Роль ВПЧ-типирования, генотипирования и определения уровня вирусной нагрузки при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях

Рак шейки матки на протяжении двух десятилетий остается одной из часто встречающихся опухолей среди всех злокачественных новообразований у женщин, проживающих на территории России. Негативной тенденцией является «омоложение» рака шейки матки, что обусловлено прежде всего социальными проблемами общества, высоким инфекционным индексом населения, значительным увеличением числа абортов и ростом инфекций, передаваемых половым путем. В последние годы в большинстве работ иностранных авторов активно обсуждается роль ДНК ВПЧ-тестирования в цервикальных скрининговых программах. Считается, что молекулярно-биологические исследования с целью определения ВПЧ высокого канцерогенного риска позволят не только выявить пациенток с высоким риском развития дисплазии и РШМ, но и позволят сформулировать возможный прогноз развития цервикальной неоплазии у конкретной пациентки [1, 2, 5, 9].

Материалы и методы

Для изучения диагностической и прогностической значимости папилломавирусной инфекции (Human Papilloma Virus, HPV) и степени вирусной нагрузки при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях (Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN) проведено комплексное клинико-морфологическое исследование 250 пациенток с позитивным ВПЧ тестом, обратившиеся с целью обследова- ния и лечения заболеваний шейки матки. Возраст обследованных варьировался от 23 до 42 лет, и составил, в среднем, 35,3±8,1 лет.

Диагностика заболеваний шейки матки включала в себя клинические, кольпоскопические, цитогистологические и иммуногистохимические методы исследования. ВПЧ-типирование и генотипирование проводилось методом ПЦР-анализа по общепринятой методике с применением тест-систем «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр FRT» (Москва) [8]. Материалом для ПЦР-исследования служили соскобы эпителия цервикального канала и поражений шейки матки, взятые одноразовыми зондами до проведения комплексного обследования и лечения заболеваний шейки матки.

В обследованной группе женщин у 200 пациенток гистологически верифицировано наличие CIN, в том числе у 60 (24,0%) пациенток выявлена CIN I, у 65 (26,0%) – CIN II и у 75 (30,0%) подтверждено наличие CIN III. У 50 (20,0%) пациенток с ВПЧ ассоциированным цервицитом интраэпителиальные поражения отсутствовали, гистологический диагноз соответствовал эндоцервикозу.

В качестве метода выявления и количественного определения ДНК ВПЧ использовалась ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В применяемых тест-системах используется принцип группоспецифических олигонуклеотидов, способных ампли-фицировать фрагменты ДНК нескольких представителей филогенетической группы ВПЧ. Результат рассчитывается в геномных эквивалентах вируса на 105 клеток. Порог релевантного количества вируса принимается равным 3 lg ВПЧ на 105 клеток. Исследование проводили на четырехканальном амплификаторе «RotorGeen 3000/6000» фирмы «Corbett Research» (Австралия). Основываясь на данных, полученных из разных исследований, вирусная нагрузка менее 3 на 105 клеток является клинически малозначимой и характеризуется минимальным риском развития дисплазии и почти 100% спонтанной регрессией. Вирусная нагрузка более 5 на 105 клеток обозначает повышенное количество вируса и отражает наличие дисплазии или высокий риск ее развития.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования обнаружено, что в подавляющем большинстве случаев цервикальные интраэпителиальные неоплазии ассоциированы с HPV-инфицированием. Многочисленными

39 типа – 11 (7,9%), 52 типа – у 9 (6,4%), 51 тип у 8 (5,7%) и 58 типа у 7 (5,0%) обследованных. Другие онкогенные типы у пациенток с СIN II и СIN III, были обнаружены в гораздо меньшем числе наблюдений: 45 тип – 4,3%, 56 тип – у 4,3%, 35 тип – у 2,9%, 59 тип у 2,1% пациенток (рис. 2).

