Роль желатиназы в и магния в нарушении баланса между факторами агрессии и механизмами защиты при экспериментальной ацетатной язве желудка

В формировании эрозий и язв желудочнокишечного тракта по-прежнему значимую роль отводят нарушению баланса между факторами агрессии и механизмами защиты [1]. Факторы агрессии повреждают как «слизистый барьер», так и ткани стенки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). К таким факторам относятся соляная кислота, пепсиногены, включая катепсины, перекиси, свободные радикалы, желчные кислоты и т. д.

Точкой приложения действия повреждающих факторов служит как клеточный компонент тканей стенки ЖКТ, так и межклеточный матрикс [3, 4]. В метаболизме матрикса, в его создании и деструкции важную роль играют матриксные металлопротеиназы (ММП) [7].

В механизмах резистентности значимую роль играет скорость репарации, в реализации которой участвуют ферменты энергообразования и энергопотребления, синтеза белков, липопротеинов и других биологических макромолекул. Известно, что в активации более чем 300 ферментов энергообразования значимую роль играет магний, он необходим также для синтеза белков [10, 14, 15].

Дефицит магния в организме приводит к активации ММП на фоне системной соединительнотканной дисплазии [2–4, 11, 13].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Определить роль удельного числа желатиназа В позитивных клеток, интенсивность их экспрессии в тканях желудка, уровень клеточного внутриэритроцитарного магния в сдвиге баланса между факторами агрессии и механизмами защиты в тканях при экспериментальном эрозивноязвенном повреждении желудка.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 18 белых крысах линии Вистар обоего пола массой (198 ± 3,8) г, находящихся на стандартной диете, с соблюдением правил проведения работ с экспериментальными животными [ETS-123 от 18.03.1986; Beauchamp T. L., Childress O. F., Principles of Biomedical Ethics. N.Y., Oxford, 1989; Федеральный закон от 24 апреля 1995 г. № 52-Ф3 «О животном мире»; стандарты GLP – правила лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 г. № 266)].

Животные были разделены на три группы: интактную, контрольную и экспериментальную. На крысах экспериментальной группы моделировали ацетатную язву по методу С. Окабэ

• (2005)    под нембуталовым наркозом из расчета 30 мг/кг массы. Крысам контрольной группы выполняли те же манипуляции, что и в экспериментальной группе, но не моделировали язвенного дефекта. Каждая группа животных включала по 6 крыс.

Животных выводили из эксперимента на 7-е сутки от момента моделирования с получением биологического материала: кровь из подключичной и воротной вен, и тканей из изъязвленной зоны препилорического отдела желудка.

Исследование активности желатиназы В проводили иммуногистохимическим методом по стандартной методике с использованием антител фирмы «Novocastra» (NCL–ММР9, для парафиновых блоков, рабочее разведение 1:40) [6]. В препаратах покровного эпителия (ПЭ) и собственной пластинки слизистой оболочки (клеточный компонент), (СПСО) при 400-кратном увеличении оценивали удельное число (в %) положительно окрашенных клеток. Реакция окрашивания оценивалась по трехбалльной шкале [9, 11].

Транспорт и перераспределение магния в организме оценивали по его уровню в эритроцитарном и плазменном пулах крови из подключичной, воротной вен. Содержание магния в эритроцитарной массе определяли по реакции с титановым желтым, содержание магния в плазме и лимфе – набором фирмы «Лахема» [5].

Средние величины при нормальном распределении выражались как М ± t, значимость различий оценивали по коэффициенту Стьюдента; при распределении отличном от нормального – как медиана (Me), 25 и 75 перцентиль, достоверность различий оценивали с применением критерия Уилкоксона при уровне значимости Q < 0,05. Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики с использованием стандартного пакета анализа с помощью электронных таблиц Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На 7-е сутки с момента моделирования формировалась типичная язва, обычно кратерообразной формы с грануляционным валом, отечностью, гиперемией, а также геморрагиями в слизистой оболочке. Площадь язвенного дефекта 30,95 ± 6,7 мм2.

Как видно из табл. 1, удельное число и интенсивность экспрессии желатиназа В -позитивных клеток в тканях желудка у интактных животных была слабо выражена.

В контрольной группе на фоне умеренной стресс-реакции отмечалась статистически незначимая активация желатиназы В в ПЭ и в СПСО желудка (клеточный компонент), приводящая, видимо, к ускорению обновления слизистой оболочки.

