Роль трансформирующего ростового фактора TGF-1 в патогенезе рака молочной железы

В последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс как в идентификации генов, нарушения функции которых ведут к развитию рака молочной железы, так и в выяснении роли кодируемых ими белковых продуктов. Выяснилось, что гены, вовлеченные в регуляцию процессов клеточного цикла, дифференцировки, морфогенетических реакций и апоптоза, могут быть объединены в несколько сигнальных каскадов, изменения в которых, в конечном итоге, приводят к возникновению злокачественных новообразований. К числу таких относится фактор роста семейства TGF-β1 (трансформирующий фактор роста β1), который является полифункциональным цитокином с разнонаправленными эффектами фактически на все типы клеток и играет ключевую роль в процессах эмбрио- и канцерогенеза.

Строение и сигнальные пути TGF-β

Семейство TGF-β включает группу гомологичных гетеродимерных белков TGFβ-1, -2, -3, -4. Основной изоформой, секретируемой клетками иммунной системы, является TGF-β1. Белки семейства TGF-β синтезируются в виде препро-пептида, из которого в результате процессинга отщепляется сигнальный пептид и продомен с образованием зрелого белка. Пропептид, или LAP (latency associated peptide), остается связанным со зрелой молекулой нековалентными взаимодействиями. Благодаря этому зрелая молекула белка представляет собой биологически неактивную, латентную форму, в виде которой TGF-β хранится в экстрацеллюлярном матриксе. Активация TGF-β происходит путем отщепления пропептида LAP с участием таких факторов, как протеазы, интегрины, изменения рН, активные формы кислорода [28]. Зрелые белки TGF-β состоят из 112 а.о. и содержат от шести до девяти остатков цистеина, которые образуют как внутри-, так и межмолекулярные дисульфидные связи.

Выделяют три основных типа рецепторов TGF-β – рецепторы I, II и III типа. Рецепторы I и II типа являются мембранными гликопротеинами с молекулярной массой 55 и 70 кД. Благодаря своей димерной структуре TGF-β способен одновременно взаимодействовать с обоими I и II типами специфических рецепторов, тогда как рецептор III типа стерически способствует этому процессу. Связывание гетеро- или гомодимеров лиганда с внеклеточным доменом рецептора II типа приводит к взаимодействию его с рецепто ром I типа и фосфорилированию SG-субдомена (содержащего SGSGSG последовательность) его внутриклеточного домена. Рецептор I типа обладает серин/треонинкиназной активностью и фосфорилирует ряд Smad (Sma and Mad related proteins) белков. В настоящее время известно несколько различных Smad белков, которые подразделяются на три типа: активируемые рецептором R-Smad (Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 и Smad8), которые образуют комплексы с так называемым общим Smad белком (Smad4) и проникают внутрь ядра, а также ингибиторные I-Smad (Smad6 и Smad7). Классический сигнальный каскад включает фосфорилирование рецептором I типа и активирование Smad2 и Smad3, их гетеромеризацию с участием Smad4 и проникновение гетеромерного комплекса внутрь ядра, где они выполняют функцию факторов транскрипции [53]. В эпителиальных клетках, в том числе и молочной железы, передача сигнала может осуществляться путем активации Smad1 и Smad5 с последующей ассоциацией с Smad4 и ядерной транслокацией. Все R-Smad содержат на N-конце МН1 домен, способный связываться с ДНК, а на С-конце МН2 домен, участвующий в белок-белковых взаимодействиях. Smad белки участвуют в процессе транскрипции двумя способами: либо непосредственно связываясь с SBE элементами (Smad binding element) про-мотерных участков генов-мишеней с участием своего МН1 домена, либо взаимодействуя с другими факторами транскрипции через свой МН2 домен [73].

Интенсивные исследования последних лет показали, что TGF-β могут активировать не только канонический каскад Smad белков, но и другие сигнальные пути. В экспериментах на различных клеточных линиях описана TGF-β -зависимая активация Erk1/2, JNK и p38, PI3K, а также Ras и Rho-подобных малых ГТФаз [40]. Благодаря этому осуществляется перекрестное взаимодействие между различными путями [61]. Показано участие компонентов МАР (митоген-активируемых протеинкиназ) – сигнального пути в нормальных эпителиальных клетках рака молочной железы, опухолевых клетках NIH 3T3, клетках гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 и фибросаркомы HT1080 [34, 37, 66]. Взаимодействие нескольких сиг- нальных каскадов может осуществляться путем модуляции активности Smad белков с участием Wnt-, IFN-g/STAT – сигнальных путей [18]. Перекрестные связи с другими путями передачи сигнала могут реализовываться посредством активации рецепторов TGF-β EGF-белками [68]. Таким образом, возможность интеграции нескольких сигнальных путей непосредственно и опосредованно активируемых TGF-β рассматривается в настоящее время в качестве одного из возможных механизмов его неоднозначного функционирования в процессах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии.