Далее проведен анализ распределения генотипов ВПЧ ВКР у 50 пациенток основной группы с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом (рис. 3). Выявлено, что у данной категории пациенток преимущественно определяются 16 тип – 18 (36,0%), 31 тип – 13 (26,0%) случаев и 52 тип 11 (22,0%) наблюдений. Реже определялись 33, 56, 39, 45 и 51 типы ВПЧ (14,0%, 10,0%, 8,0%, 8,0%, 6,0% соответственно). В очень небольшом числе наблюдений выявлены 18, 35, 58 и 59 типы (всего по 4,0%).

Как следует из представленных данных, по результатам генотипирования выявлено преобладание ВПЧ 16 типа литературными данными показана высокая клиническая значимость диагностики HPV [1, 3, 4, 6, 10]. Это определяется необходимостью формирования групп онкологического риска с выявлением тех пациенток, для которых необходимы активная комплексная профилактика и доклиническая диагностика рака шейки матки.

В настоящее время основным методом идентификации папилломавирусной инфекции является молекулярнобиологическое выявление ДНК вируса папилломы различных типов. Известно, что около 12 типов HPV являются потенциально онкогенными [1, 6].

Результаты исследования показали,

что среди пациенток с интраэпителиальными поражениями низкой степени (CIN I) наиболее часто были обнаружены 16 тип ВПЧ – в 24 (40,0%) наблюдениях, 31 тип – 16 (26,7%) и 52 тип – в 12 (20,0%) случаях. В равном количестве случаев определялись 33 и 39 типы (15,0%), 18 тип был выявлен в 8 (13,3%) случаях, 51 тип – в 6 (10,0%) наблюдений. Другие онкогенные типы ВПЧ были найдены менее чем в 10,0% набюдений: 56, 45, 58, 59 и 35 типы (8,3%, 8,3%, 6,7%, 5,0% и 3,3% соответственно) (рис. 1).

У пациенток с CIN II и CIN III по результатам генотипирования превалировал 16 тип ВПЧ – у 105 (75,0%) обследованных, 31 тип – 28 (20,0%), 33 тип – 25 (17,8%) и 18 тип. – 14 (10,0%) пациенток. Значительно реже выявлялись – ь ВПЧ

Рис. 1. Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с СIN I

Рис. 2. Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с CIN II/III

Рис. 3. Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом

среди других онкогенных вирусов как у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом, так и при интраэпителиальных неоплазиях. Частота его идентификации при тяжелых интраэпителиальных поражениях (CIN II и CINIII) составляет 75,0%, что более чем в 2 раза превышает данный показатель при поражениях низкой степени CIN I и выявляемостью у данного типа ВПЧ пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом (табл. 1). На втором месте по распространенности во всех группах был 31 тип ВПЧ. На третьем месте у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом и интраэпителиальными пораженями низкой степени был 52 тип (20,0% и 22,2%), соответственно, а у пациенток с СIN III и CIN III – 33 тип (табл.

• 1) . Также отмечено, что, несмотря на наличие интраэпителиального поражения низкой степени тяжести, а также у пациенток с хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами, хоть и с редкой частотой, но были выявлены и все другие тестируемые типы ВПЧ, что подчеркивает важность использования в скрининге заболеваний шейки матки тест системы для идентификации 12 типов ВПЧ ВКР.

На сегодняшний день установлено, что число вирусных копий может отражать тяжесть и прогноз течения папилломавирусной инфекции [7]. Для определения степени вирусной нагрузки в эпителиальных клетках пациенток с хроническим ВПЧ-ассоицированным цервицитом (n=50) и интраэпителиальными поражениями (n=200), была использована отечественная методика количественного определения ДНК ВПЧ на основе ПЦР в реальном времени, на базе которой определяли пороговый уровень клинически значимого количества вируса – 105 геномных эквивалентов ВПЧ (табл. 2).

