Роль toll-подобных рецепторов в развитии осложнений после кардиохирургического лечения врожденных пороков сердца у детей

А.В. Цепокина, А.А. Аникеенко, С.А. Шмулевич, А.В. Понасенко, А.В. Шабалдин,

Врожденные пороки сердца (ВПС) у новорожденных детей составляют 1 % и вносят существенный вклад в перинатальную и младенческую смертность [1]. Современные методы пренатальной диагностики и хирургическое лечение ВПС с первых дней жизни значительно увеличили выживаемость таких пациентов. Однако кардиохирургическое вмешательство в условиях искусственного кровообращения при ВПС может сопровождаться осложнениями в раннем послеоперационном периоде [2], имеющими инфекционную или неинфекционную природу [3]. Проводится поиск потенциальных биомаркеров — предикторов таких осложнений [2].

Кардиохирургическое вмешательство в сочетании с гипотермией, ишемией, реперфузией вызывает воспаление через активацию врожденного иммунного ответа и характеризуется выработкой различных медиаторов [4]. Toll-подобные рецепторы (англ. toll-like receptors, TLR) являются сигнальными молекулами, через которые активируются некоторые функции врожденного иммунитета. Это группа трансмембранных белков, экспрессируемых на иммунных (макрофагах, дендритных и других) и иных (эпителиальных, эндотелиальных и так далее) типах клеток организма [5]. Лигандами для TLR являются молекулярные паттерны, обусловленные патогеном или опасностью. Таким образом, воспалительный ответ может инициироваться через эти рецепторы как на различные патогены, так и стресс-ассоциированные молекулы.

Всего идентифицировано 11 TLR, которые находятся на поверхности и внутри клетки [6]. Соответственно, по локализации они разделены на две группы: расположенные на цитоплазматической мембране (TLR1, TLR2, TLR4–6) и на мембранах внутриклеточных органелл (TLR3 и TLR7–9). Передача сигналов через TLR вызывает цепочку событий, которые включают экспрессию провоспалительных молекул (хемокинов и цитокинов), активацию системы комплемента, рекрутирование фагоцитарных и антигенпрезентирующих клеток в месте инвазии патогена или асептического повреждения тканей.

Гены TLR ассоциированы в том числе с хроническими заболеваниями сердца и сосудов: кардитами, атеросклерозом, сердечной дисфункцией при сепсисе, застойной сердечной недостаточностью [7]. Об отношении вклада этих генов и их продуктов в патогенез ВПС предполагают, что взаимодействие микрорибо-нуклеиновой кислоты Let-7 с TLR7 негативно влияет на клеточный цикл кардиальных прогениторных клеток [8]. Вероятно, активация этих сигнальных рецеп- торов у эмбриона материнскими стресс-ассоцииро-ванными молекулами или продуктами обмена может активировать пироптоз и апоптоз, что в конечном итоге приведет к дисбалансу пролиферации и дифференцировки при морфогенезе сердца и сосудов. Более того, хирургическое лечение ВПС, особенно у детей грудничкового периода, многократно увеличивает количество молекул, способных активировать врожденный иммунитет через TLR. Именно этот феномен может лежать в патогенезе осложнений после кардиохирургического лечения ВПС у детей с TLR-ассоциированной иммунной гиперчувствительностью.

Цель — изучить ассоциации генов TLR с инфекционными и неинфекционными осложнениями после кардиохирургического лечения врожденных пороков сердца.

Методы

В исследование включили 89 детей (44 девочки и 45 мальчиков) с ВПС, прошедших кардиохирургическое лечение в Научно-исследовательском институте комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний. Исследование одобрено локальным этическим комитетом учреждения (протокол № 20 от 24 ноября 2016 г.).

Сбор биологического материала

У всех участников собрали кровь из локтевой вены в пробирку с трикалием этилендиаминтетрауксусной кислоты (K3 ЭДТА) для последующего выделения геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты методом фенол-хлороформной экстракции. После поступления в лабораторию кровь немедленно, без предварительного центрифугирования аликвотировали по 0,7 мл в пластиковые стерильные микропробирки «Эппендорф» с маркировкой DNase-free объемом 1,5 мл Axygen (Corning, Корнинг, США) с плотно закрывающимися крышками. Все образцы биологического материала маркировали и хранили при -80 °С до даты проведения исследования.

