Роль урокиназной системы в лимфогенном метастазировании колоректального рака

Колоректальный рак является одним из самых часто диагностируемых злокачественных новообразований в мире. Заболеваемость в старшей группе снижается, в то время как в группе младше 50 лет постепенно растет. Локализация КРР смещается из дистальных отделов в правые проксимальные [1, 2]. Смертность от КРР после небольшого падения к 2000м годам снова начинает расти: к примеру, смертность в мире c 492000 случаев в 2000 г. [3] поднялась до 935000 в 2020 г [4]. Данные статистики заставляют пересмотреть подходы к диагностике и лечению данного вида опухоли,дополнить их более прогрессивными и показательными методами,а также разработать новые стандарты прогнозирования исходов.

Из существующих на данный момент методов диагностики далеко не все включены в клинические рекомендации вследствие своей низкой чувствительности и специфичности, либо недостаточной доказательной базы. Старые методы инвазивной диагностики заменяются новыми, с лучшей разрешающей способностью и большим спектром действий, однако в условиях, когда гистологическое исследование является «золотым стандартом» диагностики КРР, оно не всегда применимо не только к первичной диагностике опухоли,но и масштабнее к прогнозированию прогрессирования и реци-дивирования заболевания.

Из имеющихся неинвазивных методов диагностики, онкологические маркеры сыворотки крови, применявшиеся до настоящего времени, показали себя неэффективным инструментом оценки параметров прогно-зирования,вследствие чего необходим поиск новых, более специфичных маркеров с лучшими показателями чувствительности и специфичности для конкретного заболевания.

На данный момент существует множество исследований на тему выявления роли урокиназной системы в отражении наличия, роста и рецидивирования опухолей, главным образом рака молочной железы, при этом для данного заболевания урокиназная система является доказанным опухолевым биомаркером. Эти данные позволяют предполагать наличие роли урокиназной системы в течении и прогрессировании КРР.

Мы предположили на основании данных о механизме действия урокиназной системы о ее роли в возникновении и прогрессировании лимфогенного метастазирования колоректального рака. Данное исследование было проведено для того,чтобы оценить роль урокиназной системы в лимфогенном метастазировании колоректального рака.

Целью данной работы стало изучение роли и взаимосвязи уровней компонентов урокиназной системы с лимфогенным метастатизированием у пациентов с колоректальным раком.

Ме тоды

Исследование было проведено на базе «Медицинского научно-образовательного центра МГУ имени М.В. Ломоносова» с 2019 по 2021 год. В исследование были включены 7 здоровых доноров (контрольная группа) и 49 пациентов с колоректальным раком I-III стадии (I стадия n1=11, II n2=14, III n3=23), средний возраст составил 63,84 г., 25 женщин и 24 мужчины, всем пациентам была проведена проведена хирургическая резекция первичной опухоли с лимфодиссекцией соответствующего уровня.

Критерии включения в исследование:

Возраст от 18 лет;

• •    Верифицированный рак толстой кишки без отдаленного метастазирования, потенциально радикально резектабельный;

• •    Отсутствие в анамнезе ранее установленного злокачественного новообразования иных локализаций;

• •    Отсутствие тяжелых инфекционных заболеваний (ВИЧ-инфекция, туберкулез, сифилис, прогрессирующее течение вирусных гепатитов В и С);

• •    Отсутствие декомпенсированных хронических заболеваний (ХСН IIA и выше, тяжелый сахарный диабет, тяжелая легочная гипертензия, рецидивирующая ТЭЛА)или хронических заболеваний в стадии обострения (ХОБЛ);

• •    Наличие информированного согласия.

Данные анамнеза, лабораторных показателей, инструментальных исследований, протоколы операции, патоморфологические заключения анализированы ретроспективно на основании историй болезни пациентов, находившихся на стационарном лечении в МНОЦ МГУ в период с 2019 по 2020 годы. Представленное распределения пациентов по стадии опухолевого процесса выполнено на основании данных патоморфологического исследования удаленных препаратов.

Сыворотку крови собирали утром натощак непосредственно перед хирургической операцией по резекции опухоли. Готовые образцы сыворотки маркировали и хранили при температуре – 20 ºС. Периферическая кровь забиралась из кубитальной вены.