Анализ полученных результатов позволил выявить клинически значимую (более 3 x 10 5 клеток) вирусную нагрузку у 52 (37,1%) пациенток и высокую вирусную нагрузку у 88 (62,9%) пациенток с CIN II и CIN III. Незначимой (менее 3 x 10 5 клеток) вирусной нагрузки у данной категории пациенток выявлено не было (табл. 3).

У пациенток с CIN I в 51 (85,0%) случаев определялась низкая вирусная нагрузка, у 9 (15%) пациенток диагностирована высокая вирусная нагрузка. При анализе вирусной нагрузки у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом только в 4 (8,0%) случаев была диагностирована высокая вирусная нагрузка, у остальной части данной категории пациенток определялась низкая вирусная нагрузка.

Таким образом, на основании проведенного исследования у пациенток с CIN II, III выявлены достоверно более высокие концентрации ДНК вируса по сравнению с ВПЧ позитивными пациентками с отсутствием интраэпителиального поражения в гистологических образцах и с пациентками, имеющими поражения низкой степени тяжести (CIN I). Это согласуется и с работами других авторов, свидетельствующих о том, что высокая вирусная нагрузка ВПЧ

Таблица 1

Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с хроническим ВПЧ ассоиированным цервицитом и наличием интраэпителиального поражения

Типы ВПЧ	Эндоцервикоз (n=50)		CIN I (n=60)		CIN II + CIN III (n=140)
	Кол-во	%	Кол-во	%	Кол-во	%
16	18	36,0	24	40,0	105	75,0
18	3	4,0	8	13,3	14	10,0
31	13	26,0	16	26,7	28	20,0
33	7	14,0	9	15,0	25	17,8
35	3	4,0	2	3,3	4	2,9
39	4	8,0	9	15,0	11	7,9
45	4	8,0	5	8,3	6	4,3
51	3	6,0	6	10,0	8	5,7
52	11	22,0	12	20,0	9	6,4
56	5	10,0	5	8,3	6	4,3
58	3	4,0	4	6,7	7	5,0
59	3	4,0	3	5,0	3	2,1

Таблица 2

Степень вирусной нагрузки у пациенток основной группы, n=250

Вирусная нагрузка	Гистологический диагноз
	Эндоцервикоз (n=50)	CIN I (n=60)	CIN II, III (n=140)
Диапазон вирусной нагрузки	0,6–4,7	0,5–6,7	3,2–7,9
Средняя вирусная нагрузка	2,5±2,4	3,1±2,6	5,7±1,9

Таблица 3

Оценка вирусной нагрузки у пациенток основной группы

Уровень вирусной нагрузки Гистологический диагноз Эндоцервикоз (n=50) CIN I (n=60) CIN II, III (n=140) абс. % абс. % абс. % Клинически значимая (>3x105) 0 0,0 0 0,0 52 37,1 Высокая (3x105) 4 8,0 9 15,0 88 62,9 Низкая (<3x105) 46 92,0 51 85,0 0 0,0 является фактором риска цервикальных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести. Выявление вируса в количестве не выше определенного порогового уровня имеет низкое клиническое значение (порог клинической значимости), так как говорит о высокой вероятности спонтанного излечения и практически полном отсутствии риска прогрессии [7, 9].

Выводы

• 1.    Все типы высокого онкогенного риска вируса папилломы человека с различной частотой выявляются у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, что предопределяет необходимость их тотального генотипирования при патологических процессах шейки матки.

• 2.    Более чем у половины пациенток (52,1%) с хроническим цервицитом выявляются различные типы вируса папилломы человека высокого онкогенного риска, которые составляют группу повышенного риска по развитию цервикальных интраэпителиальных поражений.

• 3.    Высокая вирусная нагрузка ВПЧ ассоциирована с цервикальными интраэпителиальными поражениями высокой

степени тяжести, выявление вируса папилломы человека в количестве, не превышающем порогового уровня (менее 3 x 10 5 клеток), свидетельствует об отсутствии вероятности тяжелого поражения шейки матки.