Роль нарушений клеточной пролиферации и апоптоза в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта на фоне гастроэзофагеальной рефлюксной болезни

Адрес: 410031, г. Саратов, ул. Некрасова, 49 «А», кв. 23

Тел.: 8-906-307-43-88

ных патологических процессах в тканях пародонта, остается неизвестным. Изучение соотношения пролиферации и апоптоза при заболеваниях пародонта на фоне патологии пищевода позволит расширить вопросы патогенеза, улучшить раннюю диагностику рассматриваемых заболеваний и оптимизировать лечение.

Цель : провести анализ экспрессии маркеров клеточной пролиферации и апоптоза у больных воспалительными заболеваниями пародонта на фоне гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.

Материал методы. Обследовано 160 больных, 60 пациентов с гингивитом и пародонтитом на фоне неэрозивной формы ГЭРБ (НФГЭРБ); 40 больных гингивитом и пародонтитом на фоне эрозивной ГЭРБ (ЭФГЭРБ); 40 больных гингивитом и пародонтитом без патологии пищевода; группу сравнения составили 20 практически здоровых лиц. Больные и здоровые обследованы в динамике по единой программе, включающей клинические методы исследования. Формулировка диагноза ХГП проводилась на основании систематики заболеваний пародонта, принятой на XVI пленуме Всесоюзного общества стоматологов (1983) [5]. Всем пациентам проводили комплексное клинико-рентгенологическое обследование пародонта. Осуществляли оценку степени кровоточивости десен (Muhlemann, 1971) [5]; определяли глубину пародонтальных карманов; выявили упрощенный индекс гигиены по Грину — Вермильону (УИГ, 1965) [5]; папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (Parma G., 1960), [5]; пародонтальный индекс (Russel A., 1967), [5]. Диагноз ГЭРБ устанавливался на основе результатов комплексного клинико-морфологического обследования и базировался на рекомендациях, принятых в 1997 г. в Генвале (Бельгия) международной группой по изучению рефлюксной болезни. Наблюдение за больными проводили по единой программе, включающей общеклиническое обследование, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, фиброгастродуоденоскопию (ФГДС), общее морфологическое и цитологическое, иммуногистохимическое исследования.

Материал для морфологической диагностики забирали из слизистой оболочки маргинального края десны, десневых сосочков, а также слизистой оболочки в области переходной складки десны. Биопсийный материал фиксировался в 10%-ном забуфе-ренном нейтральном формалине в течение 24 часов с последующей промывкой в проточной воде в течение суток. После фиксации материал обезвоживался и заливался в парафин. Для обзорного гистологического изучения депарафинированные серийные срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Для выявления апоптозных ядер исследуемый материал импрегнировали по Мозеру (1995). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к маркеру пролиферирующих клеток Ki-67 (1:100, Novocastra) и к антиапоптозному белку Вcl-2 (1:100, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra).

Морфометрический анализ осуществляли с помощью программы компьютерного анализа изображений «ВидеоТест-Морфология 5.0». Количество Ki-67 и Bcl-2 иммунопозитивных ядер клеток автоматически подсчитывалось в 10 рандомизированных полях зрения. При указанном увеличении цифровые данные пересчитывались на 1 мм2.

Гибель клеток в форме апоптоза определяли на основе индекса апоптоза (IАПТ) по формуле:

IАПТ (%) = N (число апоптозных ядер, окрашенных по методу Мозера)/N (общее число ядер) х 100.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica-6,0 и Excel, с использованием критериев достоверности Стьюдента и Манна — Уитни. Определяли среднее и стандартное отклонение среднего, коэффициент корреляции Пирсона.

Исследование одобрено комитетом по этике Саратовского государственного медицинского университета им. В. И. Разумовского.

