Роль системы иммунитета в противоопухолевой активности модификаторов биологических реакций различной природы

Н.В. Чердынцева, Н.В. Литвяков, О.В. Кокорев, А.А. Кузнецова, Е.А. Малиновская,Е.С. Смольянинов, В.А. Евтушенко

Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является использование биоте-рапевтических воздействий в сочетании с классическими методами (химио-, лучевая терапия, операционное вмешательство). Преимущество такого комплексного подхода заключается в одновременном повреждающем воздействии на опухолевые клетки и активизации защитных механизмов организма, оказывающих, в свою очередь, противоопухолевый эффект [2, 8]. В качестве наиболее перспективных биотерапевтических воздействий рассматриваются модификаторы биологических реакций (МБР) – агенты различной природы, проявляющие свой противоопухолевый эффект путем модуляции ответа организма на опухоль. В число МБР входят природные и синтетические иммуномодуляторы и адаптогены, цитокины и их индукторы, цитостатические препараты, а также физические факторы. Современные представления о механизмах канцерогенеза, взаимоотношениях опухоли и организма, о роли системы иммунитета в противоопухолевой защите, которая осуществляется в тесном взаимодействии с факторами неиммунной природы, а также данные последних лет о механизмах действия МБР различной природы позволяют утверждать, что иммунологические факторы принимают активное участие в реализации их модулирующего действия. В этой связи одним из основных направлений биотерапии является применение агентов, модулирующих активность противоопухолевого иммунитета. Целью настоящей работы было изучение противоопухолевого действия модифика- торов биологических реакций различной природы и его механизмов.

Материалы и методы

Экспериментальные модели. В работе использованы половозрелые мыши массой 18–20 г, разводки питомника Сибирского отделения Научноисследовательской лаборатории экспериментально-биологических моделей Томского научного центра РАМН (Томск) следующих линий: C57Bl/6 (H–2b), F1 (CBA/C57Bl/6) (H–2b/k), DBA/2j (H–2d). Карцинома легких Льюис (LLC), полученная в лаборатории опухолевых штаммов Онкологического научного центра РАМН (Москва), пассировалась методом подкожных трансплантаций на мышах C57Bl/6, опытным мышам перевивалась в область бедра п/к в концентрации 1 x 10 6 кл/мышь.

Терапевтические агенты. Циклофосфан (ЦФ) вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг на 3-и и 7-е сут после трансплантации опухоли. 5-фторурацил (5-ФУ) вводили внутримышечно в дозе 25 мг/ кг через день 3 раза, начиная с 7-х сут после перевивки опухоли.

Субалин – препарат на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих человеческий альфа-интерферон (любезно предоставлен его авторами из НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Бердск) – вводили перорально по 5х108 микробных клеток (2 дозы) в 0,5 мл воды ежедневно в течение 10–14 сут.

Препарат саназол (АК-2123)-N-(2-метокси-этил)-2-(3нитро-1триазолил) ацетоамид – гипоксический радиосенсибилизатор из класса нитро- триазолов, синтезированный в Киотском университете (Япония), обладающий низкой токсичностью. В экспериментальных исследованиях на мышах саназол использовали в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно в течение 7–12 дней.

Низкоэнергетическое лазерное излучение генерировалось лазерной установкой на парах меди "Малахит" с частотой импульсов 15–22 кГц. В составе лазерного луча присутствуют две спектральные линии – зеленая (510,6 нм) и желтая (578,2 нм). Лазерное облучение в дозе 30 Дж/см2 на область опухоли (длительность экспозиции 1 мин) проводили ежедневно в течение 5 дней.

Методы оценки терапевтической эффективности . Оценку противоопухолевой и антимета-статической активности исследуемых агентов проводили в соответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами [6]. Определяли торможение роста опухоли (%), индекс ингибиции метастазирования (ИИМ,%) и процент торможения роста метастазов (ТРМ), характеризующий уменьшение суммарной площади метастатических колоний в легких.

