Роль оксида азота в регуляции микроциркуляторного звена системы гемостаза (обзор литературы)

Saratov State Medical University

In this overview given the information about a role of nitric oxide in the regulation of microcirculatory unit of haemostasis. Discussed the questions about the meaning of nitric oxide in regulation of aggregation activity of platelets and functional properties of red blood cells.

О^сид азота (NO) – это бесцветный ^аз, растворимый в воде, один из самых простых представителей веществ с нечетным числом эле^тронов. Е^о ради-^альные свойства об^словлены способностью реа-^ировать с различными соединениями и свободны -ми ради^алами. О^сид^ азота прис^щи свойства вн^т-ри- и меж^леточно^о вторично^о мессенджера [46]. Он та^ же является пара^ринным соединением, та^ ^а^ может о^азывать воздействие на ф^н^ции различных соседних ^лето^. Компле^сы о^сида азота (с тиолами, бел^ами, сахарами, ионами металлов, ^ем-мами протеинов) непрерывно цир^^лир^ют в ^рово-то^е, выполняя ^^моральн^ю ре^^ляцию различных ф^н^ций ор^анизма [66].

Образование о^сида азота в ор^анизме челове^а и животных основано на ферментативной трансформации ^^анидиново^о фермента пол^заменимой ами-но^ислоты L-ар^инина [34] под воздействием ферментов семейства цитохром Р-450 – подобных ^е-мопротеинов – NO-синтаз (NOS) с ^частием ни^оти-намидадениндин^^леотида (НАДФН) ^а^ источни^а эле^тронов и ^офа^торов – флавинадениндин^^ле-отида (ФАД), флавинмонон^^леотида (ФМН) и 5,6,7,8 – тетра^идробиопротеина (BH4) [27].

В настоящее время различают след^ющие изоформы NOS: нейрональная NO-синтаза (nNOS или

NOS-1) – впервые обнар^жена в нейронах, ^де про-д^цир^емый ею о^сид азота действ^ет ^а^ нейротрансмиттер; ма^рофа^альная NO-синтаза (iNOS или NOS-2) – э^спрессир^ется ма^рофа^ами и обеспечивает имм^нн^ю защит^ ор^анизма, то есть синтез NO ^а^ цитото^сичес^о^о а^ента; эндотелиальная NO-синтаза (eNOS или NOS-3) – ^енерир^ет NO, ^оторый понижает артериальное давление и ин^ибир^ет а^ре^ацию тромбоцитов [40]. Хотя все изоформы NOS ^атализи-р^ют образование NO, ^аждая из них имеет свои особенности ^а^ в ло^ализации, с^орости ^атализа и механизмах ре^^ляции, та^ и в биоло^ичес^ом значении для ор^анизма, поэтом^ ^^азанные изоформы принято подразделять на ^онстит^тивные (в^лючает NOS-1 и NOS-3) и инд^цибельн^ю (NOS-2). А^тив-ность ^онстит^тивных форм NOS зависит от ^онцент-рации Ca2+ в цитоплазме, они прод^цир^ют относительно небольшое ^оличество о^сида азота в ответ на рецепторн^ю и физичес^^ю стим^ляцию [63]. Количество о^сида азота, образ^юще^ося под влиянием инд^цибельной NOS, может варьировать и дости-^ать больших цифр (в 100 раз выше, чем ^ NOS-3) [63]. А^тивность iNOS не зависит от ^ровня ионов ^аль-ция, ре^^лир^ется на ^ровне э^спрессии ^ена iNOS [61]. Э^спрессию ^ена iNOS стим^лир^ет ряд провос-палительных цито^инов [34].