Результаты. Проведенный клинико-инструментальный анализ состояния тканей пародонта позволил установить, что среди пациентов с ВЗП без патологии пищевода преобладали лица с хроническим катаральным гингивитом (17%) и хроническим пародонтитом легкой степени (3б%). Частота встречаемости хронического пародонтита легкой степени у пациентов на фоне НФГЭРБ и ЭФГЭРБ не имела существенных различий (20 и 20%), среди пациентов с ВЗП на фоне НФГЭРБ преобладал хронический генерализованный пародонтит легкой (20%) и средней степени тяжести (30%). При обследовании пациентов с ВЗП на фоне ЭФГЭРБ преобладали деструктивные формы поражения пародонта (пародонтит средней (26%) и пародонтит тяжелой (34%) степени).

Больные хроническим катаральным гингивитом предъявляли жалобы на кровоточивость десен, незначительную болезненность, неприятный запах изо рта. При объективном осмотре определялись гиперемия, отек, кровоточивость десны. Среднее значение индекса РМА у пациентов без соматической патологии составило 3,6±0,7%; на фоне НФГЭРБ 4,2±0,6%; у пациентов на фоне ЭФГЭРБ 5,8±0,6%.

У 12 (20%) больных с ВЗП на фоне НФГЭРБ выявлен хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести, на фоне ЭФГЭРБ эта форма пародонтита встречалась у 18 (20%) больных.

В данной группе лиц больные предъявляли жалобы на неприятные ощущения в области десен, запах изо рта, кровоточивость во время чистки зубов, при приеме твердой пищи, подвижность зубов. При инструментальном обследовании определялась гиперемия, отек десневых сосочков и маргинальной десны, кровоточивость при зондировании; средние значения индекса РМА у пациентов: на фоне НФГЭРБ 50,43 и 62,15% на фоне ЭФГЭРБ. Показатели УИГ у всех больных с ГЭРБ колебались от 2,0 до 2,6, что соответствовало удовлетворительному состоянию гигиены полости рта. При зондировании глубина пародонтальных карманов достигала 4 мм. ПИ 0,6 у больных на фоне НФГЭРБ и 62 у пациентов на фоне ЭФГЭРБ. Зубы были неподвижны либо имели I степень подвижности. На ортопантомограмме выявлялась начальная степень деструкции костной ткани межзубных перегородок и кортикальной пластинки, резорбция межальвеолярных перегородок на 1/3 ее высоты с явлениями остеопороза.

Хронический генерализованный пародонтит средней степени встречался у 18 (30%) пациентов на фоне НФГЭРБ и у 10 (26%) обследованных на фоне ЭФГЭРБ. У всех больных выявлялись плохие показатели гигиены полости рта (УИГ 3,6–3,8). Глубина пародонтальных карманов достигала 4–5 мм, индекс ПИ 2,8 и 3,2 у больных на фоне НФГЭРБ и ЭФГЭРБ соответственно. Патологическая подвижность зубов I–II степени. На рентгенограмме резорбция костной ткани межзубной перегородки от 1/3 до 1/2 высоты межзубной перегородки, явления остеопороза.

У больных хроническим генерализованным пародонтитом тяжелой степени глубина пародонтальных карманов варьировала от 4 до 8 мм. Подвижность зубов была значительной (II–III степень). Значения ПИ: 5,5 и 6,4 (на фоне НФГЭРБ и ЭФГЭРБ соответственно). У данной группы обследованных больных преобладал вертикальный тип резорбции костной ткани, отсутствие компактной пластинки, деструкция межальвеолярных перегородок до ¾ длины корня. По анамнестическим данным установлено, что наличие воспалительных заболеваний пародонта коррелирует с длительностью заболеваний пищевода. Частота встречаемости хронического генерализованного пародонтита средней и тяжелой степени значительно возрастает при продолжительности ГЭРБ более 5 лет, доказывая отягощающее влияние патологии желудочно-кишечного тракта на прогрессирование пародонтита, что согласуется с данными литературы [1, 8, 9].

