Роль трофобластического P1-гликопротеина человека в регуляции фенотипического созревания NK- и NKT-клеток

Трофобластический pi-гликопротеин (ТБГ) является онкофетальным белком. который продуцируется во время беременности клетками цито- и синцитиотрофобласта. ТБГ играет значимую роль в эмбриональном развитии, инвазии трофобласта и плацентарном ангиогенезе [Посисеева, Назаров, Татаринов, 2004; Терентьев, Молдогазиева, Комаров. 2009]. Известно, что ТБГ обладает выражен-

(С Заморина С. А , Раев М. Б., 2015

ными иммуномодулирующими эффектами [Заморина, Раев, 2015а; Martinez el al , 2013; Wu et al., 2008]. Однако, изучение эффектов ТБГ затруднено в силу отсутствия в открытом доступе препарата этого белка. Для исследований доступны только рекомбинантные формы ТБГ, которые имеют свои недостатки (структурные отличия, неполный фолдинг, неравноценная посттрансляционная модификация и т.д.). В лаборатории экологической иммунологии (ФГБУН ИЭГМ УРО РАН, г. Пермь) разработана и запатентована авторская технология выделения и очистки ТБГ [Раев, 2008]. Получаемый препарат максимально близок к изоформ ному составу ТБГ, обнаруживаемого в сыворотке беременных, Известно, что in iTi t? ТБГ представлен целым белковым подсемейством, состоящим из более чем 30 белков, которое в международных базах данных называется PSG (pregnancy-specific glycoprotein) [Терентьев, Молдогазиева, Комаров, 2009], У человека доминирующим продуктом экспрессии является PSGL который и был идентифицирован в 1970 г как ТБГ [Татаринов, Масюке-вич, 1970].

В последнее время большое внимание уделяется исследованию функций клеток врожденного иммунитета. Натуральные киллеры (NK) являются клетками врожденной защиты, которые без предварительной иммунизации или активации могут распознавать и лизировать клетки-мишени. Все NK-клетки периферической крови делятся на две субпопуляции по уровням экспрессии молекул CD56 и CD 16. Около 90% NK-клеток незначительно экспрессируют CD56 (dim) и одновременно являются позитивными для CD 16 (CD56dirnCD16+). CD 16 представляет собой низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgGl и IgG3 (Fey RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности. Оставшиеся 10% NK-клеток экспрессируют высокие уровни CD 56 (bright) и нс экспрессируют CD 16 (CD56bngtllCD16') [Trundlcy, Moffct, 2004]. Эти субпопуляции различаются функционально: так, CD56dUT1 NK-клетки обладают выраженной цитотоксичностью, а СО56ь"йШ-клетки являются основными цитокин-продупирующими NK-клетками [Cooper et aL 2001].

Натуральные киллерные Т-клетки (NKT) являются отдельной субпопуляцией Т-лимофцитов. Реализуя функции, свойственные NK-клеткам, они одновременно являются мощными продуцентами цитокинов [Collucci, Caligiuri, Di Santo, 2003]. В силу этого факта NKT-клстки принимают участие в отторжении опухоли, предупреждении аутоиммунных реакций, защите от паразитарных или бактериальных инфекций. NKT-клетки способны распознавать антигены в комплексе с CD Id или молекулой главного комплекса гистосовместимости класса G (HLA-G), представленными на клетках плаценты, что может привести к аборту, а при повышении процента CD3^CD16^ клеток в I тримест ре беременности увеличивается риск развития гес-тоза [Борзова и др., 2005]. Очевидно, именно поэтому в период физиологически протекающей беременности функции как NKT-, так и NK- клеток периферического пула, су премированы [Mahmoud et al., 2004; Clark et al., 2008]. Кроме того, во время беременности число NK-клеток существенно снижается [Watanabe, Iwatani. Keneda. 1997].

Учитывая важную роль NK- и NKT-клеток при беременности как эффекторов неспецифической резистентности организма, целью работы являлось изучение иммуномодулирующих эффектов ТБГ на экспрессию CD 16/56 этими клетками б системе in vitro.

Материалы и методы

Получение ТБГ. ТБГ получали методом хроматографии с использованием биоспецифического сорбента с последующим освобождением от иммуноглобулиновой контаминации на колонке Hi-Trap™ Proten G HP («Amersliam Biosciences», Швеция) [Раев, 2008]. В качестве биоспецифического сорбента использовали сефарозу CL 4В, гранулы которой конъюгировали с моноклональными антителами к ТБГ, продуцируемыми гибридомой ВАРЗ («Genoуас», Германия). Предварительно отцентрифугированную при 25000 g сыворотку крови беременных женщин со сроками беременности свыше 36 недель смешивали с сорбентом и инкубировали в течение 36-48 ч. при +4°C. Сорбент переносили в колонку, отмывали фосфатносолевым буфером с pH 7.25 до нулевых значений оптической плотности. Элюцию осуществляли 0.1М глицин-НС! буфером с pH 2.6. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно подвергали концентрирующей дна фильтрации против физиологического раствора, после чего проводили негативную хроматографию на колонке HiTrap™ Proten G HP.