TGF-β1 как опухолевый супрессор

Функциональная роль TGF-β1 в процессе канцерогенеза молочной железы сложна и затрагивает диаметрально противоположные процессы – супрессию и промоцию опухолевого роста [8, 43, 60, 67]. Способность TGF-β1 ингибировать пролиферацию эпителиальных клеток, а также индуцировать апоптоз и снижать активность теломеразы лежит в основе механизмов супрессии опухолей.

Ингибирование пролиферации клеток. Антипролиферативное действие TGF-β1 основано на активации ингибиторов циклинзависимых киназ семейств Ink4 и Cip/Kip, приводящей к остановке клеточного цикла. Связывание TGF-β со своим рецептором вызывает образование транскрипционных комплексов Smad4 -Smad2,3, которые транслоцируются из цитоплазмы в ядро. Это приводит к активации генов ингибиторов циклинзависимых киназ p21WAF1/ CIP1, p15INK4b, p27KIP1a и репрессии гена MYC, что вызывает подавление активности Cdk4,6 и Cdk2, ответственных за продвижение по G1 и вход в S-фазу [16, 25, 53].

Индукция апоптоза. Апоптоз является одним из наиболее важных механизмов, посредством которого TGF-β1 препятствует опухолевому росту. Показано, что TGF-β1 индуцирует апоптоз эпителиальных, эндотелиальных, гематопоэтических клеток как через р53-зависимые, так и р53-независимые механизмы, посредством регуляции про- (Bax) и антиапоптотических факторов (Bcl-2, Bcl-x1) [26, 36, 59]. В эпителиальных клетках молочной железы рецептор TGF-β1 типа I фосфорилирует и активирует р38/MAP и JNK и опосредует индукцию апопто- за независимо от Smad белков [37]. Реализация апоптоза возможна при интеграции TGF-β1 с другими сигнальными путями, например Fas-зависимым, приводящей к активации каспаз [32].

Снижение активности теломеразы . Прогрессивное укорочение теломер является ограничительным механизмом митотических циклов в соматических клетках, отсчитывающих число делений клетки и продолжительность их жизни. Для опухолевых клеток характерна иммортализация – отсутствие репликативного старения, которое достигается благодаря активации теломеразы, фермента, достраивающего концы хромосом с РНК-матрицы. Активность теломеразы в значительной степени определяется уровнем транскрипции гена hTERT. TGF-β1 способен ингибировать экспрессию гена hTERT при участии трех сигнальных путей Mad1, Menin, and SIP1/ZEB-28, что в конечном итоге приводит к снижению активности теломеразы [50]. Предполагается вовлечение Smad3 в негативную регуляцию транскрипции hTERT [49]. Показано, что экспрессия гена hTERT индуцирует резистентность к рост-ингибирущим сигналам в HME p16INK4(-) клетках молочной железы [72].

TGF-β1 как опухолевый промотор

По мере развития опухоли TGF-β1 способствует конверсии ранних эпителиальных опухолей в инвазивные, метастазирующие, участвуя в опухолевой прогрессии. Доминирование проонкогенной активности TGF-β1 реализуется посредством его участия в процессах эпителиально-мезенхимального перехода, ангиогенеза, а также в процессе формирования иммунной супрессии.

Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT–epithelial-mesenchymal transition). В основе механизма промоторного действия TGF-β1 лежит его способность стимулировать морфогенетические изменения, которые осуществляются за счет миграции клеток и эпителиально-мезенхимального перехода, или трансдифференциации [22, 56, 58]. Ключевыми моментами во время EMT являются: подавление экспрессии гена Е-кадхерина, участвующего в образовании плотных контактов между эпителиоцитами; увеличение экспрессии генов, ответственных за мезенхимальный фенотип эпителиальных клеток, таких как N-кадхерин, ви-ментин, фибробласт-специфический протеин-1 (FSP-1) и гладко-мышечный актин альфа (SMA); усиление клеточной подвижности вследствие активации сигнальных путей, приводящих к реорганизации цитоскелета; повышение экспрессии генов, кодирующих матриксные металлопротеиназы (MMP), которые участвуют в деградации внеклеточного матрикса и базальной мембраны [76]. EMT индуцируется сигналами, поступающими извне клетки (растворимые ростовые факторы и компоненты матрикса), которые интегрируются на мембране за счет взаимодействия со специфическими рецепторами и определяют активацию малых GTP-связывающих белков Ras, Rho и Rac [62].

Показано, что в клеточной культуре нормальные эпителиальные клетки молочной железы (NmuMG) мышей экспрессируют Е-кадхерин и демонстрируют рост в виде эпителиоподоб-ных пластов. При стимуляции TGF-β1 клетки претерпевают полный EMT – обретают мезенхимальный миграционный фенотип путем утраты экспрессии эпителиальных и появления экспрессии мезенхимальных генов, включая «кадхериновое переключение» [23]. TGF-β1 регулирует адгезивные свойства клеток, посредством снижения экспрессии E-кадхерина и увеличения экспрессии αIIIβI интегринов и фибулина-5 [69]. Е-кадхерин является трансмембранным гликопротеином, внутриклеточный домен которого связывается с рядом белков, прежде всего с β-катенином, который, в свою очередь, взаимодействует с актиновыми микрофиламентами [77]. Снижение уровня Е-кадхерина может приводить к освобождению β-катенина из зоны контакта и индукции его транскрипционной активности. Однако гиперэкспрессия β-катенина сама по себе не приводит к EMT, по-видимому, ключевым событием в этом случае является снижение уровня Е-кадхерина [74]. В некоторых случаях нарушение нормального уровня экспрессии гена Е-кадхерина может быть связано с репрессорным действием родственных транскрипционных факторов Snai1 и Slug [6, 10].

В нормальных нетрансформированных клетках TGF-β1 стимулирует продукцию бел- ков экстрацеллюлярного матрикса – коллагена и фибронектина, а также снижает уровень секреции ферментов деградации внеклеточного матрикса – коллагеназы, гепариназы и стромелизина либо стимулирует продукцию белков, ингибирующих их активность – ингибитора тканевого активатора плазминогена-1 и тканевого ингибитора металлопротеиназ [9]. Однако TGF-β1 способен стимулировать протеолитическую активность опухолевых клеток, увеличивая экспрессию ферментов деградации экстрацеллюлярного матрикса, что наряду с изменением морфологических свойств и повышением миграционной способности трансформированных клеток предопределяет инвазивный характер роста, а впоследствии и метастазирование [75]. Трансдифференциация под воздействием факторов роста TGF-β1 опосредуется не только Smad белками путем связывания и активации рецепторов TGF-β-RI и TGF-β-RII, но и с участием Smad-независимых путей передачи сигнала через митоген-активируемые протеин-киназы р38, ERK (extracellular signal-regulated kinase) и JNK (Jun N-terminal kinase), а также фосфатидилинозитол-3-киназу PI3 [3, 4, 7]. Результатом активации комлекса Smad-белков или МАР-киназ является индукция факторов транскрипции, включая белки семейства δEF1/ZEB1 и SIP1/ZEB2, Snail, Slug, Twist, которые связываются с промоторами генов, ответственных за EMT [41, 71]. Промоторы генов, кодирующих мембранные белки – Е-кадхерин, окклудин, клаудин-1, транскрипционно ингибируются этими факторами, а соответственно, промоторы генов компонентов цитоскелета, например виментина, а также генов белков внеклеточного матрикса – фибронектина, в свою очередь, наоборот, активируются. Однако наряду с TGF-β1 в регуляцию экспрессии генов при EMT вовлечены и другие сигнальные каскады – Notch, Wnt, TNF-a, и EGF [44, 62]. Взаимодействие TGF и Ras/Raf/MAP сигнальных путей в инициации эпителиально-мезенхемального перехода является в настоящее время наиболее изученным. Janda et al. (2002) показали, что гиперактивация Raf-MAP киназного каскада в кооперации с TGF-β1 сигналингом индуцирует EMT и ускоряет процесс метастазирования в EpH4 эпителиальных клетках молочной желе- зы [39]. По данным Vogelmann et al. (2005), Ras-белок и PI3 киназа выступают в качестве активатора генов семейства Src-протоонкогенных тирозиновых киназ, что приводит к фофори-лированию α- и β-катенина, дестабилизации комплекса Е-кадхерин/катенин и разрушению адгезионных контактов [78]. Потеря плотных соединений между эпителиальными клетками во время TGF-β1-индуцированного EMT частично достигается за счет интерференции белков полярности и передачи сигналов RhoA. Рецепторный комплекс TGF-β-TGF-β-R ассоциирует и фосфорилирует белки полярности PAR6 (partitioning defective 6 homolog alpha), которые соединяются с E3 лигазой SMURF1, что ведет в конечном итоге к протеосомной деградации RhoA и последующему распаду плотных соединений [5, 35, 63]. Имеются многочисленные доказательства, что разрегулирование передачи сигналов полярности вносит вклад в развитие и прогрессирование рака, в том числе молочной железы. В подтверждение этого гены, кодирующие белки полярности Scribble (Scrib), lethal giant larvae (Lgl), discs large (Dlg), рассматриваются в настоящее время в качестве опухолевых супрессоров, а их мутации и деле-ции ведут к неопластическому росту [82].

