Роль натриевых каналов в механизме развития оксидативного стресса в модели ишемии/ реперфузии

Введение. Ишемическое и реперфузионное повреждение является критическим состоянием, при котором необходимо контролировать гибель клеток и сохранять функцию тканей. Ишемия определяется как гипоперфузия тканей. Некоторые состояния, такие как сепсис, острый коронарный синдром, а также трансплантация органов и травмы конечностей могут вызывать гипоперфузию тканей. Исследования показывают, что реперфузия приводит к последующему повреждению ишемизированной ткани, которое называется реперфузионным повреждением [1].

Ишемия может быть замаскирована под вполне терпимое явление, однако она работает как триггер для производства молекул, необходимых для индукции реперфузионного повреждения. При недостатке как кислорода, так и питательных веществ происходит отказ натрий-калиевых (насосы Na/K-АТФазы) и кальциевых насосов (насосы Са-АТФазы) на клеточной поверхности. Выход из строя насосов Na/K-АТФазы вызывает задержку натрия в клетках и калия вне клеток. Более высокий уровень натрия в клетках снижает активность натрий-водородных обменных насосов (Na/H-насосы). Кальциевые насосы в эндоплазматическом ретикулуме также перестают функционировать, что ограничивает обратный захват кальция. Накопление ионов водорода, натрия и кальция в клетках вызывает гиперосмолярность, что приводит к поступлению воды в ци- топлазму и набуханию клеток. Удержание водорода снижает клеточный pH, что приводит к нарушению активности ферментов и скоплению ядерного хроматина [2, 3]. При реперфузии активность обменных Na/H-насосов ускоряется за счет вымывания внеклеточных ионов H+, которые накапливались во время ишемии, что увеличивает протонный градиент через плазмолемму и дополнительно увеличивает цитозольный Ca2+. В попытке справиться с огромными изменениями уровней цитозольного Ca2+ увеличивается транспорт через митохондриальный унипортер Ca2+. Используя отрицательный митохондриальный потенциал, этот транспортер перемещает положительно заряженные ионы Ca2+ в митохондриальный матрикс [4, 5]. С одной стороны, происходит снижение цитозольного Са2+, с другой – повышение митохондриального Са2+, что вызывает открытие митохондриальной поры переходного типа, выделение цитохрома и запуск программ гибели клеток [6]. Механизмы реперфузионного повреждения включают оба типа гибели клеток – некротическую и апоптозную [3]. Периоды ишемии связаны с увеличением скорости некроза, тогда как реперфузия, как это ни парадоксально, приводит к усилению апоптоза. При реперфузии обеспечиваются необходимые условия для выживания жизнеспособных клеток, однако восстанавливается энергия, необходимая для завершения апоптоза [7, 8].

Приток кислорода, возникающий на стадии реперфузии, подпитывает избыточное производство активных форм кислорода (АФК), создавая парадокс, заключающийся в том, что эти высокореактивные частицы могут модифицировать белки, липиды, нуклеиновые кислоты, приводя к гибели клеток. В дополнение к этому в настоящее время признано, что окислительно-восстановительные молекулы, полученные из оксида азота II (NO), также вносят свой вклад в ишемическое и реперфузионное повреждение посредством окислительных и нитрозативных реакций практически с каждой биомолекулой, обнаруженной в клетках [9, 10]. Однако как NO, так и АФК в зависимости от их концентрации могут либо непосредственно участвовать в повреждении, либо обеспечивать защиту [11].

Таким образом, поскольку при развитии реперфузионного повреждения, с одной стороны, происходит изменение концентрации ионов внутри клеток, одна из стратегий снижения массовой гибели клеток связана с регуляцией концентрации ионов. Однако в большинстве исследований ведущая роль отводится ионам кальция как вторичным мессенджерам [12]. Поскольку ионы натрия также принимают активное участие в развитии механизмов гибели [13], в рамках нашего исследования акцент был сделан на ионы натрия и потенциалзависимые ионные каналы как основной путь проникновения ионов в клетку и изучалось влияние пептидного ингибитора натриевых каналов при реперфузии. В качестве ингибитора использовался токсин из семейства кноттинов, которые характеризуются наличием ингибиторного цистинового узла, придающего стабильность молекуле [14, 15]. Подобные токсины способны избирательно связываться с ионными каналами и ингибировать их действие.

С другой стороны, при развитии реперфузионного повреждения после ишемии ключевая роль отводится АФК и NO, а также активации антиоксидантной системы как ответной реакции на оксидативный стресс.

Цель исследования. Изучение роли натриевых каналов в развитии оксидативного стресса как при развитии ишемического и реперфузионного повреждения, так и при действии ингибитора натриевых каналов.