Содержание ТБГ в препарате, получаемом в ходе выделения и очистки, определяли при помощи иммуноферментного анализа наборами ТБГ-ИФА-Бест («Вектор-Бест», Россия).

Данные электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле по Л эм мли представлены на рис. 1; молекулярная масса полученного препарата определяется в диапазоне от 50 до 75 kD, что соответствует известным данным [Терентьев, Молдогазиева, Комаров, 2009], Широкий диапазон молекулярной массы объясняется как гетерогенностью ТБГ, так и его способностью образовывать олигомерные формы в результате агрегации. Для точной идентификации полученной серии препарата ТБГ оценивали его состав методом LC/MS (комбинация жидкостного хроматографа с масс-спектрометром). Исследование было проведено в Израильском технологическом институте (Smoler Proteomics Center, руководитель профессор А. Эдмон, «Techтоп», Хайфа, Израиль) на приборе

LTQ-Orbitrap («Thermo Fisher». США). На рис. 1 представлены данные LC/MS для трех исследуемых диапазонов, отмеченных на электрофоре-грамме, из которых следует, что препарат содер жит несколько молекулярных форм белка: ТБГ-L ТБГ-3, ТБГ-7, ТБГ-9, а также некоторые изо(]юр-мы и прекурсоры, определяемые in vivo.

а) 250

15 RD

12  3  4

L °) Верхний диапазон (upper area): pregnancy specific beta-1 -glycoprotein 3 j\ [Homo sapiens]; pregnancy: specific beta-1-glycoprotein 3, isoform CRA_a __j 2 [Homo sapiens];pregnancy specific beta-1 -glycoprotein 1 [Homo sapiens];

pregnancy: specific beta-1-glycoprotein 9, isoform CRA J"[Homo sapiens]; pregnancy: specific beta1 glycoprotein 9, isoform CRA_a [Homo sapiens].

Средний диапазон (middle area): pregnancy specific beta-1-glycoprotein I -* \ [Homo sapiens]; pregnancy-specific beta-1 -glycoprotein 9precursor (PSBG-/ 9fi PSG9 [Homo sapiens] pregnancy specific beta-1-glycoprotein 9 [Homo "V    sapiens]; pregnancy specific beta-1 -glycoprotein 3 [Homo sapiens];

pregnancy: specific beta-1-glycoprotein 3, isoform CRA _a (Homo sapiens);

pregnancy*specific beta-1 -glycoprotein 7 [Homo sapiens]; PSG7_HUMAN, partial CDS [Homo sapiens); pregnancy-specific beta-1 glycoprotein 7 [Homo sapiens]; pregnancy specific beta-1 -glycoprotein 7, isoform CRA a J [Homo sapiens]

Нижний диапазон (middle area): pregnancy specific beta-1-glycoprotein 3 -\/ [Homo sapiens]; pregnancy specific beta-1-glycoprotein 3. isoform CRA_a [Homo sapiens]; pregnancy: specific beta-1-glycoprotein 1 [Homo sapiens); pregnancy specific beta-1 -gly coprotein 9, isoform CRAJfHomo sapiens); pregnancy specific beta-1 glycoprotein 9, isoform CRA a [Homo sapiens).

Рис. 1. Идентификация полученного препарата ТБГ:

а) электрофоретическое разделение препарата ТБГ в 10%-ном полиакриламидном геле по Лэммли: 1 -маркеры; 2 - пулированная сыворотка крови беременных женщин; 3 - препарат после сульфат-аммонийного фракционирования и диализующей ультрафильтрации; 4 - препарат после аффинной хроматографии, б) идентифицированные белки семейства PSG в полученном препарате ТБГ по данными LC/MS (название белка по базе http;//www.uniprot,org/)

В работе использовали физиологические концентрации ТБГ, соответствующие его уровню в периферической крови матери в период беременности - 1. 10 и 100 мкг/мл. Уровень ТБГ растет с минимальных значений (1-10 мкг/мл) в первые недели беременности, достигая максимума на 33-36 неделе (100-200 мкг/мл) [Посисеева, Назаров. Татаринов. 2004].

Объекты исследования. В работе использовали фракционированные мононуклеары периферической крови (МПК) практически здоровых доноров, которыми являлись небеременные женщины репродуктивного возраста (п=21). МПК получали центрифугированием в градиенте плотности фи-колл-верографина (1.077 г/см³) («Sigma», США. «Спофа». Чехия, соответственно), после чего клетки отмывали и подвергали воздействию ТБГ (1. 10 и 100 мкг/мл).

Иммунологические методы. После суточной инкубации МПК с ТБГ (полная питательная среда. 5% СО2. 37°С) оценивали фенотип лим(|юцитов. определяя содержание NK-клеток с фенотипом СОЗ CD16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD 16.56-РЕ), согласно методике производителя антител («Beck man Coulter», США). Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur («Becton Dickinson». США).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного r-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Известно, что СО56/16-позитивные NK-клетки обладают выраженной цитотоксичностью и принимают активное участие в деструкции аллотранс-плантантов. именно поэтому их уровень в периферической крови беременных существенно снижен [Seshadri. Sunkara, 2014].