Индукция ангиогенеза. Увеличение агрессивности опухоли происходит также за счет стимуляции ангиогенеза под воздействием TGF-β1. TGF-β1 способен индуцировать экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), являющегося основным ангиогенным фактором, регулирующим рост новых кровеносных и лимфатических сосудов [81]. Кроме того, ангиогенезу может способствовать β-катенин-зависимая активация металлопротеиназ, разрушающих внеклеточный матрикс, из которого освобождается значительный запас ростовых факторов [33]. TGF-β1 сигнальная трансдукция в эндотелиальных клетках является уникальной, поскольку затрагивает пути передачи сигнала, имеющие противоположный эффект на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток: классический Smad-зависимый путь через TGF-β-RII и TGF-β-RI (ALK-5) с последующей активацией Smad2 и Smad3 и TGF-β-RII и ALK-1- опосредованный. Баланс между этими сигнальными путями реализуется через эндо- глин (CD105), являющийся одним из рецепторов III типа TGF-β, который блокирует передачу сигнала, инициированного ALK-5, тогда как активирует ALK-1-опосредованный путь [11, 29, 46]. Показано, что при раке молочной железы белок эндоглин специфически экспрессирован на эндотелиальных клетках пери- и интратумо-ральныых кровеносных сосудов и стромальных компонентах опухоли [52, 57]. Эндотелиальные клетки, подобно эпителиальным, способны трансформироваться в мезенхимальные в процессе эндотелиально-мезенхимального перехода (EndMT), в регуляции которого, помимо TGF-β1-пути, принимают участие Wnt, Noth сигнальные каскады [58].

Иммуносупрессия. Опухолевой прогрессии также способствуют паракринные механизмы, обеспечивающие проопухолевую регуляцию опухолевого микроокружения цитокинами, в том числе TGF-β1, продуцируемыми клетками опухоли и иммуноцитами воспалительного инфильтрата стромы. В основе иммуносупрессорного действия TGF-β1 лежит способность блокировать продукцию ИЛ-2, ингибируя ИЛ-2-зависимую пролиферацию Т-клеток [54]. Супрессия Т-лимфоцитов посредством TGF-β1 осуществляется через регуляцию активности циклинзависимых киназ и, соответственно, регуляцию клеточного цикла [80]. Показано, что TGF-β1, продуцируемый как стромальными элементами, так и клетками опухоли, является необходимым звеном в регуляции функционирования T-эффекторных клеток, ингибируя экзоцитоз литических гранул и экспрессию IFN-γ и перфорина [1, 55]. TGF-β1 снижает продукцию IFN-γ NK (natural killer cells) клетками, которая существенна для стимуляции Th1-противоопухолевого иммунного ответа, возможно, блокируя экспрессию рецепторов NKG2D, активирующих цитотоксические функции NK-клеток [12]. Еще одной важной точкой приложения TGF-β1-индуцированной иммуносупрессии являются дендритные клетки. TGF-β1 ингибирует экспрессию молекул MHC II класса, костимулирующих молекул CD80, CD86, CD40 и продукцию IL-12, TNF-α, CCL5/RANTES, что в результате нарушает процессы активации и дифференцировки T-лимфоцитов [45]. Наконец, TGF-β1 может оказывать иммуносупрессивный эффект посредством субпопуляции регуляторных CD4+CD25+FOXP3+-клеток (Treg, Th3-клон), которые способны продуцировать этот цитокин. При таком дистантном механизме TGF-β1, выделяемый Тreg клетками, связывается со своими рецепторами на поверхности Т-эффекторных клеток и ингибирует их активацию, тем самым супрессируя иммунный ответ [51, 65]. Наряду с этим Treg и TGF-β1 вносят вклад в реализацию программы супрессии через прямое взаимодействие с NK-клетками и Th17-лимфоцитами [19, 79]. Выявлено, что присутствие CD4+CD25+FOXP3+клеток сочетается с усилением ангиогенеза, высокой плотностью сосудов в опухолевом микроокружении, а также плохим прогнозом у больных злокачественными новообразованиями [13, 27].

