Роль полиморфных вариантов гена аполипопротеина Е в развитии сердечно-сосудистых заболеваний у жителей Республики Карелии

Нарушение липидного обмена является одним из факторов, способствующих возникновению сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС) и обширный инфаркт миокарда (ОИМ). Существенную роль в метаболизме липидов играет белок плазмы крови аполипопротеин Е (ApoE). Он выступает в качестве лиганда для рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) клеток печени. Ген apoE, кодирующий данный полипептид, расположен на 19-й хромосоме и имеет несколько полиморфных сайтов как в промотор-ной части, так и в экзонах. Самый изученный из них - полиморфизм в позициях 3937С/Т и 4075С/ Т. Замена нуклеотидов приводит к замене аминокислот в положениях 112 и 158 аминокислотной последовательности белка, что, в свою очередь, способствует изменению сродства ApoE к рецепторам. Последнее обстоятельство влияет на уровень холестерина и других показателей липидного обмена в плазме крови. Так, показано, что наличие в генотипе аллеля e4 ассоцииру- ется с атерогенным профилем, повышенным уровнем холестерина, липопротеинов низкой плотности в крови [4], [5]. Аллелю e2, напротив, приписывают протективную, антиатерогенную роль. У носителей этого аллеля, как правило, понижено содержание холестерина и повышено содержание триглициридов [12]. Результаты исследований, проведенных в ряде европейских и азиатских стран, позволяют отнести аллель e4 к независимому фактору риска возникновения кардиоваскулярных расстройств [14]. Однако для населения других стран, например Финляндии, взаимосвязи между наличием в генотипе аллеля е4 и развитием сердечно-сосудистых заболеваний обнаружено не было [5], [9]. Таким образом, связь полиморфизма гена apoE с развитием ССЗ у разных групп населения специфична, что указывает на важность изучения этой проблемы в разных этнических группах и у жителей регионов с различными климато-географическими факторами. Необходимо отметить, что у населения Карелии, проживающего в

условиях нестабильного климата и светового режима Европейского Севера, полиморфизм гена apoE , который может быть связан с риском развития ССЗ, до настоящего времени не изучался.

Цель настоящего исследования состояла в изучении роли полиморфизма гена аполипопротеина Е в развитии сердечно-сосудистых заболеваний у населения Республики Карелия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали образцы крови 138 доноров без клинических проявлений ССЗ (контрольная группа) и 110 образцов крови больных, перенесших ОИМ и страдающих АГ. Диагнозы ИБС и ОИМ устанавливали в соответствии с МКБ-10 и с учетом клинических рекомендаций ВНОК (2008), диагноз АГ – в соответствии с третьим пересмотром клинических рекомендаций ВНОК (2008). Средний возраст обследованных в контрольной группе и пациентов с ССЗ составил 36,7 и 61,0 года соответственно.

ДНК выделяли из крови на колонках для выделения ДНК «Axyprep» (Axygen) согласно инструкции к набору. Качество и количество выделенной ДНК оценивали спектрофотометрически (SmartSpec Plus, Bio-Rad).

Исследование распределения аллелей гена apoE проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Для амплификации гена apoE использовали следующую пару праймеров: прямой 5’-acagaattcgccccggcctg-gtacac-3’, обратный 5’-taagcttggcacggctgtccaagga-3’ [8]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе iCycler iQ5 (BioRad). Реакционная смесь для ПЦР объемом 30 мкл содержала: 50 нг ДНК исследуемых образцов, 100 пМ обратного и прямого праймеров, 1 ед. Taq полимеразы (Силекс), 0,2 мМ dNTP, 2,5 мкл 10хбуфера для Taq полимеразы, 3 % DMSO согласно инструкции к набору для ПЦР (Силекс). Условия ПЦР: денатурация – 2 мин при 94 °С, отжиг – 1 мин при 60 °С, элонгация – 1 мин при 72 °С; количество циклов – 35; достраивание фрагментов – 10 мин при 72 °С. ПЦР-фрагменты в течение 15 ч при 37 °С обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HhaI (5 е. а.) (Fermentas) согласно инструкции к набору.