Ранее считалось, что NOS - зависимый синтез физиологически необходимого количества NO осуществляется только за счет NOS-1 и NOS-3, а NOS -зависимый синтез дополнительного количества NO при различных заболеваниях за счет NOS-2 [40]. В этом заключается ответ на вопрос, почему NOS-2 получила название индуцибельной NOS (из-за индуцированного болезнью синтеза) и почему NOS-1 и NOS-3 условно объединили в одну конститутивную NOS. Прилагательным «конститутивная» подчеркивался физиологический характер синтеза NO, катализируемый NOS-1 и NOS-3.

Однако в последующих работах [31,43] были выявлены участие NOS-2 в физиологическом синтезе NO и участие NOS-1 и NOS-3 в дополнительном синтезе NO при инфекционных и аллергических болезнях [70,71].

При всем многообразии биологических эффектов, вызываемых высвобождением NO, и разнотипности систем, на которые действует этот регулятор метаболизма, важнейшей физиологической мишенью для NO в организме является растворимая гуа-нилатциклаза (ГЦ) [67].

Растворимая ГЦ катализирует биосинтез из гуанозинтрифосфата (ГТФ) циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), который является важным регулятором метаболизма клетки [2].

О^сид азота выполняет мно^о важных ф^н^ций в организме: является нейромедиатором, вазодилататором, антиагрегантом, мощным фактором гемостаза [32]. Кроме того, NO имеет большое значение в регуляции деятельности дыхательной, пищеварительной, мочеполовой и других физиологических систем организма [26,57,62]. Однако, учитывая ис^лючительн^ю роль ми^роцир^^ляторных нарушений в патогенезе широкого круга заболеваний [47], в данном обзоре преимущественно рассматривается роль оксида азота в регуляции микроциркуляции.

Как известно, различают внесосудистый, сосудистый и внутрисосудистый компоненты нарушений микроциркуляции [23]. Внутрисосудистый компонент микроциркуляции представлен микроциркуляторным (сосудисто-тромбоцитарным) и коагуляционным звеньями системы гемостаза, реологическими свойствами крови [23]. Нарушения внесосудистого компонента ми^роцир^^ляции носят преим^щественно вторичный характер, а ключевая роль в развитии нарушений ми^роцир^^ляции принадлежит ее сос^дистом^ и внутрисосудистому компонентам.

Оксид азота и сосудистый компонент микроциркуляции

Эндотелиальные ^лет^и являются источни^ом оксида азота, который принимает участие в регуляции сосудистого сопротивления. Он опосредует со-с^дорасширяющие эффе^ты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора эндотелина - I и высвобождение норадреналина о^ончаниями симпатичес^их нейронов, припятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина II, тромбоксана А2) и благодаря этому NO принимает участие в регуляции сосудистого тонуса и кровотока, системной гемодинамики и микроциркуляции [16,47].

Оксид азота в клетках эндотелия синтезируется III типом NOS (eNOS). Продукция эндотелиальной син тазы оксида азота контролируется: 1) постоянно посредством увеличения уровня экспрессии и 2) однократно за счет регуляции активности фермента. Постоянная регуляция активности eNOS в основном обусловлена действием на эндотелиальные клетки механических сил - касательным напряжением сосудистой стенки. Длительное увеличение напряжения сдвига приводит к увеличению уровня экспрессии eNOS посредством транскрипционной индукции и стабилизации mRNA [35]. В то же время во многих экспериментах было показано, что нарушение показателей гемодинамики и чрезмерное увеличение касатель-но^о напряжения сос^дистой стен^и мо^^т приводить к возникновению эндотелиальной дисфункции и нарушать продукцию оксида азота. Постоянная регуляция обеспечивает поддержание базально^о ^ровня продукции оксида азота, обусловливая тонические эффекты NO.