Методы оценки функциональной активности клеток иммунной системы. Активность макрофагов оценивали по их антипролиферативному действию на клетки-мишени мастоцитомы Р-815 (пассировалась в асцитной форме на мышах DBA) и LLC (пассировалась в асцитной форме на мышах C57Bl/6) в цитостатическом тесте, а также по цитолитическому действию на клетки-мишени LLC. Подсчитывали цитостатический индекс (ИЦС, %) и цитотоксический индекс (ИЦТ, %) [1]. Естественную киллерную активность лимфоцитов крови оценивали в мембранотоксическом тесте по отношению к клеткам-мишеням человеческого эритромиелолейкоза К-562 [7]. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансформации по включению ³Н-тимидина в ДНК клеток при добавлении в культуральную среду Т-клеточного митогена ФГА в оптимальной концентрации 10 мкг/мл (“Serva”, Германия) и без него (спонтанная пролиферация).

Результаты обработаны статистически, достоверность различий между выборками определяли с помощью непараметрического критерия Вил-коксона–Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Мы показали, что интраперитонеальное введение ультранизких доз саназола сочетанно с цитостатической терапией циклофосфаном в дозе 60

мг/кг привело к двукратному усилению ингибиции роста первичной опухоли и практически полной отмене метастазирования у мышей с LLC (табл. 1). Существенное увеличение торможения роста опухоли и ингибиции метастазирования при сочетанной терапии циклофосфаном и субалином свидетельствует о потенцирующем действии пробиотика на антибластомную активность цикло-фосфана. Как и в случае применения саназола, более выраженный ингибирующий эффект суб-алина и его сочетания с цитостатиком отмечен в отношении метастазов, но не первичного опухолевого узла. Умеренная противоопухолевая и антиметастатическая активность саназола и суб-алина выявлена также на модели меланомы В-16 у мышей C57Bl/6 (данные не представлены). Несмотря на низкий индекс ингибиции метастазирования при использовании субалина в моноварианте, обращает на себя внимание значительное торможение роста метастатических колоний (уменьшение их суммарной площади) в легких при применении субалина не только в сочетании с цитостатической терапией, но и в самостоятельном варианте (табл.1).

Терапия карциномы легких Льюис 5-ФУ в комбинации с излучением лазера на парах меди привела к достоверному усилению противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Лазерное излучение также ингибировало рост и метастазирование опухоли, при этом антиметаста-тическое действие было более выражено, чем влияние на первичный опухолевый узел (табл.1).

Таблица 1

Влияние цитостатиков в комбинации с модификаторами биологических реакций на рост и метастазирование карциномы легких Льюис у мышей C57Bl/6

Группа	Доза	ТРО, %	ИИМ, %	ТРМ, %
Контроль	–	–	–	`
ЦФ	60 мг/кг	40	70	80,5
ЦФ+саназол	60+1,0 мг/кг	66 *	100 *	н/о
ЦФ+субалин	60+2,0 дозы	79*	98,8*	98,5*
5-ФУ	25 мг/кг	63	40	н/о
5-ФУ+НЛИ	25мг/кг+30Дж/см2	80*	77*	н/о
Саназол	1,0 мг/кг	0	72	н/о
Субалин	2 дозы	37**	5	41**
НЛИ	30Дж/см2	37**	51**	н/о

Примечание. ЦФ – циклофосфан; 5-ФУ – 5-фторурацил; ТРО – торможение роста опухоли; ИИМ – индекс ингибиции метастазирования; ТРМ – торможение роста метастазов; в каждой группе от 8 до 10 животных; н/о – не определяли; * – различия достоверны по сравнению с группой ЦФ или 5-ФУ; ** – различия достоверны по сравнению с контрольной группой.

В связи с отмеченным существенным антиме-тастатическим эффектом саназола, субалина и излучения лазера на парах меди представляется очевидным предположение о важной роли в его реализации эффекторных клеток иммунной системы – прежде всего ЕКК, макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, поскольку известно, что эти клетки наиболее эффективно реализуют свое противоопухолевое действие в отношении небольшого числа опухолевых клеток, что имеет место при формировании метастатических колоний [12].