Генотипирование

Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) с использованием зондов TaqMan (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США). Для исследования отобрали полиморфные варианты TLR1 (rs5743611, rs5743551), TLR2 (rs5743708, rs3804099), TLR4

Табл. 1. Характеристика полиморфных сайтов изучаемых генов

Ген	Тип однонуклеотидного полиморфизма	Идентификатор однонуклеотидного полиморфизма	Аминокислотная замена	Локализация на хромосоме GRCh38.p12*	Нуклеотидная замена
TLR1	Missense Variant	rs5743611	Missense mutation Arg80Thr	chr4:38798593	C/G
TLR1	5 Prime UTR Variant	rs5743551	–	chr4:38806033	T/A, C, G
TLR2	Missense Variant	rs5743708	Missense mutation Arg753Gln	chr4:153705165	G/A
TLR2	Synonymous Variant	rs3804099	Synonymous Variant Asn199=	chr4:153703504	T/C
TLR4	Missense Variant	rs4986791	Missense mutation Thr399Ile	chr9:117713324	C/T
TLR4	Missense Variant	rs4986790	Missense mutation Asp299Gly	chr9:117713024	A/G, T
TLR6	Missense Variant	rs3775073	Missense mutation Lys421Asn	chr4:38828211	T/C, G
TLR6	Missense Variant	rs5743810	Missense mutation Ser249Ala	chr4:38828729	A/C, G, T

(rs4986791, rs4986790), TLR6 (rs3775073, rs5743810). Использовали базы данных dbSNP, SNPinfo, SNPnexus. Установили, что из 8 изучаемых идентификаторов однонуклеотидного полиморфизма (англ. singlenucleotide polymorphism, SNP) 6 приводят к аминокислотной замене (миссенс-мутации) (табл. 1).

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили в программе SNPstats. При анализе результатов генотипирования учитывали соблюдение закона Харди – Вайнберга, рассчитанное с помощью теста χ2. Для сравнения генотипов между изучаемыми группами использовали критерий Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность и точный критерий Фишера. Для расчета риска определяли отношение шансов и 95% доверительный интервал к нему. Анализ межгенных взаимодействий осуществляли методом сокращения многофакторной размерности (англ. Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) в программе MDR версии 3.0.2. Для выявления ассоциации факторов широкого анамнеза с инфекционными и неинфекционными осложнениями после радикальных хирургических операций при лечении ВПС использовали логистическую регрессию (статистический метод классификации с использованием линейного дискриминанта Фишера). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Детей с ВПС, перенесших операцию на сердце, разделили на основную группу с осложнениями в раннем послеоперационном периоде (n = 42) и группу сравнения без них (n = 47). В подгруппу с инфекционными осложнениями (фебрильной лихорадкой более 5 дней, пневмонией, бронхитом, плевритом, инфекционным кардитом, гидроперикардом, сепсисом) включили 31 пациента, в подгруппу с неинфекционными осложнениями (нарушением ритма и проводимости, судорожным синдромом, релаксацией купола диафрагмы, снижением фракции выброса) — 11. Для сопоставимости результатов эти подгруппы объединили в основную группу (табл. 2). По половому распределению сравниваемые группы сопоставимы. Все ВПС несиндромальные и спорадические без семейной истории. Значимых различий по частоте встречаемости ВПС не выявили.

Выполняли все вмешательства в условиях искусственного кровообращения. Оперировали 10 пациентов (11,2 %) на первом году жизни, 38 (42,7 %) — на втором, 33 (37,1 %) — в 2–5 лет, 8 (9,0 %) — до 7 лет.

По данным логистической регрессии, оценивающей вклад различных независимых переменных в деление по классам на наличие (1) или отсутствие (0) инфекционных и неинфекционных осложнений в послеоперационном периоде, выявили несколько значимых предикторов. В табл. 3 представлены статистически значимые бета-коэффициенты (относительное влияние фактора на зависимую переменную) и Б-коэффициенты (прогностическая значимость фактора как предиктора).

Выявили положительные ассоциации между инфекционными и неинфекционными ослож-

Табл. 2. Фенотипы врожденных пороков сердца в группе обследованных детей с учетом послеоперационных осложнений

