифмической фазе роста. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,5 % раствора трипанового синего («Serva», США). Для проведения эксперимента использовали культуру клеток, имеющую не более 5 % погибших клеток.

С целью дополнительной продукции активных форм кислорода опухолевыми клетками проводили моделирование условий гипоксии в культуре опухолевых клеток линии Р19 в специальной инкубационной камере «Hypoxia Incubator Chamber» («STEMCELL», Канада), наполняемой газовой смесью, состоящей из 5 % О2, 5 % СО2 и 90 % N2. Контроль за формированием гипоксии осуществлялся за счет измерения концентрации растворенного кислорода в среде культивирования оксиметром «Dissolved Oxygen Meter» («HANNA HI 9146», Италия).

Управление редокс-статусом опухолевых клеток осуществляли с помощью добавления в культуральную среду предшественника синтеза глутатиона N-ацетилцистеина (NAC) («Sigma-Aldrich», США) в концентрации 5 мМ. Применение N-ацетилцистеина опосредовало поступление одного из субстратов для синтеза глутатиона, так как при действии эндогенных эстераз высвобождается L-цистеин [14].

После инкубации опухолевые клетки отмывали от питательной среды и лизировали путем ресуспендирования в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) с добавлением 1 % тритона X-100 («Sigma-Aldrich», США) и охлаждения на льду с сохранением стандартной концентрации клеток для определения концентрации карбонильных производных белков. Для определения содержания общего, восстановленного, окисленного, белковосвязанного глутатиона и SH-групп белков лизат клеток депротеинизировали с помощью 5 % раствора сульфосалициловой кислоты.

Концентрацию общего, окисленного (GSSG) и восстановленного (GSH) глутатиона определяли методом, предложенным M.E. Anderson в модифи- кации I. Rahman et al. [15]. Рассчитывали величину отношения GSH/GSSG как показатель изменения редокс-статуса клетки. Содержание SH-групп белков, а также белковосвязанного глутатиона после предварительного его высвобождения из связи с белками с помощью 1 % раствора боргидрида натрия учитывали по реакции с 5,5-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой [16]. Результаты представляли в нмоль/мг белка.

Концентрацию карбонильных производных белков определяли по их реакции взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином, продукт которой имеет максимум поглощения при длине волны 363 нм [17]. Результаты выражали в нмоль/мг белка.

Содержание белка в клетках определяли по методу Бредфорда, основанному на взаимодействии аминокислотных остатков лизина и аргинина с красителем Кумасси голубым G-250 [18]. Учет экстинкции результатов проводили с помощью спектрофотометра СФ-2000 («ОКБ-Спектр», Россия).

Оценку апоптотически измененных клеток проводили с помощью проточной цитометрии с использованием аннексина-V-FITC и пропидий йодида (PI) согласно инструкции фирмы-производителя («eBioscience», США). Подсчет количества аннексин-положительных клеток осуществляли к общему числу изучаемых клеток и выражали в процентах.

Оценку митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm) клеток проводили с помощью набора Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit («BD», США) по снижению спектрального свечения, используя 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолкар боцианина иодид, который при деполяризации мембраны митохондрий не способен проникать внутрь органелл и образовывать флуоресцирующие агрегаты. Количество клеток со сниженной флуоресценцией выражали в процентах.

Определение концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток проводили с помощью метода, основанного на их связывании липофильным зондом Fluo 3 AM с максимумом флуоресценции при 526 нм («Sigma-Aldrich», США) [19]. Результаты выражали в условных единицах (у.е.), отражающих уровень свечения зонда на клетку.

Внутриклеточную концентрацию АФК оценивали с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеин-3,6-диацетата («Sigma-Aldrich», США) [20]. Результаты выражали в у.е.

Детекцию результатов проточной цитометрии проводили с помощью прибора FACSCanto II («BD», США) с использованием программного обеспечения FACSDiva Version 6.1.3.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы «SPSS 17.0». Проверка нормальности распределения количественных показателей осуществлялась с использованием критерия Шапиро–Уилка. Достоверность различий оценивалась с помощью непараметрических критериев Краскала–Уолиса и Манна–Уитни. Данные представляли в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1Q3). Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Дизрегуляция апоптоза на фоне снижения концентрации кислорода сопряжена с изменением редокс-статуса в малигнизированных клетках [21–23]. Одной из ведущих антиоксидантных систем инактивирующих АФК является система глутатиона. В проведенной работе был использован NAC в конечной концентрации 5 мМ в качестве предшественника синтеза глутатиона с целью изменения редокс-статуса опухолевых клеток Р19 и оценки их выживаемости.

В условиях гипоксии при дополнительном внесении NAC в среду культивирования опухолевых клеток линии Р19 было получено значимое снижение концентрации общего глутатиона в 1,2 раза (р<0,05) по сравнению с результатами, зарегистрированными в клетках при гипоксии (таблица). Это было опосредовано за счет изменения содержания восстановленного и окисленного глутатиона (таблица). Важно отметить, что в условиях гипоксии при дополнительном внесении в среду культивирования NAC клетки линии Р19 имели сопоставимое значение величины соотношения GSH к GSSG по сравнению с клетками, культивированными при гипоксии (таблица). Анализ содержания компонентов системы глутатиона в клетках, культивированных в условиях гипоксии при добавлении в среду культивирования NAC, позволяет предположить их участие в значимом увеличении содержания SH-групп белков в 1,3 раза (р<0,05), снижении концентрации белковосвязанного глутатиона в 2,7 раза (р<0,05) и карбонильных производных белков в 3,3 раза (р<0,05) по сравнению с гипоксией (таблица). Это свидетельствовало об участии компонентов системы глутатиона в условиях гипоксии и редокс-модулирования в глутатионилировании белков, протекции протеинов от карбонильных сшивок и изменении метаболизма опухолевой клетки.