Для определения uPA и uPAR использовали образцы сывороток крови 49 больных и 7 здоровых добровольцев, анализ проводили с помощью тест-системы «Human uPA/PLAU/URK PicoKine™ ELISA Kit, USA» и «Human uPAR/URKR/uPA Receptor PicoKine™ ELISA Kit, USA»в строгом соответствии с протоколом изготови-теля.Перед началом исследования образцы сывороток крови размораживали и аккуратно перемешивали, в качестве стандарта использовали рекомбинантные uPA и uPAR человека.

Статистическая обработка:

Все полученные данные вносились в электронную базу данных в программе MS Excel. Статистическая обработка выполнялась в программе IBM SPSS Statistics 28 и Statistica 13.

Отдельно проводились сравнения групп пациентов с контрольной выборкой здоровых доноров;групп пациентов по полу, возрасту, локализации опухоли, патологоанатомической стадии T, патологоанатомической стадии N, а также по патологоанатомическим показателям лимфоваскулярной, периневральной инвазии и опухолевого «почкования».

Для проверки распределения всех анализируемых количественных показателей на нормальность использовался одновыборочный критерий Колмогорова-Смирнова и критерий Шапиро-Уилка, уровень значимости – 0,05. При p>0,05 подтверждается гипотеза об отсутствии различий между наблюдаемым распределением признака и теоретически ожидаемым нормальным распределением.

Для определения различий между группами с ненормальным распределением использовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни для сравнения двух независимых выборок,если распределение не отличалось от нормального – использовался t-тест.

Показатели уровня урокиназы групп пациентов женского и мужского пола, а также групп с наличием и отсутствием дополнительных патологоанатомических изменений имели нормальное распределение.Для них использовался t-тест.

В связи с отсутствием нормального распределения остальных показателей хотя бы в одной из групп для дальнейшего анализа данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при уровне значимости р <0,05.

Для определения значимости различий между средними в нескольких независимых группах был использован дисперсионный анализ ANOVA с проверкой апостериорных критериев (Тьюки HSD) для определения различающихся групп. Отличия считали статистически значимыми при уровне значимости р <0,05.

Результаты

Из 49 пациентов настоящего исследования для 47 имелись данные по предоперационному уровню урокиназы uPA (нг/мл) и для 48 данные по предоперацион-

Рис. 1. Описательная статистика показателя уровня урокиназы у пациентов с КРР

Fig. 1. Descriptive statistics of the urokinase level indicator in patients with CRC

ному уровню рецептора урокиназы uPAR (нг/мл); для 49 пациентов имелись данные по различным клиническим и патоморфологическим характеристикам,кото-рые представлены в приложении 1. В приложении 2 представлены данные здоровых добровольцев по уровню урокиназы uPA (нг/мл) и рецептора урокиназы uPAR (нг/мл).

Данные описательной статистики по уровню урокиназы uPA и ее рецептора uPAR группы пациентов с колоректальным раком представлены на рисунке 1 и рисунке 2.

На рисунках 3и 4представлены данные описательной характеристики уровня урокиназы и ее рецептора в контрольной группе здоровых добровольцев.

Рис. 2. Описательная статистика показателя уровня рецептора урокиназы у пациентов с КРР

Fig. 2. Descriptive statistics of the urokinase receptor level indicator in patients with CRC

uPA, нг/мл	Стандартная
Среднее     N	отклонения Медиана Минимум Максимум
2,794          7	1,035      2,946       1,350        4,350

Рис. 3. Описательная статистика показателя уровня урокиназы у здоровых добровольцев

Fig. 3. Descriptive statistics of the urokinase level indicator in healthy volunteers

При анализе различий между выборками пациентов с КРР и контрольной группы по уровню урокиназы с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок (рис. 5) получена асимптотическая значимость 0,071 (p>0,05). Однако, учитывая небольшой объем контрольной группы (n=7) и близкий к значимому уровень достоверности различий между группами, полученные данные являются значимыми с клинической точки зрения и определяют необходимость дальнейших исследований с увеличением объема выборки. Мы можем расценивать такой результат как тенденцию к повышению уровня урокиназы при нали- uPAR, нг/мл

Среднее	N	Стандартная отклонения	Медиана	Минимум	Максимум
1,357	7	,782	,990	,789	2,901

uPAR, нг/мл

Рис. 4.Описательная статистика показателя уровня рецептора урокиназы у здоровых добровольцев Fig. 4. Descriptive statistics of the urokinase receptor level indicator in healthy volunteers