Материалы и методы. В работе было изучено влияние пептидного токсина – ингибитора натриевых потенциалзависимых каналов μ-agatoxin-Aa1a (UniProt: P11057). Токсин был синтезирован с использованием автоматического пептидного синтезатора ResPep SL (Intavis, Германия) по стандартному протоколу. Анализ токсина проводился методом обращенно-фазовой хроматографии с использованием хроматографической системы Shimadzu LC-20AD XR и колонки Dr. Maisch Luna C18(2) по стандартному протоколу градиентного элюирования от 95 % A, 5 % B до 0 % A, 100 % B в течение 40 мин, где элюент A – деионизированная вода, элюент B – ацетонитрил. Детектирование осуществлялось на длине волны 215 нм. Масс-спектрометрический анализ проводился с использованием программно-аппаратного комплекса MALDI-TOF MS FLEX series (Bruker Daltonics, Германия). Очистка производилась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием системы хроматографии NGC Quest™ 10 (Bio-Rad, США) на колонке Econo-Column 1x30cm (Bio-Rad, США).

Исследование было проведено на культуре CHO-K1 эпителиального происхождения. Культура содержалась при 37 °С и 5 % СО 2 в среде DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) с 10 % фетальной бычьей сывороткой (Biosera, Франция) и гентамицином, пассажи делались каждые 3–4 дня. Для воспроизведений ишемического и реперфузионного повреждения культура на экспоненциальной стадии роста помещалась на 3 ч в условия ишемии (среда DMEM с пониженным содержанием глюкозы (1 г/л), сыворотки (1 %) и кислорода (1 %)), затем на 3 ч в условия реперфузии (DMEM с содержанием глюкозы 3,15 г/л, сыворотки 10 % и кислорода 18,6 %) с токсином в концентрации

50 нМ и без него. По завершении реперфузии фиксировался уровень апоптоза, некроза, концентрация АФК, NO и глутатиона. Измерение проводилось с использованием планшетного ридера-флуориметра CLARIO star Plus (BMG LABTECH, Германия) и флуоресцентных красителей: Yo-PRO 1 PI (1 мкМ) для апоптоза и некроза, DCFH DA (1 мкМ) для АФК, DAF FM (1 мкМ) для NO, MCB (1 мкМ) для глутатиона. Первичная обработка данных проводилась с использованием ПО Mars (BMG LABTECH, Германия). Данные были пересчитаны на 100 000 клеток. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием критерия Манна – Уитни.

Результаты. В результате исследования было выявлено, что уровень апоптоза при моделировании условий ишемии/реперфузии повышается относительно контрольных условий. Однако при наличии в среде для реперфузии токсина в концентрации 50 нМ апоптоз остается на уровне нормальных условий (рис. 1).

Рис. 1. Изменение уровня апоптоза в культуре CHO-K1 при действии токсина в концентрации 50 нМ в условиях ишемии/реперфузии (И/Р) (ОЕФ – относительные единицы флуоресценции;

* – p<0,05 при сравнении с экспериментальной группой (И/Р);

** – p<0,05 при сравнении с контролем. Далее обозначения те же)

Fig. 1. Change in the apoptosis level in CHO-K1 culture under ischemia/reperfusion (I/R), toxin concentration 50 nM (RFU – relative fluorescent unit;

* – p<0.05 the differences are significant when compared to the experimental group (I/R);

** – p<0.05 the differences are significant when compared to the control group)

Далее было обнаружено, что аналогично апоптозу уровень некроза в условиях ише-мии/реперфузии возрастает. Добавление ток- сина в концентрации 50 нМ также поддерживает уровень некроза на уровне контрольных условий (рис. 2).

Рис. 2. Изменение уровня некроза в культуре CHO-K1 при действии токсина в концентрации 50 нМ в условиях ишемии/реперфузии

Fig. 2. Change in the necrosis level in CHO-K1 culture under ischemia/reperfusion (I/R), toxin concentration 50 nM (RFU – relative fluorescent unit;

* – p<0.05 the differences are significant when compared to the experimental group (I/R);

** – p<0.05 the differences are significant when compared to the control group)

На рис. 3, где представлено изменение концентрации активных форм кислорода при моделировании условий ишемии/реперфузии в присутствии токсина и без него, видно, что токсин дополнительно снижает внутриклеточ- ную концентрацию АФК относительно контрольных условий, несмотря на то что при реперфузии концентрация АФК в наших экспериментах не повышается.

Рис. 3. Изменение концентрации активных форм кислорода в культуре CHO-K1 при действии токсина в концентрации 50 нМ в условиях ишемии/реперфузии

Fig. 3. Change in the concentration of reactive oxygen species in CHO-K1 culture under ischemia/reperfusion (I/R), toxin concentration 50 nM (RFU – relative fluorescent unit;

* – p<0.05 the differences are significant when compared to the experimental group (I/R);

** – p<0.05 the differences are significant when compared to the control group)

При моделировании условий ишемии/ре-перфузии изменения концентрации глутатиона не происходит как при реперфузии без токсина, так и при реперфузии в присутствии токсина (рис. 4).