ПЦР-продукты разделяли в 8 % полиакриламидном геле (ПААГ), используя трис-боратный буфер. ПЦР-продукты окрашивали бромистым этидием, визуализировали в проходящем УФ-свете и анализировали с помощью программы Kodak 1D. Аллели и генотипы определяли в соответствии с J. E. Hixson и D. T. Vernier [8]. Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета программ MS Excel 2005. Достоверность различий частот в группах оценивали по критерию χ2, критерию Фишера с фи-преобразованием [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате ПДРФ-анализа были получены, согласно J. E. Hixson и D. T. Vernier [8], следующие аллельные варианты гена apoE : e2 (Cys112, Cys158), e3 (Cys112, Arg158), e4 (Arg112, Arg158) и генотипы: три гомозиготных (e2/e2, e3/e3, e4/ e4) и три гетерозиготных (e2/e3, e2/e4, e3/e4).

Обнаружено, что самый распространенный аллель в исследуемой выборке - аллель e3, а самый распространенный генотип - e3/e3 (табл. 1). Необходимо отметить, что встречаемость этого аллеля и генотипа у жителей Карелии такая же, как и в большинстве популяций мира [11]. Частоты других аллелей и генотипов гена apoE у здоровых жителей Карелии близки к частотам, характерным для населения стран Центральной и Восточной Европы, некоторых регионов России, например для русского населения Костромской области и бурятов [1], [4]. Генотип e4/e4 в исследуемой выборке встречался только у одного индивида, перенесшего ОИМ.

Таблица 1

Частоты аллелей и генотипов гена apoE среди обследованных доноров

Аллели и генотипы	Здоровые (n = 138)	Больные ССЗ (n = 110)
e2	0,09	0,11
e3	0,76	0,67
e4	0,14	0,22
Критерий χ2		3,16 (p > 0,05)
e2/e2	0,04	0,05
e2/e3	0,08	0,07
e2/e4	0,03	0,05
e3/e3	0,59	0,44
e3/e4	0,26	0,49
Критерий χ2		7,22 (p > 0,05)

В группе пациентов с сердечно-сосудистыми патологиями обнаружено 55 % носителей аллеля е4, тогда как лиц, у которых этот аллель отсутствовал, – лишь 38 %. В контрольной группе, напротив, количество людей, в генотипе которых не было аллеля е4, преобладало над числом его носителей. Причем отличие в распределениях было достоверно по критерию χ2 (р < 0,05) (табл. 2). Наличие в генотипе аллеля e4 почти в 1,5 раза повышает риск развития ССЗ у жителей Карелии (относительный риск RR = 1,45).

Таблица 2

Соотношение здоровых и больных ССЗ жителей Кар елии в зависимости от наличия аллеля e4 гена apoE

	Отсутствие аллеля e4	Наличие аллеля e4
Здоровые	0,62 (n = 98)	0,45 (n = 40)
Больные ССЗ	0,38 (n = 61)	0,55 (n = 49)
Критерий χ2		6,7 (p < 0,05)
Критерий Фишера (F)	15 (p < 0,05)	2,4 (p > 0,05)

Из данных табл. 1 следует, что частота аллеля e4 и генотипа e3/e4 выше в группе людей, страдающих CC3. Среди пациентов, которым поставлен диагноз АГ и ОИМ, носителей аллеля e4 и генотипа e3/e4 также больше, чем в контрольной группе (табл. 3).

Таблица 3

Частоты аллелей и генотипов гена apoE среди здоровых доноров и больных АГ и И Б С

Аллели и генотипы	Здоровые (n = 138)	Больные АГ (n = 62)	Больные ОИМ (n = 31)
e2	0,09	0,11	0,16
e3	0,76	0,69	0,61
e4	0,14	0,19	0,23
Критерий х2		1,15 (p > 0,05)	3,3 (p > 0,05)
e2/e2	0,04	0,05	0,06
e2/e3	0,08	0,08	0,13
e2/e4	0,03	0,05	0,06
e3/e3	0,59	0,48	0,35
e3/e4	0,26	0,34	0,39
Критерий х2		2,4 (p > 0,05)	6,1 (p > 0,05)

Зависимость частоты ССЗ от наличия в генотипе обследованных тех или иных аллелей гена apoE обусловлена уровнем холестерина и липопротеинов низкой плотности. Изоформы белка ApoE, соответствующие аллелям гена, имеют разную эффективность связывания с рецептором ЛПНП. Белок ApoE как лиганд ЛПНП-рецептора участвует в превращении липопротеинов промежуточной плотности (ЛППП) в ЛПНП [3].