При оценке естественной киллерной активности спленоцитов выявлено достоверное ее усиление у мышей, получавших циклофосфан в сочетании с саназолом, общая литическая активность селезенки также возрастала, наряду со способностью спленоцитов оказывать цитостатическое действие на опухолевые клетки-мишени (табл.2).

Таблица 2

Естественная киллерная активность и цитостатическая активность спленоцитов у мышей линии С57Вl/6 с карциномой легких Льюис, леченных циклофосфаном и саназолом (X ± m)

	Группа животных
	LLC (1)	LLC+ЦФ (2)	LLC+ЦФ+ саназол (3)
Количество спленоци-тов, млн	147,0 ± 21,0	121,0 ± 14,0*	141,0 ± 11,0
ИМТ,%	62	60*	70
ЕКА спле-ноцитов в пересчете на селезенку, ЛЕ	1500 ± 83	1215 ± 146*	1786 ± 194
Индекс цитостази-са сплено-цитов, %	62,8 ± 6,4*	81,4 ± 2,1 *	91,2 ± 1,9

Примечание. ЕКА – естественная киллерная активность; ИМТ – индекс мембранотоксичности; ЛЕ – литические единицы; * – различия достоверны по сравнению с группой 3 (в каждой группе по 6–8 животных).

Эти результаты согласуются с опубликованными нами ранее данными о способности саназола модулировать противоопухолевую активность макрофагов и лимфоцитов у мышей C57Bl/6 с меланомой В-16, причем отмечалась положительная корреляция между активностью эффекторных клеток и ингибирующим действием препарата на рост и метастазирование опухоли при разных схемах его введения [15]. Саназол проявляет иммуномодулирующее действие и при введении безопухолевым мышам [14].

При сочетанной терапии мышей с LLC цик-лофосфаном и субалином мы отметили существенное уменьшение ростстимулирующей активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с их высокой фидерной активностью у мышей, леченных циклофосфаном. Введение субалина мышам с карциномой легких Льюис, не подвергавшимся дополнительным терапевтическим воздействиям, приводило к значительному увеличению мембранотоксической активности ЕКК и тотальной литической активности селезенки, а также существенно усиливало цитотоксическое и антипролиферативное действие макрофагов на клетки LLC (рис. 1). Обратимый ингибитор функциональной активности макрофагов каррагенан при введении in vivo уменьшал или отменял их активацию под влиянием субалина. Введение каррагенана мышам с LLC, леченным субалином, существенно снижало ан-тиметастатическую активность последнего: отмечено повышение интенсивности метастазирования и более чем двукратное увеличение суммарной площади легочных метастазов по сравнению с мышами, получавшими только субалин [5]. Эти данные свидетельствуют о том, что макрофаги являются одной из первоочередных мишеней действия субалина. При использовании "бести-мусных" мышей nude также показана необходимость полноценного Т-клеточного звена для реализации его антибластомного эффекта [11].

Возрастание литического потенциала селезенки под влиянием субалина и саназола связано с повышением функциональной активности ЕК клеток, увеличением скорости созревания предшественников и ускорением рециклинга (скорости их восстановления). Основным фактором, регулирующим эти процессы, является интерферон, стимулирующее влияние на продукцию которого в организме оказывают оба препарата [12]. Определенное значение в повышении литического потенциала селезенки имеют миграционнопролиферативные процессы, так как отмечено увеличение ее клеточности субалином и саназо-лом. Согласно представленным выше данным и результатам исследований, проведенных ранее, триггерным фактором иммуномодулирующей активности субалина является продуцируемый им в кишечнике альфа-интерферон, ключевая роль которого в активации неспецифических факторов иммунитета и специфической реакции на антиген на местном уровне (в слизистой кишечника, в частности) и системно (кровь, селезенка) экспериментально доказана [17].

