Ростостимулирующее действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на ювенильные растения пшеницы

Введение. Пшеница является ведущей зерновой культурой, обладает высокой интенсивностью и урожайностью. Она выращивается в разных почвенно-климатических условиях [1]. Это обусловливает разнообразие фитопатогенов, поражающих растения, и, как следствие, применение всевозможных пестицидов. Большинство применяемых пестицидов имеет небиологическое происхождение. Их систематическое использование негативно сказывается на продукции [2].

Экологизация сельского хозяйства доказывает возможность использования биологических агентов в качестве важного средства решения вопросов современной агротехники [3].

Особое внимание следует уделить проблеме иммунизации растений и стимуляции их роста. Предпосевная обработка семян биопрепаратами способствует более интенсивному накоплению биомассы растениями, увеличению синтеза витаминов и фитогор- монов, а также повышению резистентности растений к фитопатогенам [4]. Кроме того, следует отметить сравнительно небольшую концентрацию рабочих растворов биопрепаратов и цикличность их применения [5].

Микробиологические препараты представляют собой как живые клетки отселекти-рованных по полезным свойствам микроорганизмов, так и продукты их жизнедеятельности, оказывающие прямое либо опосредованное действие на растения [5]. В литературе имеются данные о том, что подобные свойства проявляются у некоторых подвидов Bacillus thuringiensis. В частности, отмечена способность дельта-эндотоксина стимулировать развитие проростков фасоли и огурца [6].

Известно, что функциональным компонентом B. thuringiensis являются параспо-ральные кристаллы дельта-эндотоксина, обладающие антибиотическими и антифунгаль-ными свойствами в отношении целого ряда фитопатогенов [7, 8].

Цель исследования. Изучение возможного ростостимулирующего действия дельтаэндотоксина B. thuringiensis на пшеницу мягкую.

Материалы и методы. В работе в качестве продуцента дельта-эндотоксина был использован штамм 202 B. thuringiensis ssp. thuringiensis. Культура получена из ФГБУ ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва). В качестве объекта исследования использовали семена пшеницы яровой мягкой сорта «алтайская 105» фирмы «Живые продукты Алтая». Поверхностное культивирование B. thuringiensis осуществляли в термостатах при 27 ° С в чашках Петри на питательной среде РПА.

Биомассу B. thuringiensis , содержащую кристаллы эндотоксина и споры продуцента, отмывали дистиллированной водой от водорастворимых токсинов. Путем центрифугирования суспензии кристаллы и споры осаждали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ре-суспендировали и удаляли элементы твердой питательной среды центрифугированием при 500 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант содержал спорово-кристаллический комплекс. Кристаллы отделяли от спор последовательно путем флотации и экстракции в двухфазной среде хлороформ-водного раствора Na 2 SO 4 . Щелочной гидролиз кристаллов проводили по методу Cooksey [9]. Затем раствор подвергали диализу и доводили водой до необходимой концентрации. рН раствора снижали до 7,8 титрованием 0,1 н. HCl. Доочистку дельта-эндотоксина осуществляли микрофильтрацией (диаметр пор 0,4 мкм). Количество белкового дельта-эндотоксина определяли по методу Лоури [10].

Энергию прорастания семян определяли на 4-й день инкубации путем подсчета числа проросших семян и выражали в процентах от первоначально взятого количества. Лабораторную всхожесть семян определяли на 7-й день проращивания. Для этого подсчитывали число проросших семян и выражали в процентах от первоначально взятого количества (ГОСТ 8074-82).

Влияние концентрации дельта-эндотоксина на всхожесть и энергию прорастания семян оценивали в ходе проращивания семян в чашках Петри на бумажной подложке, обработанной растворами дельта-эндотоксина в концентрации от 0,1 до 1,5 %.

После этого опытные образцы обрабатывали в 0,6 % растворе дельта-эндотоксина в течение 30 мин, а контрольные – в воде. Дальнейшее проращивание семян осуществляли в пробирках на стерильном увлажненном песке при 28–30 оС в условиях шестнадцатичасового светового дня. Полив осуществляли с интервалом в 24 ч в течение 10 сут. В варианте с предварительной обработкой полив осуществлялся водой, в варианте с постоянной обработкой – 0,6 % раствором дельта-эндотоксина. В каждом варианте оценивали по 20 растений в соответствии с ГОСТ 123038–84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести».