Выведение ремнантных частиц, содержащих ApoE e2, происходит очень медленно из-за неэффективного связывания этой изоформы белка с соответствующими рецепторами, при этом превращение ЛППП в ЛПНП нарушено. Снижение вследствие этого доставки холестерина в печень приводит к увеличению синтеза ЛПНП-рецеп-торов и, соответственно, к уменьшению концентрации ЛПНП в плазме. Выведение частиц, несущих ApoE e4, напротив, идет быстрее, чем выведение нормальных частиц, что замедляет синтез ЛПНП-рецепторов и увеличивает уровень холестерина ЛПНП плазмы.

Следует отметить, что хотя аллелю e2 приписывают протективное значение, у людей, гомозиготных по этому аллелю, может развиться ги-перлипопротеинемия III типа.

Анализ распределения аллелей гена аполипопротеина Е в зависимости от пола показал отсутствие статистически значимых различий в частотах аллелей у мужчин в контрольной группе и у больных ССЗ. Однако из результатов табл. 4 следует, что в группе мужчин, страдающих кардиоваскулярными расстройствами, частота аллеля e2 была больше, чем у здоровых. Эти данные несколько противоречат общепри- знанному представлению о протективной роли аллеля e2. Однако их можно объяснить и наличием других независимых факторов возникновения ССЗ у мужчин, например зависимостью от табака. Так, в исследованиях, проведенных на мужчинах корейской национальности, имеющих пристрастие к курению, показано, что несмотря на низкие показатели общего холестерина в плазме крови, в этой группе лиц была высокая частота ИБС и других кардиоваскулярных расстройств [9]. Интересно, что курение также может модифицировать влияние полиморфных вариантов гена apoE на уровень триглициридов [13]. Так, в плазме крови курящих мужчин независимо от наличия в генотипе аллелей гена apoE наблюдали более низкие значения триглицири-дов по сравнению с некурящими людьми.

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов гена apoE среди здоровых и больных CCЗ доноров в зависимости от пола

	Аллели и генотипы
	e2	e3	e4	e2/e2	e2/e3	e2/e4	e3/e3	e3/e4
Мужчины здоровые (n = 44)	0,11	0,76	0,13	0,07	0,07	0,02	0,61	0,23
Мужчины больные (n = 35)	0,16	0,63	0,21	0,06	0,11	0,09	0,40	0,34
Женщины здоровые (n = 87)	0,08	0,78	0,14	0,02	0,08	0,03	0,62	0,24
Женщины больные (n = 57)	0,09	0,71	0,20	0,04	0,07	0,04	0,49	0,37

Среди женщин, в генотипе которых отсутствовал аллель e4, количество больных было достоверно меньше (табл. 5). Эти данные, на наш взгляд, могут свидетельствовать о возможной протективной роли аллелей e2, e3. Следовательно, можно говорить о влиянии различных генотипов и аллелей гена apoE на развитие ССЗ у женщин. Этот вывод может быть косвенно подтвержден данными литературы о существенном влиянии аллелей гена apoE на уровень липопротеинов высокой плотности и триглициридов у женщин, но не у мужчин [13]. Наличие в генотипе аллеля е4 может способствовать развитию ги-перлипопротеинемии и атеросклероза, причем в большей степени у женщин, чем у мужчин [7].

Таблица 5

Соотношение здоровых и больных ССЗ женщин в зависимости от наличия аллеля e4 гена apoE

Женщины	Отсутствие аллеля e4	Наличие аллеля e4
Здоровые	0,65 (n = 63)	0,49 (n = 24)
Больные ССЗ	0,35 (n = 34)	0,51 (n = 23)
Критерий х2		3,4 (p > 0,05)
Критерий Фишера (F)	8,2 (p < 0,05)	0

Таким образом, результаты исследования показали, что у жителей Карелии, в генотипе которых имеется аллель e4, повышен риск развития кардиоваскулярных расстройств. Влияние этого аллеля на развитие ССЗ особенно выражено у женщин.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Фундаментальные науки ‒ медицине» и Гранта Президента РФ «Ведущие научные школы РАН» НШ-3731.2010.4.