Рис. 1. Влияние субалина на активность ЕК клеток селезенки и перитонеальных макрофагов у мышей F1(CBAxC57Bl/6) с карциномой легких Льюис:

ИМТ – индекс мембранотоксичности спленоцитов по отношению к клеткам К-562; ЛЕ – литическая активность селезенки, литические единицы; ИЦТ LLC – индекс цитотоксичности перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС LLC – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис; ИЦС Р-815 – индекс цитостазиса перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам мастоцитомы Р-815; клетки – количество спленоцитов. По оси ординат – прирост (%) по сравнению с контролем (мыши – опухоленосители, не получавшие субалин)

Повышение противоопухолевого эффекта цитостатика при включении в схему лечения излучения лазера на парах меди сочетается с восстановлением либо усилением функциональной активности эффекторных клеток иммунной системы, это справедливо в отношении как неспецифических эффекторных механизмов (ЕКК, цитостатические лимфоциты), так и процессов, лежащих в основе формирования специфического иммунного ответа (активация пролиферативного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены) (рис. 2). При исследовании противоопухолевой активности НЛИ было выявлено, что излучение лазера на парах меди при достаточно высокой мощности дозы (30 Дж/см2) индуцирует некробиотиче-ские и дистрофические процессы в ткани опухоли на фоне своеобразной воспалительной реакции, по-видимому опосредующей его противоопухолевое действие. Кроме этого, модулирующее действие НЛИ на иммунологические факторы может быть реализовано путем регуляции активности компонентов антиоксидантной системы. В частности, отмеченное нами повышение активности су- пероксиддисмутазы в крови, с одной стороны, способствует восстановлению иммунокомпетентности; ее снижение в опухоли, с другой стороны, приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к эндогенным и экзогенным свободнорадикальным повреждающим воздействиям [10]. В реализацию противоопухолевого действия НЛИ могут вносить вклад различные механизмы, связанные как с прямым повреждением опухолевых клеток (термический, фотодинамический эффекты), так и с активацией эндогенных факторов, приводящих к стимуляции важнейших гомеостатических систем организма, обеспечивающих интегральный терапевтический эффект [4].

Общепринятая в настоящее время точка зрения о триггерном механизме действия НЛИ, независимо от длины волны и, соответственно, первичной точки приложения (первичного фотоакцептора), вызывающем системный ответ на уровне целостного организма, дает основания считать очевидным вовлечение иммунологических механизмов в реализацию его противоопухолевой активности. Известно, что клетки иммунной систе- о

*

Рис. 2. Изменение пролиферативного ответа спленоцитов на ФГА и ЛПС у мышей с карциномой легких Льюис, леченных 5-фторурацилом и излучением лазера на парах меди:

•    – различия достоверны по сравнению с группой 5-ФУ; о – различия достоверны по сравнению с контрольной группой

мы являются одной из непосредственных точек приложения действия НЛИ, которое способно изменять экспрессию их мембранных рецепторов, функциональную активность, пролиферативный потенциал, стимулировать продукцию цитокинов, а также действовать через модуляцию компонентов антиоксидантной системы организма [3].

Установлено, что модификация активности естественных киллеров различными агентами может быть одним из механизмов их антимета-статического действия [14]. Цитостатическая активность иммунокомпетентных клеток также может выступать важным фактором, воздействующим на процесс метастазирования, что подтверждается экспериментальными результатами ряда авторов как в отношении макрофагов, так и спле-ноцитов [18]. Полученные нами данные указывают на то, что модуляция активности спленоцитов и макрофагов под действием использованных МБР может играть важную роль в усилении терапевтической эффективности цитостатиков.

Важное значение в реализации модулирующего действия МБР имеет многокомпонентность ответной реакции и тесное взаимодействие иммунной системы с факторами неиммунной природы. В совокупности это обеспечивает, с одной стороны, изменения опухолевых клеток, приводящие к реверсии трансформированного фенотипа, индукции их дифференцировки и созрева- ния, снижению метастатического потенциала, устранению резистентности к цитостатическим воздействиям; с другой – усиление или восстановление эффекторных противоопухолевых реакций хозяина и селективную супрессию или устранение компонентов, способствующих опухолевому росту.