При экспериментальной ацетатной язве желудка в зоне воспалительной инфильтрации в покровном эпителии желудка выявлено увеличение интенсивности экспрессии (Q < 0,05) при наметившейся тенденции к увеличению удельного числа желатиназа В -позитивных клеток (Q > 0,05). Наряду с этим в СПСО желудка (клеточный компонент) отмечалось увеличение удельного числа желатиназа В -позитивных клеток (Q < 0,05) при максимально высокой интенсивности их окраски (Q < 0,05).

Таблица 1

Удельное число и интенсивность экспрессии желатиназа В-позитивных клеток при экспериментальной ацетатной язве желудка на 7-е сутки с момента моделирования [25 и 75 перцентили]

Показатели		Исходное состояние	Контроль	Ацетатная язва
Покровный эпителий СОЖ	удельное число	10 [10; 10]	42,5 [17,5; 48,75]	52,5 [50; 62,5]
	интенсивность экспрессии	1,5 [1; 2]	1,5 [1; 2]	3 [3; 3]*
СПСО (клеточный компонент СОЖ)	удельное число	15 [2,5; 20]	32,5 [12,5; 48,75]	77,5 [55; 100]*
	интенсивность экспрессии	1,5 [0,25; 2]	2 [1,25; 2]	3 [3; 3]*

* Достоверность различий между показателями в контрольной группе и при экспериментальной ацетатной язве желудка, Q < 0,05.

Известно, что слизистая оболочка ЖКТ отличается высокой скоростью обновления, продолжительность прохождения клеток по ворсинке кишечника составляет 3–4 суток [1, 4]. Возрастание показателей активности желатиназы В на фоне клинических признаков воспаления у крыс на 7-е сутки с момента моделирования язвенного дефекта и достаточно большой площадью изъязвления свидетельствует, очевидно, об усилении деструктивно-воспалительных процессов в тканях зоны язвенного дефекта [11].

В пользу такого допущения свидетельствует выявленная достоверная корреляционная связь между площадью язвенного дефекта и удельным числом желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии СОЖ (r = 0,7), числом и интенсивностью экспрессии в СПСО (клеточный компонент), (r = 0,33) и (r = 0,74) соответственно. Анализ показывает, что в этот период увеличение показателей активности желатиназы В является фактором агрессии, приводящим к увеличению площади язвенного дефекта.

Нарастание активности желатиназы В в зоне воспалительного инфильтрата на фоне сформировавшейся ацетатной язвы сопровождалось снижением концентрации магния в эритроцитарной массе крови из подключичной вены в 1,3 раза (р < 0,05), в то время как в крови воротной вены его уровень практически оставался неизменным (p > 0,1).

Концентрация магния в плазме крови из подключичной, воротной вен на 7-е сутки с момента моделирования язвы по отношению к контролю значимо не изменялась (p > 0,01), (табл. 2).

Таблица 2

Содержание магния в эритроцитарной массе, плазме крови (ммоль/л) у крыс при экспериментальной ацетатной язве желудка на 7-е сутки с момента моделирования (М ± m)

Кровь (ммоль/л)	Исходное состояние	Контроль	Ацетатная язва
Подключичная вена (эритроцитарная масса)	1,520 ± 0,089	1,800 ± 0,105 **	1,320 ± 0,082 ** ¤
Воротная вена (эритроцитарная масса)	1,480 ± 0,130	1,650 ± 0,110	1,690 ± 0,105
Подключичная вена (плазма)	0,981 ± 0,015	0,917 ± 0,011 *	0,914 ± 0,026 **
Воротная вена (плазма)	1,020 ± 0,013	0,884 ± 0,006 ***	0,923 ± 0,020 ***

По отношению к исходному состоянию: * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001; по отношению к контролю: ¤ – p < 0,05; # – p < 0,001 – достоверность различий между ацетатной язвой и ацетатной язвой на фоне применения МСК.

Известно, что в период завершения формирования экспериментального язвенного дефекта в тканях зоны изъязвления уровень магния значительно снижается [6, 9, 12, 13], что является, очевидно, фактором свидетельствующим о мембранных повреждениях, приводящих или к усилению его потерь клеткой или нарушению его накопления в ней.

При корреляционном анализе выявлена значимая отрицательная связь между уровнем внутриэритроцитарного магния из подключичной вены, удельным числом желатиназа В позитивных клеток (r = –0,59), а также площадью язвенного дефекта (r = –0,89). Нарушение механизмов аккумуляции и потребления клетками магния и значимая роль магния в активации ферментов энергообразования и энергопотребления в реализации процессов пролиферации приводит к замедлению процессов репарации язвенного дефекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При экспериментальной ацетатной язве желудка снижение содержания внутриэритро-цитарного магния и увеличение удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназы В в тканях желудка сопряжено с формированием язвенного дефекта большего размера.