Для определения гетероауксина и аскорбиновой кислоты растения фиксировали, проводя через серию спиртовых растворов: 20, 40, 60, 80 % – по 30 мин, 96 и 100 % – в течение 1 ч в каждом. Полученный материал пропитывали последовательно смесью абсолютного спирта и ксилола в соотношениях 3:1, 2:2 и 1:3 по 1 ч в каждом. Фиксацию заканчивали замещением промежуточной жидкости парафином: использовали ксилол и парафин при температуре 56 оС до полного испарения ксилола (в течение 3–6 сут) с последующей заливкой материала в парафин. При помощи микротома получали срезы толщиной 8 мкм и наклеивали их на предметные стекла. Препарат просушивали при 40–50 оС, удаляли парафин последовательно ксилолом, 96 % спиртом и дистиллированной водой, обезвоживали 96 и 100 % растворами этилового спирта в течение 2 ч. Спирт в срезах замещали на ксилол. Срезы заключали в канадский бальзам и просушивали [11].

Определение гетероауксина осуществляли с использованием реактива Сальковского, состоящего из 0,1 г железоаммонийных квасцов и 100 мл 50 % раствора серной кислоты, в течение 20 мин при комнатной температуре [11].

Окрашивание аскорбиновой кислоты проводили с использованием реактива Жиру, представляющего смесь 5 % раствора нитрата серебра и 5 % раствора уксусной кислоты, в течение 15–20 мин в темноте. Наблюдали выпадение черных кристаллов восстановленного серебра [11].

Обработку полученных данных проводили по методике «МЕКОС» на микроскопе Zeiss Axiostarplus (ГОСТ 8074–82 «Микроскопы инструментальные»).

Все эксперименты проводили в 10-кратной повторности по 20 растений в каждой.

Все полученные данные подвергли статистической обработке по методу Стьюдента [12].

Результаты и обсуждение. Анализ влияния дельта-эндотоксина в разных концентрациях на энергию прорастания и лабораторную всхожесть семян показал, что наиболее эффективной для предпосевного замачивания является концентрация 0,6 % (рис. 1).

Рис. 1. Влияние дельта-эндотоксина на энергию прорастания семян пшеницы мягкой

Полученные данные демонстрируют возрастание энергии прорастания семян при увеличении концентрации раствора дельтаэндотоксина от 0,1 до 0,6 %. Далее при увеличении концентрации дельта-эндотоксина от 0,6 до 1,5 % наблюдается снижение энергии прорастания.

Анализ лабораторной всхожести семян показал, что при росте концентрации раствора дельта-эндотоксина от 0,1 до 0,6 % происходит увеличение всхожести (рис. 2), при увеличении концентрации дельта-эндотоксина от 0,6 до 1,5 % – уменьшение.

Рис. 2. Влияние дельта-эндотоксина на лабораторную всхожесть семян пшеницы мягкой

Таблица 1

Вариант опыта			Сырая масса проростка, г	Длина стебля, мм	Длина корня, мм	Длина листа по средней жилке, мм	Обхват стебля, мм
1	Контроль		0,203±0,006	103,0±0,5	52,0±0,5	61,0±0,4	3,0±0,1
2	Дельта-эндотоксин (предварительная обработка)*		0,275±0,008	168,0±0,6	63,0±0,5	128,0±0,5	4,0±0,1
3	Дельтаэндотоксин**		0,208±0,006	110,0±0,5	55,0±0,4	77,0±0,4	3,0±0,1
Разница по сравнению с контролем, %		2	35,468	63,1	21,2	109,8	25
		3	2,463	6,8	5,8	26,2	0

Примечание. * – семена обрабатывали дельта-эндотоксином только перед посадкой, в дальнейшем осуществляли полив дистиллированной водой; ** – растения обрабатывали раствором дельта-эндотоксина в течение всего периода.