Помимо постоянной регуляции продукции NO существует однократная или острая регуляция, связанная с изменением скорости катализа eNOS. На базальном уровне неактивное состояние eNOS поддерживается за счет нескольких независимых механизмов. Большая часть молекул eNOS связана с кавео-лином-1, и их ферментативная активность подавлена [49]. Кроме того, было показано, что активность eNOS подавляется при взаимодействии с некоторыми G-связанными рецепторами такими, как в₂-бради-кининовые рецепторы, АТ 1 рецепторами к ангиотензину II и ET B рецепторами к эндотелину - 1 [48,54]. Было показано, что брадикинин стимулирует фосфорилирование тирозина в₂ - рецептора, и это сопровождается кратковременной диссоциацией eNOS от рецептора и увеличением продукции NO.

Ключевую роль в регуляции активности eNOS играет концентрация ионов кальция в цитоплазме. Замещение кавеолина - 1 комплексом Ca2+ / кальмодулин в ответ на Ca2+ - мобилизирующие агонисты, включая ацетилхолин и АТФ, приводит к активации eNOS [49]. Кроме того, существует ряд белков, которые взаимодействуют с eNOS и регулируют ее активность. Так, Hsp 90, который впервые был идентифицирован как 90 kda тирозин-фосфорилированный eNOS - связанный протеин, оказывает положительное влияние на активность eNOS [60]. Его взаимодействие с eNOS стимулируется гуморальными (гистамин) и физическими факторами (напряжение сдвига) и ведет к активации eNOS и в конечном итоге к увеличению продукции оксида азота [42].б Dynamin-2 (GTP-связанный белок) и порин (потенциал-зави-симый анионный канал) могут взаимодействовать с eNOS [69]. Их взаимодействие с eNOS потенцируется ионами внутриклеточного Ca2+ и приводит к активации eNOS.

Использование ингибиторов тирозинкиназы угнетает прод^^цию о^сида азота в ^лет^ах эндотелия при напряжении сдвига. Этот факт подтверждает роль тирозинкиназ в процессе активации eNOS [73]. Однако в настоящее время непонятно, каким образом тирозинкиназы регулируют активность eNOS. Существует два возможных механизма: 1)тирозинкиназа непосредственно фосфорилирует eNOS на тирозиновые остатки; 2) тирозинкиназа фосфорилирует eNOS - связанные белки, косвенно регулируя активность фермента [73].

Часть синтезированного оксида азота может связываться в комплексы, которые образуют физиоло- гически активное депо. Это депо может не только связывать, но и постепенно высвобождать NO. Депонирование оксида азота происходит в стенках сосудов и начинается при повышении его концентрации. Формирование NO-депо является важной частью адаптивных реакций [15,17,19].

Основными формами депонирования и транспорта NO являются S-нитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа. S-нитрозотиолы способны переносить NO между клетками и связываться с белками через их SH-группы [2,15].

Как указывалось выше, оксид азота является важным фактором регуляции тонуса сосудов, что определяет функционирование микроциркуляции и системную гемодинамику. Оксид азота, проникая в гладкомышечные сосудистые клетки, активирует гуани-латциклазу, которая увеличивает образование цГМФ. Высвобождение и на^опление цГМФ приводят ^ активации фермента цГМФ-зависимой протеинкиназы [2]. Потенциальными мишенями для цГМФ-зави-симой протеинкиназы (тип I) в сосудистых гладкомышечных клетках являются Ca2+ зависимые калиевые каналы и IRAG-белки, участвующие в моделировании входа вне^леточно^о ^альция и высвобождения внутриклеточного кальция [39]. Фосфорилирование этих двух белков может снижать концентрацию цитозольного кальция, что ведет к расслаблению сосудов.

В качестве альтернативного субстрата для цГМФ -зависимой протеинкиназы (тип I) может служить фос-фоламбан, который модулирует активность кальций-зависимой АТФазы в эндоплазматическом ретикулуме [51]. Нельзя исключить того, что кальций-зависи-мая АТФаза может активироваться посредством фосфорилирования цГМФ, что также приводит к уменьшению уровня цитозольного кальция, а следовательно, и вазодилатации [39].