Анализ результатов иммуногистохимического исследования десны показал, что в норме эпителиоциты слизистой полости рта проявляют низкий потенциал пролиферативной и антиапоптозной активности (Ki-67=11,5±1,2); (Bcl-2 =2,8±0,4); индекс апоптоза (Iapt=0,44±02). Хронический генерализованный пародонтит без патологии пищевода характеризовался увеличением экспрессии (Ki-67=17,5±0,3) и (Bcl-2=5,2±0,5) при относительно низком индексе апоптоза (Iapt=2,7±0,5). У пациентов с НФГЭРБ происходило многократное нарастание пролиферативного потенциала эпителиоцитов десны, что нашло отражение в увеличении количества иммунопози-тивных клеток (Ki-67=19,8±0,2). При этом апоптоз также нарастал (Iapt=0,7±0,6), однако степень его увеличения не соответствовала пролиферативной активности эпителиоцитов. Последнее объясняется генетической перестройкой отдельных клеток с появлением у них способности экспрессировать анти-апоптозную молекулу (Bcl-2=6,8±0,4) [9]. Однако у больных воспалительными заболеваниями пародонта на фоне ЭФГЭРБ клеточное обновление характеризуется прогрессирующим отставанием апоптоза (Iapt=0,9±0,5) эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта от скорости пролиферативных процессов (Ki-67=26,5±0.2) и (Bcl-2=7,3±0,6). Важную роль в прогрессировании воспалительных заболеваний пародонта играет усиленная пролиферация, которая активирует апоптоз.

Обсуждение . Собственные данные свидетельствуют, что заболевания пищевода способствуют прогрессированию заболеваний пародонта. Анализ стоматологического статуса пациентов с ВЗП на фоне ГЭРБ свидетельствует о более выраженном воспалительном поражении пародонтального комплекса в сравнении с пациентами без патологии пищевода. Для пациентов с ВЗП на фоне ЭФГЭРБ характерны более тяжелые воспалительно-деструктивные изменения в тканях пародонта, чем на фоне НФГЭРБ. Значительным фактором риска возникновения и прогрессирования заболеваний пародонта у лиц, страдающих ГЭРБ, становится длительность болезни пищевода.

Анализ полученных данных позволяет выявить стереотипные изменения показателей пролиферации и апоптоза эпителиоцитов десны у пациентов с заболеваниями пародонта на фоне гастроэзофагеальной рефлюксной болезни. При хроническом катаральном гингивите маркеры процессов клеточного гомеостаза (Ki-67, Bcl-2, Iapt) эпителиоцитов десны изменяются незначительно, показывая высокие ком- пенсаторные возможности эпителия на этой стадии заболевания. При пародонтите тяжелой степени наблюдается срыв механизмов адаптации тканей пародонта, который выражается в снижении значений Ki-67, и увеличение индекса апоптоза Iapt эпителиоцитов десны, что влечет за собой угнетение репаративных и прогрессирование деструктивных процессов в тканях пародонтального комплекса.

Заключение. Полученные изменения процессов клеточной пролиферации и апоптоза во многом определяют степень воспалительных и деструктивных поражений пародонта на фоне ГЭРБ и коррелируют со степенью тяжести воспалительных заболеваний пародонта. Ведущее значение в прогрессировании воспалительно-деструктивных изменений тканей пародонта на фоне ГЭРБ принадлежит Ki-67, характеризующему степень активности процессов пролиферации, и Bcl-2, отражающему выраженность антиапоптозной активности, и индексу апоптоза, выражающему степень атрофии тканей пародонта.

Конфликт интересов. Работа проведена в рамках диссертационного исследования, номер государственной регистрации 01201267994, и не имеет коммерческой или иной заинтересованности физических и юридических лиц.

Библиографический спиисок

• 1.    Булкина Н. В., Еремин О. В., Козлова И. В. Воспалительные заболевания пародонта у пациентов гастроэнтерологического профиля. Саратов: СГМУ, 2012. 211 с.

• 2.    Осадчук М. А., Осадчук А. М., Балашов Д. В. Клинические формы гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: клинические, эндоскопические, функциональные и морфологические особенности // Медицинский альманах. 2011. № 2 (15). С. 53–58.