TGF-β1 как прогностический и предсказательный фактор

Поиск эффективных подходов к прогнозированию течения рака молочной железы с использованием информативных молекулярных параметров является на сегодняшний день актуальной задачей современной онкологии. TGFβ1 относится к числу наиболее перспективных молекулярных маркеров, поскольку он вовлечен как в регуляцию процессов клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, так и во внутриклеточные процессы и внеклеточное окружение, т.е. те процессы, которые обеспечивают опухолевую прогрессию.

Проведенные в последние годы клинические и экспериментальные исследования показали как прогностическую значимость, так и предсказательную роль определения белка TGF-β в сыворотке крови или уровня экспрессии его рецептора/белка в ткани больных раком молочной железы. В частности, высокий уровень продукции TGF-β1 в сыворотке крови и снижение уровня экспрессии его рецептора TGF-β-RIII ассоциированы с неблагоприятным прогнозом у больных раком молочной железы [14, 21, 38, 64]. Кроме того, прогностически значимым является и уровень экспрессии эндоглина на эндотелиальных клетках при раке молочной железы [15]. Высокие сывороточные концентрации белка TGF-β коррелируют с развитием фиброза у пациенток после лучевой терапии [17, 48], а уровень TGF-β2 в сыворотке крови после 4-недельного курса лечения тамоксифеном может являться ранним предсказательным маркером ответа на проводимую терапию [42]. Найдены ассоциации между высокой концентрацией белка TGF-β1 в опухолевой ткани и снижением показателей общей и безрецидив-ной выживаемости у больных раком молочной железы [20]. Исследование уровня экспрессии гена FOXP3 в опухоли у больных раком молочной железы выявило его ассоциативные взаимосвязи с инвазивным ростом и размером опухолевого узла, что позволяет оценивать этот транскрипционный фактор как возможный маркер опухолевой прогрессии [31]. Наконец, в качестве потенциальных молекулярных маркеров рассматриваются и полиморфные варианты гена TGF-β1. В настоящее время выделены 8 полиморфных форм гена, две из которых – SNP (single nucleotide polymorphism) в 1 экзоне T+29C (rs1982073, замена тимина (T) на цитозин (C) в 29 позиции) и SNP в промоторной области С-509T (rs1800469, замена цитозина на тимин в 509 позиции) связаны с высокими сывороточными уровнями циркулирующего TGF-β1 [30]. У носителей Т-варианта генотипа (полиморфизм С-509T) и С-варианта (полиморфизм T +29°C) выявлена ассоциация с риском развития РМЖ [2, 24, 47, 70].

Однако следует отметить, что в большинстве исследований изучены и сопоставлены с клиническими данными характеристики, отражающие лишь один из параметров функциональной активности TGFβ1, например, только полиморфные варианты гена или его экспрес-сионный профиль или анализ экспрессии белка в опухолевой ткани. Нет комплексного подхода к оценке его роли в процессах опухолевой прогрессии во взаимосвязи с другими молекулами, обеспечивающими процессы метастазирования. Учитывая многоплановую роль TGF-β1 в патогенезе рака молочной железы, представляется перспективным его исследование как на уровне генетически детерминированных особенностей организма, так и на уровне функционирования гена TGFβ1 и его взаимодействий с белками межклеточной адгезии, с целью выявления маркеров, отражающих закономерности развития прогрессии рака молочной железы, которые могли бы быть использованы наряду с клиническими параметрами при планировании комплексного лечения заболевания.