С другой стороны, оксид азота, продуцируемый эндотелием, оказывает влияние и на внутрисосудистый компонент микроциркуляции. Изменение геометрии сосудистого русла вследствие вазодилатации приводит к изменению реологических свойств крови [39].

В настоящее время известно, что из большого числа биологически активных веществ, секретируемых эндотелием, именно оксид азота регулирует активность других медиаторов. В частности, оксид азота стимулирует продукцию эндотелием простациклина, который ингибирует адгезию тромбоцитов к эндотелию и их агрегацию [45,58,72], а также снижает тонус сосудистой стенки [72].

Оксид азота повышает тромборезистентность эндотелия сосудистой стенки, блокируя стимулируемую цитокинами экспрессию адгезивных молекул эндотелия (VCAM-I, E-селектин, MCP) [36] и экспрессию активирующего тромбоциты фактора [53].

О^сид азота и а^ре^ационная а^тивность тромбоцитов

Развитие тромботических заболеваний обусловлено дисф^н^цией эндотелия ^ровеносных сос^дов и активацией тромбоцитов [3-9,11-13,18,21]. Активация тромбоцитов происходит под воздействием агонистов агрегации, таких как тромбин, АДФ, коллаген, фактор Виллебранда, что приводит к образованию тромбоцитарных тромбов [1,4,24]. Активированные тромбоциты секретируют большое количество АДФ, серотонина и других факторов, которые потенцируют процессы ад^езии и а^ре^ации тромбоцитов

[1,4,24,64]. Активированные тромбоциты также секретируют прокоагулянты, провоспалительные факторы и фактор роста [64]. Таким образом, активация тромбоцитов приводит не толь^о ^ развитию остро^о артериального тромбоза, но и способствует развитию хронических заболеваний, таких как атеросклероз, что в конечном счете приводит к развитию тромбоза [3-9,11-13,18,21,41].

В настоящее время основным фактором, обеспечивающим ин^ибирование процессов ад^езии и агрегации кровяных пластинок оксидом азота, считается цГМФ - зависимый механизм, суть которого сводится ^ а^тивации ^^анилатци^лазы и повышению продукции цГМФ [1,4,24]. Активация гуанилатциклазы может происходить по двум механизмам: гем-зави-симому и гем-независимому. Классическим путем а^тивации ^^анилатци^лазы является образование нитрозил-гемового комплекса, приводящее к увеличению продукции цГМФ. Однако показано, что активация гуанилатциклазы может происходить и по гем-независимому механизму за счет окисления лабильных SH-групп N-концевой области [22].

NO/ цГМФ сигнальный путь осуществляется через тип I цГМФ-зависимой протеинкиназы: комплекс NO/ цГМФ/тип I цГМФ - зависимой протеинкиназы вызывает фосфорилирование тромбоцитарного VASP, что приводит ^ ин^ибированию а^тивации тромбоцитов как в условиях in vitro, так in vivo, за счет ингибирования рецепторов к фибриногену (интегриновый комплекс GP IIb-IIIa) и процесса связывания VASP с F-актином, а также локализации VASP к фокальным интегринам, опосредующим процесс адгезии [65,67]. Кроме VASP тип I цГМФ-зависимой протеинкиназы вызывает фосфорилирование других тромбоцитарных субстратов, таких как IP3 рецептор, белок теплового шока 27, LIM и SH3 белка [65].

NO/цГМФ механизм, осуществляющийся через тип I цГМФ-зависимой протеинкиназы, также ингибирует тромбоцитарный Gp/Gi - связанный рецепторный ответ и тромбоцитарный рецептор P2Y12 к АДФ [25].