Критерий U Манна-Уитни для независимых выборок пациенты=О здоровые=1

Частота

Сводка U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок

Всего

U Манна-Уитни

Асимптотическая значимость (2сторонний критерий)

Рис. 5. Результаты сравнения значений сывороточного уровня урокиназы в группах пациенты с КРР и здоровые добровольцы с помощью критерия Манна-Уитни

Fig. 5. Results of comparison of serum urokinase levels in groups of patients with colorectal cancer and healthy volunteers using the Mann-Whitney test чии КРР, что позволило бы нам использовать данный маркер в диагностических и прогностических целях.

При анализе различий между выборками пациентов с КРР и контрольной группы по уровню рецептора уро- киназы с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок (рис. 6) получена асимптотическая значимость 0,052. Однако, учитывая небольшой объем контрольной группы (n=7) и

Сводка U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок

Всего55

U Манна-Уитни91,0

Асимптотическая,052

значимость (2сторонний критерий)

Рис. 6. Результаты сравнения сывороточного уровня рецептора урокиназы в контрольной группе и группе пациентов с КРР с помощью критерия Манна-Уитни

Fig. 6. Comparison of serum urokinase receptor levels in the control group and group of patients with CRC using the Mann-Whitney test

Box Plotof uFA grouped by N

N                          о Y

Рис. 7. Графическое представление различий показателя урокиназы uPA (нг/мл) по pN стадии опухоли

Fig. 7. Graphical representation of differences in urokinase uPA (ng / ml) by tumor stage pN

небольшие различия между нашей значимостью 0,052 и p =0,05, можно считать значимым различием между уровнем рецептора урокиназы у здоровых добровольцев и пациентов с КРР.

Мы провели сравнения выборок пациентов по патологоанатомическим стадиям pN, исходно было сформировано 3 группы N0, N1, N2.

На рисунке 7 и в таблице 1 представлены данные

Таблица 1.

Результаты сравнения уровня урокиназы у пациентов с КРР в зависимости от pN стадии заболевания с помощью дисперсионного анализа ANOVA

Table 1.

Results of comparing the level of urokinase in patients with CRC depending on the pN stage of the disease using analysis of variance ANOVA

Описательные статистики

иРА. нг/мл N			Среднее		Среднеквадр этичное отклонение		Среднекв Ошибка	Минимум		Максимум
0		20	3,386		1,402		.314	1,246		5,788
1		15	4,745		2,533		.654	2,185		11,150
2		6	4,365		2,061		.841	1,517		6.650
Всего		41	4,027		2,031		.317	1,246		11,150
	иРА, нг/мл			Сумма квадратов		ANOW ст.св.	Средний квадрат	F	знач.
	Между группами			16,650		2	8,325	2,132	,133

Множественные сравнения

Зависимая переменная: иРА. нг/мл

ТьюкиHSD

Средняя (I) N (J) N разность (I-J) Среднекв. Ошибка знач 0 1 -1,360 .675 .123 2 -.980 .920 ,541 1 0 1,360 .675 ,123 2 ,380 .955 .917 2 0 .980 .920 ,541 1 -.380 .955 .917 анализа различий по стадиям pN у пациентов с КРР для показателя урокиназы, который был проведен с помощью дисперсионного анализа ANOVA с проверкой апостериорных критериев (Тьюки HSD) для определения различающихся групп. Значение критерия 0,133 > p=0,05, следовательно, различия между группами отсутствуют, об этом же свидетельствуют более подробные сравнения.

Таблица 2.

Результаты сравнения уровня рецептора урокиназы у пациентов с КРР в зависимости от pN стадии заболевания с помощью дисперсионного анализа ANOVA

Table 2 .