Фенотип врожденного порока сердца Всего пациентов, n Без осложнений, n С осложнениями, n инфекционными неинфекционными Дефект межпредсердной перегородки 31 16 11 4 Дефект межжелудочковой перегородки 14 7 5 2 Тетрада Фалло 12 6 4 2 Единый желудочек сердца 6 3 2 1 Коарктация аорты 5 3 2 0 Дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородок 3 2 1 0 Дефекты отхождения магистральных сосудов 3 2 1 0 Стеноз аортального клапана 3 2 1 0 Атриовентрикулярная коммуникация 3 2 1 0 Коарктация аорты и дефект межжелудочковой перегородки 2 1 1 0 Тотальный аномальный дренаж легочных вен 2 1 1 0 Частичный аномальный дренаж легочных вен 1 1 0 0 Атрезия легочной артерии первого типа 1 1 0 0 Гипоплазия аорты 1 0 0 1 Гипоплазия трикуспидального клапана 1 0 1 0 Стеноз клапана легочной артерии и дефект межпредсердной перегородки 1 0 0 1 нениями и факторами широкого анамнеза, описывающими характер родов, неонатальных осложнений, видимых микроаномалий развития ребенка, состояние его здоровья, а также особенности вакцинопрофилактики. Коморбидность и отсутствие вакцинации не могли быть предик- торами осложнений, так как 11,2 % детей перенесли радикальные операции на сердце до года. Взаимосвязь этих переменных с инфекционными и неинфекционными осложнениями можно рассматривать с обратной позиции: кардиохирургическая операция на сердце ребенка с тяжелыми

Табл. 3. Множественный линейный регрессионный анализ независимых переменных широкого анамнеза с зависимой вариантой: наличие инфекционных и неинфекционных осложнений в послеоперационном периоде

Регрессия зависимой варианты «осложнения»	Бета-коэффициент	Стандартная ошибка бета-коэффициента	Б-коэф-фициент	Стандартная ошибка Б-коэффициента		p
Свободный член логистической модели	–	–	0,225	0,107	3,257	0,008
Коморбидность	0,449	0,099	0,750	0,165	4,536	0,000
Отсутствие вакцинации	0,254	0,098	0,670	0,259	2,589	0,012
Перинатальная пневмония	0,238	0,098	0,313	0,129	2,425	0,018
Родоразрешение путем кесарева сечения	0,186	0,099	0,198	0,105	2,183	0,043
Стигмы эмбриогенеза	0,378	0,107	0,996	0,282	3,533	0,001

Примечание. Представлены только значимые переменные.

TLR6 rs5743810

TLR2 rs5743708

TLR1 rs5743551

TLR2 rs3804099

TLR1 rs5743611

TLR4 rs4986791

TLR4 rs4986790

TLR6 rs3775073

Дендрограмма SNP × SNP взаимодействий генов TLR , ассоциированных с осложнениями в раннем послеоперационном периоде, у детей с врожденными пороками сердца

Примечание. Представлены данные о силе влияния полиморфизмов на развитие осложнений. Красная линия — выраженный синергизм, оранжевая — умеренный синергизм, коричневая — независимый эффект, зеленая — умеренный антагонизм.

последствиями является причиной отказа от вакцинации и предрасполагает к коморбидным состояниям в раннем онтогенезе.

Родоразрешение путем кесарева сечения, перинатальная пневмония и наличие более шести стигм эмбриогенеза являются предикторами инфекционных и неинфекционных осложнений в раннем послеоперационном периоде. Данные факторы могут влиять на эффективное формирование микробиома ребенка и иммунной компетентности, в том числе через регуляцию врожденного иммунитета. Они способствуют увеличению в микробиоме удельного веса представителей условно-патогенного кластера, который определяет развитие инфекционных осложнений после кардиохирургического лечения ВПС с применением искусственного кровообращения. Нарушенная иммунная регуляция вызывает неинфекционные осложнения.

Далее провели сравнительный анализ частоты встречаемости генотипов генов TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 во всех группах и подгруппах. Статистически значимых различий не обнаружили (табл. 4). Соответственно, единичные полиморфные варианты генов семейства TLR существенно не влияют на формирование осложнений после кардиохирургического лечения спорадических ВПС без хромосомных заболеваний.

С помощью программы MDR оценили SNP × SNP взаимодействие полиморфных вариантов генов TLR ( рисунок ). Оптимальным межгенным взаимодействием является двухлокусная модель TLR1 rs5743551 – TLR2 rs3804099, на долю которой пришлось 4,01 % фенотипической энтропии и характеристика которой представлена ниже.

Тренировочная сбалансированная точность0,63

Тестируемая сбалансированная точность0,45

Чувствительность0,70

Специфичность0,56

Повторяемость9/10

Точность модели0,60

Этот факт демонстрирует выраженный синергетический эффект полиморфных вариантов при развитии осложнений в раннем послеоперационном периоде у детей, перенесших кардиохирургическое лечение ВПС. Наибольшим предсказательным потенциалом обладал полиморфный вариант rs5743708 TLR2 (2,59 %).