Кроме того, цГМФ тормозит освобождение арахидоновой кислоты, предотвращая активацию фосфолипазы А₂, что предупреждает образование тромбоксанов А 2 и В₂, стимулирующих накопление в тромбоцитах Са ²⁺. Кроме того, цГМФ блокирует инози-толтрифосфатный путь, предотвращая образование 1,2-диацилглицерина - активатора протеинкиназы С, которая, фосфорилируя белки тромбоцитов с молекулярной массой 20 и 40 кДа, вызывает их активацию и агрегацию [22]. цГМФ препятствует также образованию инозитолтрифосфата, вызывающего накопление ионов Са²⁺ [22]. Таким образом, цГМФ, предотвращая распад мембранных фосфолипидов, ингиби-р^ет а^ре^ацию тромбоцитов через общий механизм торможения накопления ионов Са ²⁺ в тромбоцитах.

Учитывая, что взаимодействие оксида азота с активными формами кислорода во многом определяет токсические эффекты оксида азота [38], несомненный интерес представляет вопрос о влиянии подобного взаимодействия на функциональную активность тромбоцитов. Кроме того, взаимодействие с активными формами кислорода во многом определяет цГМФ-независимые пути действия оксида азота.

Помимо эффектов цГМФ, существует ряд альтернативных механизмов, обусловливающих действие NO как фактора, препятствующего адгезии и агрегации тромбоцитов. Так, показано [68], что инкубация тромбоцитов с SNP приводит ^ ин^ибированию ад^е-зии тромбоцитов по цГМФ-независимом^ п^ти, в^лю-чающем^ образование с^перо^сид аниона, перо^со-нитрита и нитрование б-actinin-1. Последний ^частв^-ет в реор^анизации а^тиновой сети в тромбоцитах во время их а^тивации [68]. Кроме то^о, б-actinin-1 может образовывать связи межд^ а^тином и цитоплаз-матичес^ими доменами инте^ринов, то есть б-actinin-1 находится в тесной взаимосвязи с трансмембранными ад^езивными рецепторами и бел^ами цитос-^елета и может выст^пать в ^ачестве ре^^лир^юще^о а^ента [68]. Нитрование б-actinin-1 сопровождается ин^ибированием ад^езии тромбоцитов.

цГМФ – независимые механизмы действия NO не о^раничиваются толь^о препятствованием ад^езии, и^рая важн^ю роль та^же и в реализации антиа^ре-^антно^о эффе^та о^сида азота. В работе S. Massberg, et.al. [55] было по^азано, что ин^^бация тромбоцитов с селе^тивным бло^атором растворимой ^^анилатци^-лазы – ODQ ин^ибир^ет прод^^цию цГМФ, вызван-н^ю нитропр^ссидом и S-нитрозо-цистеином (транспортная форма/донатор NO), одна^о не препятств^ет антиа^ре^антном^ действию нитропр^сида и S-нитрозо-цистеина. Пол^ченный эффе^т авторы связывают с ^^нетением цАМФ-фосфодиэстераз, ^лицеральде-^ид-3-фосфат-де^идро^еназы и анта^онизацией рецепторов тромбо^сана А2.

Одна^о роль о^сида азота в ре^^ляции а^тивности тромбоцитов не исчерпывается толь^о ^^нетением ад^езии и а^ре^ации. Низ^ие ^онцентрации о^сида азота и^рают важн^ю роль в реа^ции тромбоцитов на слабые а^онисты а^ре^ации [30]. Кроме то^о, о^сид азота является важным фа^тором а^ре^ационно-за-висимой се^реции тромбоцитов, то есть о^сид азота является фа^тором, ^силивающим ч^вствительность тромбоцитов ^ поврежденной сос^дистой стен^е, принимая ^частие в стабилизации тромбоцитарных тромбов и проявляя двойной эффе^т в ре^^ляции ф^н^ции тромбоцитов [30].