Опухолевые клетки линии Р19 при гипоксии и дополнительном добавлении в среду культивирования NAC характеризовались значимым снижением внутриклеточного содержания АФК и ионов Са2+ в 1,1 раза (р<0,05) и карбонильных производных белков в 3,3 раза (р<0,05) по сравнению с результатами, полученными в клетках в условиях гипоксии (таблица). При этом зафиксировано значимо низкое число клеток со сниженным митохондриальным потенциалом в 3,4 раза (р<0,05) по сравнению с ги-

Таблица/Table

Влияние N-ацетилцистеина на реализацию апоптоза, показатели системы глутатиона, содержание активных форм кислорода и карбонильных производных белков в опухолевых клетках линии Р19 в условиях гипоксии, Ме (Q1–Q3)

The effect of N-acetylcysteine on implementation of apoptosis, parameters of the glutathione system, level of reactive oxygen species and protein carbonyl derivatives in P19 cells under hypoxia, Ме (Q1–Q3)

Условия культивирования опухолевых клеток

линии Р19/

Показатели/                                         Conditions of culturing P19 cells

Parameters

Гипоксия/Hypoxia     Гипоксия + NAC/

Hypoxia + NAC

Аннексин-V-FITC+, %/ Annexin-V-FITC+, %	10,75 (4,50–10,90)	7,65 (7,00–8,60)
CD95, у.е./CD95, u.	1,0 (0,9–1,1)	1,1 (1,0–1,2)
CD120, у.е./CD120, u.	1,4 (1,3–1,5)	0,9 (0,8–1,0)
Клетки со сниженным ΔΨm, %/ Cells with reduced ΔΨm, %	10,4 (10,4–10,6)	3,1 (3,0–3,2)*
Содержание Са2+ в клетке, у.е./ Intracellular concentration of Са2+, u.	10,24 (10,10–10,36)	9,74 (9,72–9,75)*
Продукция АФК, у.е./ Production of ROS, u.	19,07 (18,96–19,29)	17,94 (17,88–18,06)*
Карбонильные производные белков, нмоль/мг белка/ Protein carbonyl derivatives, nmol/mg protein	10,17 (8,92–10,39)	3,08 (2,93–4,21)*
Общий глутатион, нмоль/мг белка/ Protein carbonyl derivatives, nmol/mg protein	4,86 (4,74–5,03)	5,87 (5,63–6,08)*
GSH, нмоль/мг белка/ GSH, nmol/mg protein	4,47 (4,40–4,58)	5,27 (3,76–5,74)
GSSG, нмоль/мг белка/ GSSG, nmol/mg protein	0,43 (0,39–0,45)	0,53 (0,36–1,79)
GSH/GSSG	10,19 (9,88–11,35)	12,47 (2,10–14,73)
Белковосвязанный глутатион, нмоль/мг белка/ Proteinbound glutathione, nmol/mg protein	2,08 (1,95–2,19)	1,76 (1,59–1,91)*
SH-группы белков, нмоль/мг белка/ Protein SH groups, nmol/mg protein	8,76 (7,83–10,55)	11,60 (11,58–12,62)*

Примечание: АФК – активные формы кислорода, GSH – восстановленный глутатион, GSSG – окисленный глутатион, NAC – N-ацетилцистеин; * – статистически значимые различия (р<0,05) между группами Р19 гипоксия и Р19 гипоксия + NAC.

Note: ROS – reactive oxygen species, GSH – reduced glutathione, GSSG – oxidized glutathione, NAC – N–acetylcystein; * – statistically significant differences (р<0.05) between the Р19 Hypoxia and Р19 Hypoxia + NAC groups.

поксией (таблица). Вероятнее всего, в этом случае редокс-модулятор оказывал влияние на внутриклеточный метаболизм функционирования митохондрий и изменение содержания ионов Са2+.

Причиной чрезмерной генерации АФК в условиях гипоксии служит утечка электронов из дыхательной цепи митохондрий, так как отсутствие достаточного уровня кислорода способствует снижению концентрации конечного акцептора электронов и ингибированию цитохромоксидазы. Поэтому нарушение функционирования митохондрий рассматривается основной причиной формирования окислительного стресса в клетке, а также может способствовать запуску апоптоза по митохондриальному пути [22, 24]. Основными АФК, которые образуются в результате этого процесса, являются супероксидный анион-радикал и перекись водорода [22, 25]. Ранее при проведении исследования влияния условий гипоксии на метаболизм опухолевых клеток линии Р19 нами было показано формирование окислительного стресса, изменение состояния системы глутатиона и активация реализации апоптоза по сравнению с опухолевыми клетками, культивированными при нормальном напряжении кислорода [26].

Учитывая все вышеизложенное и полученные нами в условиях гипоксии при дополнительном внесении NAC в среду культивирования опухолевых клеток линии Р19 сопоставимые результаты числа аннексин-V-, CD95- и CD120-положительных клеток по сравнению с гипоксией (таблица), можно сделать заключение о нарушении регуляции запуска рецепторного и митохондриального путей апоптоза в опухолевых клетках в этих условиях.

Результаты проведенного исследования позволяют утверждать о значимой роли системы глутатиона в обеспечении функционирования опухолевых клеток, в том числе митохондрий, при сниженном напряжении кислорода. Примененный нами N-ацетилцистеин способствовал формированию дополнительной устойчивости опухолевых клеток линии Р19 к триггерным механизмам запуска апоптоза в условиях гипоксии.

Заключение

В условиях гипоксии изменение состояния системы глутатиона, окислительной модификации белков, влияет на изменение метаболизма опухолевой клетки в целом и способствует формированию дополнительных механизмов