Влияние дельта-эндотоксина на морфологические показатели (n=200)

В табл. 1 представлены результаты, демонстрирующие изменение морфометрических показателей проростков растений: увеличение массы проростков по сравнению с контрольными образцами на 35,4 % при предварительной обработке дельта-эндотоксином, на 2,4 % при обработке растений дельта-эндотоксином в течение всего эксперимента. Показано увеличение длины корня на 21,2 % при предварительной обработке дельта-эндотоксином и на 5,8 % при постоянном его использовании. Полученные результаты также демонстрируют увеличение обхвата стебля на 25 % при предварительной обработке, в то время как при постоянной обработке увеличения показателей не наблюдалось. Показано увеличение длины стебля на 63,1 % по сравнению с контролем при предварительной обработке и на 6,8 % – при постоянной. Отмечено увеличение длины листа по средней жилке на 109,8 и 26,2 % соответственно.

Важным показателем, характеризующим рост растений и устойчивость к неблагоприятным факторам среды, является содержание в тканях растений гетероауксина и аскорбиновой кислоты.

Гетероауксин (р-индолилуксусная кислота, ИУК), являющийся производным индола, синтезируется в растении из аминокислоты триптофана. Образование ИУК зависит от снабжения растения питательными вещест- вами, особенно азотом и водой. ИУК образуется в очень малых количествах.

У высших растений ИУК синтезируется прежде всего в верхушечной меристеме и в прилегающих к ней молодых листочках, в растущих зародышах, семяпочках и семядолях, верхушках корней.

Гетероауксин, являясь растительным гормоном, контролирует разнообразные обменные процессы в растительных тканях, как анаболические, так и катаболические, усиливая рост тканей и всего растения [13].

На микрографии (рис. 3) представлена типичная картина изменения содержания гетероауксина. Площадь окрашенных кристаллов гетероауксина в меристеме пшеницы мягкой в контрольном образце составляет 40±1 мкм, а на экземпляре с дельта-эндотоксином – 60±2 мкм.

В настоящее время полагают, что аскорбиновая кислота синтезируется в растениях из Д-глюкозы и Д-галактозы независимыми путями.

Больше всего аскорбиновой кислоты синтезируется в листьях растений, особенно на солнечной стороне. В период подготовки к цветению количество аскорбиновой кислоты достигает максимума. Растения, содержащие большое количество аскорбиновой кислоты, характеризуются повышенной морозо- и га-зоустойчивостью. Участвуя в окислительновосстановительных процессах, аскорбиновая кислота оказывает активирующее действие на ферменты, являясь коферментом, способствует нормальному развитию и повышению сопротивляемости организма к неблагоприятным факторам внешней среды [14].

На микрографии (рис. 4) представлена типичная картина зон распределения аскорбиновой кислоты. Площадь окрашенных кри- сталлов аскорбиновой кислоты в тканях пшеницы мягкой в контрольном варианте составляет 50±1 мкм, а на образце с дельта-эндотоксином – 85±2 мкм.

Таким образом, показано увеличение синтеза гетероауксина и аскорбиновой кислоты в тканях пшеницы мягкой и связанное с ним увеличение морфометрических показателей.

а

б

Рис. 3. Влияние дельта-эндотоксина на синтез гетероауксина: а) контроль; б) дельта-эндотоксин

а

б

Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина на синтез аскорбиновой кислоты: а) контроль; б) дельта-эндотоксин

Выявленный ростостимулирующий эффект может быть следствием как прямого стимулирующего воздействия дельта-эндотоксина на растения, так и общего оздоровления растений, связанного с подавлением фитопатогенов, которыми могут быть контаминированы семена [15].

Выводы:

• 1.    Предварительная обработка семян пшеницы мягкой раствором кристаллов дель-

• та-эндотоксина B. thuringiensis в концентрации 0,6 %, а также обработка растений в течение всего эксперимента обеспечивает достоверное увеличение морфометрических показателей (длины листа по средней жилке, обхвата стебля, массы растения, длины корня).

• 2.    Обработка дельта-эндотоксином Bacillus thuringiensis приводит к достоверному увеличению синтеза гетероауксина (50 %) и аскорбиновой кислоты (70 %).