Results of comparing the level of the urokinase receptor in patients with CRC depending on the pN stage of the disease using analysis of variance ANOVA

Описательные статистики

uPAR, нг/мл N		Среднее		Среднеквадр этичное отклонение		Среднекв. Ошибка		Минимум		Максимум
0	21	3,660		2,460		.537		.900		8.621
1	14	3,375		3,000		.802		.769		9,835
2	7	1,383		,866		.327		.801		3,250
Всего	42	3,185			2,569	.396		.769		9,835
	uPAR, нг/мл		Сумма квадратов		ANOW ст.св.	1 Средний квадрат	F		знач.
	Между группами		27,971		2	13,985	2,249		,119

Множественные сравнения

Зависимая переменная: uPAR, нг/мл

ТЬЮКИ HSD
(I) N	(J)N	Средняя разность (I-J)	Среднекв. Ошибка	знач.
0	1	,285	.860	.941
	2	2.277	1,088	.105
1	0	-.285	.860	,941
	2	1,992	1,154	.209
2	0	-2.277	1,088	,105
	1	-1,992	1,154	.209

Анализ различий по стадиям pN у пациентов с КРР для показателя рецептора урокиназы был проведен с помощью дисперсионного анализа ANOVA с проверкой апостериорных критериев (Тьюки HSD) для определения различающихся групп (таблица 2, рис. 8). Значение критерия 0,119 >  p =0,05, следовательно, различия между группами отсутствуют, об этом же свидетельствуют более подробные сравнения.

Затем группы были укрупнены по принципу наличия или отсутствия поражения регионарных лимфоузлов. После проведения анализа статистических различий по стадии N у пациентов с КРР для показателя урокиназы с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок – асимптотическая значимость составила 0,068, что немногим больше p=0,05, следовательно, различия по стадиям статистически не значимы, однако существует тенденция к различиям, и необходимо провести дальнейшие исследования. Аналогично для рецептора урокиназы асимптотическая значимость составила 0,085, что больше p=0,05, следовательно, различия по стадиям статистически не значимы, однако существует тенденция к наличию различий.

Данные последних двух анализов свидетельствуют о тенденции к различиям по признаку полное отсут-ствие/наличие регионарного метастазирования опу-холи,что говорит в пользу уже гипотезы о преобладающей роли урокиназной системы в процессах регионарного и отдаленного метастазирования.

Обсуждение

По данным литературы у пациентов с колоректальным раком повышенный дооперационный уровень suPAR в плазме продемонстрировал связь с плохой выживаемостью [5]. Yang и др. предположили, что uPA и uPAR могут использоваться в качестве независимых прогностических факторов для оценки выживаемости пациентов с колоректальным раком, метастазирования, а также в качестве терапевтических мишеней [6]. В своей работе мы также обнаружили более высокий уровень компонентов урокиназной системы у пациентов с колоректалным раком по сравнению со здоровыми добровольцами.

Целью данного исследования была непосредственная оценка роли уркиназной системы в лимфогенном

Век Plot of uPAR grouped by N

N

Рис. 8. Графическое представление различий показателя рецептора урокиназы uPAR (нг/мл) по pN стадии опухоли Fig. 8. Graphical representation of differences in uPAR uPAR receptor (ng / ml) by pN tumor stage

метастазировании колоректального рака.Нами было обнаружено, что у пациентов с гистологически подтвержденным метастатически поражением лимфатических узлов значительно выше уровень компонентов урокиназной системы.Эта взаимосвязь обусловлена ролью урокиназноой системы в канцерогенезе.

Система uPA играет важную роль в активации плазмина из его неактивной формы плазминогена путем протеолитического расщепления.После активации система плазмина вызывает деградацию фибрина, нескольких факторов свертывания крови и ECM. Это, в свою очередь,действует как гомеостатический механизм при нормальном физиологическом заживлении ран. Кроме того, компоненты системы uPA – uPAR участвуют в протеолитической активации ряда факторов роста и цитокинов (например, основного фактора роста фибробластов, TGF-β и интерлейкина-1 бета), которые участвуют в миелопоэзе [7]. Degryse et al. продемонстрировали, что только uPA может индуцировать хемотаксис в гладкомышечных клетках крыс за счет его связывания с uPAR [8]. Более поздние исследования Мухиной и соавт. далее оптимизировали решающую роль uPA в обеспечении хемотаксиса [9]. Эти результаты предполагают, что протеолитический домен uPA не требуется для хемотаксиса. Кроме того, опосредованное антителами ингибирование uPAR блокировало хемотаксис, тогда как восстановление с помощью экзогенного uPAR обращало эти эффекты [10]. Распределение uPAR также различается между активно мигрирующими и немигрирующими клетками.Несмотря на то, что uPAR более предпочтительно распределяется на апикальной стороне или в фокальных контактах на поверхности немигрирующих клеток [11,12], во время миграции он перераспределяется на переднем крае мигрирующих клеток [13]. Таким образом, uPAR регулирует концентрацию и активность uPA в необходимых участках на поверхности мигрирующих клеток. Подобно uPA, его рецептор uPAR также играет важную роль во врожденном иммунном ответе посредством регуляции клеточной адгезии, миграции зависимым или независимым от uPA образом [63]. Блокада uPAR ограничивает миграцию лейкоцитов in vitro, а также препятствует привлечению Т-клеток in vivo [14]. В совокупности все эти исследования делают очевидным, что система uPA-uPAR находится на границе между фибринолизом,механизмами иммунного ответа и патологией [15].