• 3.    Роль тучных клеток слизистой оболочки десны в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта / Ю. Л. Осипова, Н. В. Булкина, А. Ю. Кропотина [и др.] // Фундаментальные исследования. 2009. № 7. С. 55–56.

• 4.    Осипова Ю. Л., Булкина Н. В., Кропотина А. Ю. Воспалительные заболевания пародонта при неэрозивной форме гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: клинические и иммуноморфологические аспекты // Фундаментальные исследования. 2012. № 2 (ч. 2). С. 325–327.

• 5.    Цепов, Л. М., Николаев А. И. Диагностика и лечение заболеваний пародонта. М.: МЕДпресс-информ, 2004. 200 с.

• 6.    Kahrilas P. J. Pathophysiology of gasrtoesophageal reflux disease // Thorac. Surg. Clin. 2005. Vol. 15, № 3. P. 323–333.

• 7.    Dental and periodontal lesions in pacients with gasrtoesophageal reflux disease / J. V. Munoz, Herreros B., Sanchiz V. [et al.] // Dig. Live Dis. 2005. Vol. 35, № 7. P. 461–467.

• 8.    Smith M., Seymour G. J., Cullinan M. P. Hystopathologica l features of chronic and aggressive periodontitis // Periodontol. 2000. 2010. Vol. 53. P. 45–54.

• 9.    Carbott D. E., Duan L., Davis M.A. Phosphoimositol 3 kinase inhibitor, LY294002 increases bcl-2 protein and inhibits okadaic acid-induced apoptosis in Bcl-2 expressing renal epithelial crlls // Apoptosis. 2002. № 1. P. 69–76.

Translit

• 1.    Bulkina N. V., Eremin O. V., Kozlova I. V. Vospalitel'nye zabolevanija parodonta u pacientov gastrojenterologicheskogo profilja. Saratov: SGMU, 2012. 211 s.

• 2.    Osadchuk M. A., Osadchuk A. M., Balashov D. V. Klinich-eskie formy gastrojezofageal'noj refljuksnoj bolezni: klinicheskie, jendoskopicheskie, funkcional'nye i morfologicheskie osobenno-sti // Medicinskij al'manah. 2011. № 2 (15). S. 53–58.

• 3.    Rol' tuchnyh kletok slizistoj obolochki desny v patogeneze vospalitel'nyh zabolevanij parodonta / Ju. L. Osipova, N. V. Bulkina, A. Ju. Kropotina [i dr.] // Fundamental'nye issledovanija. 2009. № 7. S. 55–56.

• 4.    Osipova Ju. L., Bulkina N. V., Kropotina A. Ju. Vospali-tel'nye zabolevanija parodonta pri nejerozivnoj forme gastro-jezofageal'noj refljuksnoj bolezni: klinicheskie i immunomorfolog-

  icheskie aspekty // Fundamental'nye issledovanija. 2012. № 2 (ch. 2). S. 325–327.

• 5.    Cepov, L. M., Nikolaev A. I. Diagnostika i lechenie zabolevanij parodonta. M.: MEDpress-inform, 2004. 200 s.

• 6.    Kahrilas P. J. Pathophysiology of gasrtoesophageal reflux disease // Thorac. Surg. Clin. 2005. Vol. 15, № 3. P. 323–333.

• 7.    Dental and periodontal lesions in pacients with gasr-toesophageal reflux disease / J. V. Munoz, Herreros B., Sanchiz V. [et al.] // Dig. Live Dis. 2005. Vol. 35, № 7. P. 461–467.

• 8.    Smith M., Seymour G. J., Cullinan M. P. Hystopathological features of chronic and aggressive periodontitis // Periodontol. 2000. 2010. Vol. 53. P. 45–54.

• 9.    Carbott D. E., Duan L., Davis M.A. Phosphoimositol 3 kinase inhibitor, LY294002 increases bcl-2 protein and inhibits oka-daic acid-induced apoptosis in Bcl-2 expressing renal epithelial crlls // Apoptosis. 2002. № 1. P. 69–76.

СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА

Л. Ю. Островская — ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, доцент кафедры стоматологии терапевтической, доктор медицинских наук; Г. Д. Бейбулатов — ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, аспирант кафедры стоматологии терапевтической; А. И. Ханина — ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, врач-стоматолог клиники «Люкс Мастер» (Москва); А. П. Могила — ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, аспирант кафедры стоматологии терапевтической; Л. С. Катханова — ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, врач-стоматолог ГБУЗ «Участковая больница» с.п. Малка.

MODERN IMMUNOMORPHOLOGICAL ASPECTS OF DIAGNOSTICS

OF PERIODONTAL DISEASES

L. U. Ostrovskaya — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Dental Therapy, Assistant Professor, Doctor of Medical Science; G. D. Beybulatov — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Dental Therapy, Post-graduate; A. I. Khanina — Moscow Stomatological Clinic «Luxe Master»; A. P. Mogila — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky, Department of Dental Therapy, Post-graduate; L. S. Katkhanova — Saratov State Medical University n.a. V. I. Razumovsky.

Дата поступления — 10.05.2013 г.                                               Дата принятия в печать — 01.07.2013 г.

Островская Л. Ю., Бейбулатов Г. Д., Ханина А. И., Могила А. П., Катханова Л. С. Современные иммуноморфоло-гические аспекты диагностики заболеваний пародонта // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9, № 3. С. 453–456.

Молекулярные маркеры разрушения периодонтальной связки и альвеолярной костной ткани относятся к медиаторам, участвующих в поддержании хронического воспалительного процесса на уровне зубодесневого соединения. Цель : выявить изменения цитокинового профиля десневой жидкости и пролиферативной активности клеток десны у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. Материал и методы. Осуществлено иммуногистохимическое исследование биопсийного материала десны 70 пациентов с гингивитом и пародонтитом с моноклональными антителами: Ki-67 (маркера пролиферативной активности клеток), Bcl-2 (маркера апоптоза); применялся метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения уровня интерлейкинов-6, 10, 12, 18 в десневой жидкости (про- и противовоспалительные маркеры). Результаты. Показано, что определение уровня цитокинов в десневой жидкости позволяет мониторировать активность воспалительного процесса в тканях пародонта, а морфометрический анализ эпителиоцитов пародонта отражает степень его тяжести. Заключение . Использование молекулярных маркеров в обследовании пациентов с патологией пародонта является информативным методом, позволяющим прогнозировать развитие и течение хронического пародонтита.

Ostrovskayа L. U., Beybulatov G. D., Khanina A. I., Mogila A. P., Katkhanova L. S. Modern immunomorphological aspects of diagnostics of periodontal diseases // Saratov Journal of Medical Scientific Research. 2013. Vol. 9, № 3. P. 453–456.

Molecular markers of destruction of periodontal tissue and alveolar bone belong to the mediators, participating in maintenance of chronic inflammatory process in the clinical attachment. Purpose : To reveal changes of cytokine profile of gingival fluid and proliferative activity of cells of gum at patients with inflammatory periodontal diseases. Material and methods. Immunohistochemical research of biopsy gum material of 70 patients with periodontal disease with monoclonal antibodies: Ki-67 (marker of proliferative activity of cells), Bcl-2 (apoptosis marker); method of the solid-phase immunofermental analysis for level definition interleukin –6, 10, 12, 18 in gingival fluid (about — and anti-inflammatory markers). Results. It is shown that level definition of cytokines in gingival fluid allows to monitor the activity of the inflammatory process in the periodontal tissues, and the morphometric analysis of periodontal cells reflects degree of its weight. Conclusion. The use of molecular markers in inspection of patients with periodontal disease is the informative method, allowing to predict development and course of chronic periodontal disease.

1Введение. Среди актуальных проблем современной стоматологии эксперты ВОЗ отметили паро- донтит как наиважнейшую. Воспалительным заболеваниям пародонта подвержено до 95% населения старше 40 лет [1], что определяет их медицинское и социальное значение. Современные представления о патогенезе хронического генерализованного паро-