Таким образом, не подтверждена гипотеза о роли отдельных полиморфных вариантов генов TLR в развитии послеоперационных осложнений у детей, перенесших кардиохирургическое вмешательство, но показано синергетическое влияние полиморфных вариантов генов TLR1 и TLR2 на формирование этой патологии.

Табл. 4. Частота распределения генотипов среди пациентов с осложнениями и без таковых

Ген	Генотип	Без осложнений, n (%)	С осложнениями, n (%)	Отношение шансов (95% доверительный интервал)	p
	C/C	26 (70,3)	22 (64,7)	1,00
	C/G	8 (21,6)	11 (32,4)	1,62 (0,56–4,75)	0,42
TLR1
rs5743611	G/G	3 (8,1)	1 (2,9)	0,39 (0,04–4,06)
	C	60 (81)	55 (81)	1,01 (0,43–2,34)	0,97
	G	14 (19)	13 (19)
	T/T	23 (62,2)	19 (55,9)	1,00
TLR1 rs5743551	C/T	12 (32,4)	12 (35,3)	1,21 (0,44–3,31)	0,80
	C/C	2 (5,4)	3 (8,8)	1,82 (0,27–12,01)
	T	58 (78)	50 (74)	1,30 (0,60–2,82)	0,49
	C	16 (22)	18 (26)
	G/G	35 (94,6)	31 (91,2)	1,00
TLR2 rs5743708	A/G	1 (2,7)	3 (8,8)	3,39 (0,33–34,27)	0,28
	A/A	1 (2,7)	0 (0)	0,00 (0,00–NA)
	G	71 (96)	65 (96)	1,09 (0,21–5,60)	0,91
	A	3 (4)	3 (4)
	T/T	15 (40,5)	16 (47,1)	1,00
TLR2 rs3804099	C/T	19 (51,4)	14 (41,2)	0,69 (0,26–1,85)	0,67
	C/C	3 (8,1)	4 (11,8)	1,25 (0,24–6,54)
	T	49 (66)	46 (68)	0,93 (0,46–1,88)	0,85
	C	25 (34)	22 (32)
	C/C	32 (86,5)	28 (82,3)	1,00	0,63
TLR4	C/T	5 (13,5)	6 (17,6)	1,37 (0,38–4,99)
rs4986791	C	69 (93)	62 (91)	1,33 (0,38–4,59)	0,64
	T	5 (7)	6 (9)
	A/A	32 (86,5)	28 (82,3)	1,00	0,63
TLR4	A/G	5 (13,5)	6 (17,6)	1,37 (0,38–4,99)
rs4986790	A	69 (93)	62 (91)	1,33 (0,38–4,59)	0,64
	G	5 (7)	6 (9)
	T/T	14 (37,8)	10 (29,4)	1,00
TLR6 rs3775073	T/C	18 (48,6)	20 (58,8)	1,56 (0,55–4,36)	0,68
	C/C	5 (13,5)	4 (11,8)	1,12 (0,24–5,25)
	T	49 (62)	40 (59)	1,22 (0,62–2,39)	0,55
	C	28 (38)	28 (41)
	G/G	15 (40,5)	12 (35,3)	1,00
	A/G	20 (54)	20 (58,8)	1,25 (0,47–3,33)	0,90
TLR6 rs5743810	A/A	2 (5,4)	2 (5,9)	1,25 (0,15–10,23)
	G	50 (68)	44 (65)	1,13 (0,56–2,27)	0,71
	A	24 (32)	24 (35)

Примечание. NA — нет данных.

Обсуждение

Требуются пояснения о роли генов TLR в предрасположенности к инфекционным и неинфекционным осложнениям после кардиохирургического лечения. Немногочисленные данные литературы свидетельствуют, что гены TLR влияют на развитие полиорганной недостаточности у пациентов, перенесших кардиохирургическое лечение. Так, М.В. Хуторная и соавт. отмечают, что аллель С гена TLR6 rs3775073 связан со сниженным риском полиорганной недостаточности после аортокоронарного шунтирования [9]. В то же время в настоящем исследовании данный полиморфный вариант не являлся предиктором осложнений после кардиохирургического лечения спорадического несиндромального врожденного порока сердца.

В 2020 г. M.B. Merbecks и соавт. продемонстрировали, что у детей, перенесших операцию на сердце, наблюдалось увеличение экспрессии TLR2 на моноцитах в первые и вторые сутки после вмешательства [10]. В настоящем исследовании именно ген TLR2 имел наибольший предсказательный потенциал в отношении риска послеоперационных осложнений. Полиморфный вариант этого гена rs3804099 совместно с полиморфным вариантом гена TLR1 rs5743551 оказывал синергетическое влияние на формирование инфекционных и неинфекционных осложнений после кардиохирургического лечения спорадических несиндро-мальных врожденных пороков сердца.