О^сид азота и ф^н^циональные свойства эритроцитов

Важным фа^тором, определяющим вн^трисос^ди-стый ^омпонент ми^роцир^^ляции, являются реоло-^ичес^ие свойства ^рови и, прежде все^о, ее вяз^ость [23]. Количественный и ^ачественный состав эритроцитов почти полностью определяют величин^ вяз^о-сти ^рови. Ка^ по^азали опыты с моделями эритроцитов, при высо^их с^оростях течения, хара^терных для артериально^о р^сла, или большим сдви^овом воздействии в ^апиллярах, поддержание ^ровото^а определяется прежде все^о способностью эритроцитов ^ изменению формы [10]. Степень деформации эритроцитов зависит от внешних сил, действ^ющих на ^лет^^, и деформир^емости самой ^лет^и [10]. Вяз^ость ^рови в значительной степени определяется и способностью эритроцитов ^ а^ре^ации [10,14,20].

Эритроциты челове^а ч^вствительны ^ инд^ци-бельной и ^онстит^тивной формам о^сида азота и сами обладают способностью синтезировать о^сид азота [50]. По^азано наличие растворимой ^^анилат-ци^лазы и фосфодиэстеразы в эритроцитах челове-^а [59]. Было сделано предположение, что о^сид азота, синтезированный в эритроцитах, может принимать ^частие в ре^^ляции физиоло^ичес^о^о поведения эритроцита, наряд^ с внешним о^сидом азота [50].

В работе Korbut et al. [52] было по^азано, что о^-сид азота может о^азывать ре^^ляторный эффе^т на деформир^емость и а^ре^ацию эритроцитов, и данный эффе^т является дозозависимым. Ацетилхолин и донатор о^сида азота spermine-NONOate ^л^чшают деформир^емость эритроцитов. Было сделано предположение, что ацетилхолин может ^силивать синтез о^сида азота посредством а^тивации M1 – холи-норецепторов на мембране эритроцита [56]. Длительное ин^ибирование прод^^ции NO синтазы с помощью NO-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) приводило ^ достоверном^ ^меньшению деформир^емос-ти эритроцитов ^рысы; механичес^ие по^азатели эритроцитов от этих животных были нормализованы в ^словиях in vitro с помощью низ^их доз нитропр^сси-да натрия – донатора о^сида азота [29].

О^сид азота о^азывает воздействие на транспорт ионов через мембран^ эритроцита. Та^, было по^а-зано, что а^тивация Na+-K+ - АТФазы и Ca+ - АТФазы стим^лир^ется донаторами о^сида азота [37]. Одна^о ^становлено [28], что ^онцентрация вн^три^леточно-^о ^альция не изменялась ^а^ при использовании бло^атора NOS L-NAME, та^ и при использовании донатора о^сида азота – нитропр^ссида натрия.

Известно, что о^сид азота прямо или опосредованно влияет на транспорт ионов ^алия через ^ле-точн^ю мембран^ (данный процесс потенцир^ется нитритом или перо^синитритом) [44]. Бло^ада транспорта ионов ^алия через мембран^ эритроцита предотвращает небла^оприятный эффе^т неселе^тивных бло^аторов NOS на по^азатели деформир^емости эритроцитов [28]. Эти данные позволяют предположить, что торможение синтеза о^сида азота неселе^-тивными ин^ибиторами NOS может привести ^ ^х^д-шению механичес^их по^азателей эритроцитов за счет ^величения проницаемости мембраны эритроцитов для ионов ^алия. Данное предположение подтверждается тем, что анало^ L-ар^енина способств^-ет ^величению потери ионов ^алия эритроцитом и ^меньшению синтеза вн^три^леточно^о о^сида азота [33]. Увеличенный выход ионов ^алия из эритроцита та^же может возни^н^ть под действием метаболитов о^сида азота (нитриты, перо^синитриты) [44].

Та^им образом, о^сид азота о^азывает влияние на деформир^емость эритроцитов и способств^ет поддержанию нормальных по^азателей деформир^-емости эритроцитов. В ^словиях in vivo эритроциты ч^вствительны ^ о^сид^ азота, синтезированно^о ^а^ в ^лет^ах эндотелия, та^ и в эритроцитах.