Рис. 4. Изменение концентрации глутатиона в культуре CHO-K1 при действии токсина в концентрации 50 нМ в условиях ишемии/реперфузии

Fig. 4. Change in glutathione concentration in CHO-K1 culture under ischemia/reperfusion (I/R), toxin concentration 50 nM (RFU – relative fluorescent unit;

• *    – p<0.05 the differences are significant when compared to the experimental group (I/R);

** – p<0.05 the differences are significant when compared to the control group)

На рис. 5 видно, что при ишемии/репер-фузии в культуре происходит снижение концентрации оксида азота ниже контрольного уровня. Однако добавление токсина поддерживает концентрацию оксида азота на контрольном уровне.

Рис. 5. Изменение концентрации оксида азота (II) в культуре CHO-K1 при действии токсина в концентрации 50 нМ в условиях ишемии/реперфузии

Fig. 5. Change in nitric oxide concentration in CHO-K1 culture under ischemia/reperfusion (I/R), toxin concentration 50 nM (RFU – relative fluorescent unit;

• *    – p<0.05 the differences are significant when compared to the experimental group (I/R);

** – p<0.05 the differences are significant when compared to the control group)

Обсуждение. В наших экспериментах было изучено влияние токсина-ингибитора натриевых потенциалзависимых каналов на апоптоз, некроз и оксидативный стресс клеточной культуры CHO-K1 при моделировании условий ишемии/реперфузии. Апоптоз как запрограммированная гибель клеток тонко регулируется на генном уровне, что приводит к упорядоченному и эффективному удалению поврежденных клеток. Механизм апоптоза сложен и включает множество сигнальных путей [16]. В то время как некроз, также известный как незапрограммированная гибель клеток, вызывает морфологические изменения, включая набухание клеток или ядер и разрушение плазматической мембраны [17]. Для развития ишемического и реперфузионного повреждения характерны оба типа гибели клеток. Общее повреждение тканей, вызванное ише-мией/реперфузией, делится на две части: ишемическое повреждение (истощение клеточной энергии) и реперфузионное повреждение (резкое восстановление потока питательных веществ и кислорода). После ишемии продукты обмена веществ задерживаются в клетке и вызывают ацидоз. На стадии реперфузии продукция активных форм кислорода усиливается, что приводит к вторичному повреждению.

Данные наших экспериментов указывают на развитие и апоптоза, и некроза при моделировании условий ишемии/реперфузии в клеточной культуре (рис. 1, 2). Добавление токсина в концентрации 50 нМ носит защитный характер и предотвращает массовую гибель клеток. Как упоминалось выше, развитие как апоптоза, так и некроза при реперфузии связано с повышением АФК. Однако в наших экспериментах подобного не отмечается (рис. 3), что также коррелирует с данными об изменении концентрации глутатиона (рис. 4), который должен выступать в роли антиоксидантной системы. Один из вероятных механизмов подобного действия связан с использованием эпителиальной клеточной культуры. Несмотря на то что данная культура подвержена ишемическому и реперфузионному повреждению, которое проявляется в виде развития апоптоза и некроза, механизм повреждения носит иной характер. Чувствительность клеток к гипоксическому воздействию варьирует среди различных типов тканей. Хотя существуют различные способы запуска апоптоза и некроза, морфологические паттерны остаются неизменными. Следовательно, каким бы ни был стимул, существует общий конечный путь, который может привести к гибели клеток. Однако стоит отметить, что токсин в данном случае снижает физиологическую концентрацию активных форм кислорода, что никак не сказывается на изменении других параметров и не оказывает влияния на концентрацию глутатиона. С другой стороны, параллельный оксида-тивному стрессу процесс связан с изменением концентрации оксида азота. Многочисленные эксперименты свидетельствуют о том, что NO снижает неблагоприятный эффект ишемии/ реперфузии [18]. У мышей с нокаутом эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) функциональное восстановление после ишемии/ре-перфузии ослаблено [19], в то время как увеличение концентрации NO ускоряет функциональное восстановление клеток [20]. В нашем случае при моделировании условий ише-мии/реперфузии происходит снижение концентрации оксида азота, что коррелирует с увеличением апоптоза и некроза. С другой стороны, добавление токсина препятствует снижению концентрации NO (рис. 5), что в свою очередь благоприятно сказывается на выживании клеток (рис. 1, 2).

Заключение. Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что пептидный токсин – ингибитор натриевых потенциалзависимых каналов предотвращает массовую гибель клеток в культуре CHO-K1 при моделировании условий ишемии/репер-фузии за счет ингибирования развития апоптоза и некроза. Однако, хотя изучаемая культура и подвергается ишемическому и реперфузионному повреждению, механизм гибели не связан с развитием оксидативного стресса. Несмотря на это, изучаемый токсин может рассматриваться в качестве защитной стратегии для предотвращения массовой гибели клеток в клеточной модели ишемии/ре-перфузии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № FEUF-2022-0008).