Полиморфный вариант rs3804099 гена TLR2 является синонимической однонуклеотидной заменой, сохраняющей смысл кодона без смены аминокислоты в кодируемой белковой молекуле [Reference SNP (rs) Report: rs3804099. Режим доступа: snp/rs3804099]. В то же время этот полиморфный вариант имеет большое количество ассоциаций с хроническими инфекционными заболеваниями: туберкулезом, инфекциями, вызванными Helicobacter pylori, гепатитами В, С, бактериальным менингитом, сепсисом, в том числе неонатальным [11; 12]. Кроме того, его минорный аллель C ассоциирован с устойчивостью к формированию рака желудка у пациентов с Helicobacter pylori [12]. Метаанализ, посвященный роли генов TLR в детерминировании рака различной локализации, показал, что именно полиморфный вариант rs3804099 гена TLR2 снижает риск онкологических заболеваний [13].

Рецепторы TLR участвуют не только в активации врожденного иммунитета, но и в регуляции обменных процессов, в частности липидного и углеводного обменов. Гомозиготный мажорный генотип TT rs3804099 гена TLR2 ассоциирован с повышением холестерина в крови обследованных мужчин репродуктивного возраста [14].

Таким образом, полиморфный вариант rs3804099 гена TLR2 позитивно и негативно влияет на развитие инфекционных, онкологических, обменных нарушений и ассоциирован с эффективностью антицитокиновой терапии инфликсимабом при болезни Крона [15]. Механизм реализации этих эффектов не совсем ясен, так как замена нуклеотида не приводит к аминокислотной замене в кодируемой молекуле, но вполне вероятно, что данный полиморфный вариант гена определяет особенности его транскрипции. Синергетическое влияние rs3804099 гена TLR2 на развитие инфекционных и неинфекционных осложнений после кардиохирургического лечения ВПС, выявленное в настоящем исследовании, может быть следствием особенностей экспрессии молекулы TLR2 и последующей индукции провоспали-тельных и противовоспалительных реакций под воздействием триггерных факторов операции на сердце в условиях искусственного кровообращения.

Также синергетический эффект для формирования инфекционных и неинфекционных осложнений после кардиохирургического лечения ВПС дал полиморфный вариант rs5743551 гена TLR1 , расположенный в 5'-нетранслируемой области (англ. five prime untranslated region), которая находится перед кодирующей частью гена и способствует активации экспрессии (транскрипции для дезоксирибонуклеиновой кислоты и трансляции для рибонуклеиновой) этого гена. Соответственно, по аналогии с rs3804099 гена TLR2 , данный полиморфный вариант будет детерминировать особенности экспрессии TLR1 на клетках. Метаанализ, посвященный изучению генов TLR и их связи с атеросклерозом, показал, что полиморфный вариант rs5743551 TLR1 может служить генетическим биомаркером атеросклеротических заболеваний [16]. Исследование полиморфных вариантов генов TLR1, TLR2 и TLR4 с продукцией цитокинов при лепре показало синергетический эффект rs3804099 TLR2 и rs5743551 TLR1 на продукцию интерлейкина-17 и синергетический эффект полиморфизмов TLR1 (rs4833095, rs5743551) на продукцию Monocyte Chemoattractant Protein-1 и активного компонента интерлейкина-12 (IL-12p40). Авторы считают, что через этот повышенный синтез цитокинов, детерминированных полиморфизмами rs4833095, rs5743551 TLR1 и rs3804099 TLR2 , поддерживается воспалительный процесс при лепре [17].

Вероятно, детерминирование инфекционных и неинфекционных осложнений после кардиохирургического лечения ВПС через полиморфизмы rs5743551 TLR1 и rs3804099 TLR2 также связано с опосредованным влиянием на синтез провоспа-лительных цитокинов и хемокинов. Этот механизм вполне понятен, так как основной эффект сигналинга через TLR направлен на синтез интерлейкинов.

Заключение

Таким образом, послеоперационные осложнения при кардиохирургическом лечении ВПС обусловлены синергетическим влиянием полиморфных вариантов rs5743551 и rs3804099 генов TLR1 , TLR2 соответственно. Реализация этого эффекта может быть связана с особенностями транскрипции генов TLR1 и TLR2 , последующей экспрессии рецепторов на клетках и сиг-налинга на активацию синтеза провоспалительных цитокинов и хемокинов.