Установлено, что суточная инкубация клеточных культур с ТБГ в низких концентрациях (1 и 10 мкг/мл) нс влияет на экспрессию CD 16 CD56 r NK-клетками (рис. 2). Однако в высокой концентрации (100 мкг/мл) ТБГ угнетает уровень CD16+CD56* NK-клеток (рис. 2. 3). Известно, что NK-клетки с фенотипом CD16+ являются наиболее зрелыми и обладают высокой цитолитической активностью [Mitlag el al., 2005]. Кроме того, повышение процента клеток CD56+ в периферической крови связано с ранним прерыванием кариотипически нормальной беременности [Coulam el al., 1995].

Рис. 2. Влияние ТБГ на экспрессию CD 16/56 NK- и NKT-клетками (п=8)

Возможно, депрессивный эффект ТБГ опосредован интерлейкином (1L)-1O, который снижает функциональную активность NK-клеток, а ТБГ стимулирует продукцию этого цитокина | Wu et al.. 2008; Заморина, Раев, 2015б|.

Таким образом, угнетающее действие ТБГ в отношении экспрессии CD16 CD56+ NK-клетками может иметь значение в протекции полуаллогенно-го плода от атаки цитотоксических NK клеток. Кроме того, известно, что ТБГ оказывает эффекты в тесной функциональной связке с TGF-p. непосредственно активируя продукцию этого цитокина [Ballesteros et al.. 2015]. Известно, что клетки тро-фобласта устойчивы к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами и NK-клетками. но не резистентны к лизису активированными NK (LAK-клетки). TGF-Р, в свою очередь, подавляет активацию NK-клеток и их превращение в LAK-клетки. Именно TGF-p, в свою очередь, способствует трансформации периферических CD 16'CD9NK-клеток в децидуальные CD16 CD9TiNK-K.ierKH [Keskin et al., 2007]. Важно отметить, что CD9 (тетраспонин) рассматривается как потенциальный рецептор для ТБГ [На et al., 2005], он присутствует на Т-лимфоцитах, но слабо экспрессируется на периферических NK-клетках. В то же время именно его экспрессия характеризует трансформацию клетки в dNK. Довольно интересно, что CD9 может в небольшом проценте коэкспрессироваться с CD56 на периферических NK-клетках [Sanchez-Rodriguez et al., 2011]. В целом ТБГ. вероятно, воздействует на эти процессы через вовлечение TGF-p. что в итоге приводит к трансформации NK-клеток в децидуальные CD16CD9uNK.

Рис. 3. Влияние ТБГ на экспрессию CD 16/56 NK- и NKT-клетками на примере одного эксперимента.

В правом верхнем квадранте указан процент CD3+CD16/56+ - в гейте лимфоцитов, в левом верхнем - CD3-CD16/56+. По оси X - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание PITC); по оси у - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание РЕ)

NКТ-клетки являются отдельной субпопуляцией Т-лимфоцитов. Реализуя функции, свойствен- ные NK-клеткам, они одновременно являются мощными продуцентами цитокинов. Кроме того. NKT-клетки составляют субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, которые наряду’ с дендритными клетками играют ведущую роль в Т111/Т112 девиации и формировании периферической толерантности [Boyson et aL 2002]. Известно, что NKT-клетки периферической крови имеют большое значение в период имплантации, индуцируя цитокиновое окружение ТЬ2-типа [Boyson et aL 2002].

Установлено. что ТБГ в низкой концентрации (1 мкг/мл) не влиял на уровень СВ16+СО5бД4КТ-клеток (рис. 2.. 3) . В то же время, в концентрациях 10 и 100 мкг/мл ТБГ увеличивает процент CD 16+CD 56 ДчГКТ-клеток. Важно отметить, что повышение процента CD3 CD 16 клеток в ранние сроки беременности, когда уровень ТБГ еще невысок. может увеличивать риск развития гестоза [Борзова и др.. 2005]. Однако такой зависимости для П-Ш триместра не обнаружено.

Таким образом, ТБГ в высоких концентрациях, экстраполированных с II-III триместра беременности. способствует фенотипическому созреванию NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитокин-проду циру ющей активности. Вероятно, выявленные эффекты ТБГ в отношении CD 16 CD 56 NKT-клеток являются одним из возможных механизмов участия ТБГ в поддержании баланса цитокинов и формировании периферической толерантности при беременности.

В целом полученные результаты демонстрируют новые иммуномодулирующие эффекты ТБГ. Известно, что у женщин с такими аутоиммунными заболеваниями, как ревматоидный артрит или рассеянный склероз, отмечается улучшение состояния во время беременности, а повышенные уровни сывороточного ТБГ коррелировали с улучшением состояния [Терентьев, Молдогазиева, Комаров. 2009]. Дальнейшее изучение влияния роли ТБГ в формировании иммунной толерантности откроет возможности его применения в качестве перспективного средства для лечения аутоиммунных заболеваний.