Внеклеточный матрикс действует как барьер, сдер- живающий опухолевые клетки в пределах своего первичного места происхождения, а протеолитическая деградация ЕСМ является ключевым событием во время роста, инвазии и метастазирования опухоли. Протеазы, которые могут вызывать деградацию ECM, включают uPA, плазмин, катепсины и различные типы MMP. Во время метастазирования опухолевые клетки в различных случаях вызывают деградацию ECM, чтобы покинуть первичный участок происхождения и мигрировать в отдаленные ткани по пути кровотока. Компоненты системы uPA-uPAR могут разрушать ECM через активацию плазмина или MMP. Деградация ECM вызывает высвобождение различных типов факторов роста,ко-торые действуют как петля обратной связи для усиления экспрессии различных компонентов системы uPA-uPAR, а также регуляции различных стадий метастазирования.

Известно, что компоненты систем uPA увеличивают клеточную адгезию и миграцию во время метастатического распространения опухолевых клеток. Роль uPAR в этом отношении изучена достаточно широко.В настоящее время установлено, что uPAR соединяет систему uPA с передачей сигналов GPCR, а также с некоторыми другими белками, такими как цитокератин 8, α-енолаза, для регулирования клеточной адгезии и миграции. PAI-1 может уменьшать миграцию клеток, подавляя взаимодействие между витронектином и ин-тегрином αvβ3.

Повышенная экспрессия uPAR в условиях гипоксии активирует нижестоящие сигнальные пути Akt и Rac1, что приводит к стимулированию ЕМП, а также к клеточной инвазии. Кроме того, блокирование экспрессии uPAR подавляло ЭМП, вызванное гипоксией. Это говорит о том, что uPAR играет роль в ЕМТ. Другие исследования показали, что таргетинг uPAR с помощью антител также ингибирует инвазию и метастазирование опухоли как in vitro, так и in vivo. Новые данные свидетельствуют о том, что опухолевые клетки секретируют различные типы внеклеточных везикул, которые обладают прометастатическим действием. Более высокие уровни uPA и PAI-1 были обнаружены во внеклеточных пузырьках различных опухолевых клеток,что указывает на возможное участие оси uPA в опосредованном экзосомами онкогенезе и метастазировании.Однако в будущем необходимы подробные исследования для подтверждения этого явления [16]. В исследовании in vitro было обнаружено, что фактор транскрипции GATA6 индуцирует миграцию и инвазию клеток КРР за счет увеличения экспрессии uPA посредством Sp1-свя-занной активации промотора uPA [17]. Аналогичным образом, сообщалось, что фактор-1, производный стромальных клеток,индуцирует экспрессию и секрецию uPA путем стимуляции Sp1 и AP-1 связывания с промотором uPA в клеточных линиях DLD -1, SW48 и COLO205 [18].

Заключение

Определение чувствительности и специфичности урокиназной системы как маркера КРР является решающим в установлении пригодности данного показателя для клинической практики.На данный момент уровень урокиназы служит потенциально альтернативным лабораторным тестом, в перспективе заменяющим доказано незначимые уровни CEA и CA19-9. Мы установили, что уровень компонентов урокиназной системы в периферической крови пациентов с новообразованиями толстой кишки по сравнению с таковым у здоровых добровольцев имеет различия,однако со статистическими ограничениями, связанными с малыми размерами выборки здоровых добровольцев. Имеется тенденция повышения уровня компонентов урокиназной системы в периферической крови у пациентов с колоректальным раком в дооперационном периоде в зависимости наличия метастатического поражения регионарных лимфоузлов, что говорит о возможности использования данного маркера для до-операционного прогнозирования лимфогенного метастазирования опухоли после проведения дальнейших более обширных исследований по данному направлению.