Сапрофитные дрожжи Rhodotorula mucilaginosa: молекулярная идентификация, морфобиохимические свойства и продукция каротиноидов

Rhodotorula — род сапрофитных дрожжей семейства Sporidiobolaceae (порядок Sporidiales , класс Pucciniomycetes , тип Basidiomycota ), размножение которых осуществляется базидиоспорами. Представители рода Rhodotorula распространены в воздухе, почве, озерах, морской воде, молоке, пищевых продуктах, колонизируют простейших, растения, людей и других млекопитающих (1, 2). Первые упоминания о Rhodotorula mucilaginosa относятся к 1934 году, что отражено в исследованиях Фрэнсиса Чарльза Харрисона (Francis Charles Harrison). Колонии R. mucilaginosa окрашены в оранжевокрасный цвет, влажные, имеют гладкую поверхность, способны продуцировать каротиноиды (3, 4). Дрожжи R. mucilaginosa применяются при промышленном производстве каротиноидов благодаря относительно высокой скорости роста (5, 6), а также служат продуцентами липидов и эссенциальных жирных кислот (7). Отмечена относительная неприхотливость R. mucilaginosa к питательным компонентам при культивировании на разных субстратах. Так, в работе S. Rajan с соавт. (8) для производства каротиноидов R. mucil-aginosa использовались отходы агропромышленного производства, в том числе луковая шелуха, картофельная кожура, шелуха бобов мунг и стручки гороха.

Каротиноиды — это природные жирорастворимые пигменты, большинство из которых представляет собой терпеноиды с 40 атомами углерода. Они содержат две концевые кольцевые системы, соединенные цепочкой сопряженных двойных связей, или полиеновой системой, которые действуют как мембранозащитные антиоксиданты, поглощающие кислород и перок-сильные радикалы. Антиоксидантная способность каротиноидов, возможно, обусловлена их структурой (9, 10).

Каротиноидные пигменты играют важную роль в защите организма, они служат антиоксидантами, обладают антиканцерогенными свойствами, в том числе иммуномодулирующими и онкопротекторными, что способствует нормализации репродуктивной функции, роста и развития сельскохозяйственных животных и птицы (7). Каротиноиды улучшают клеточную коммуникацию и усиливают иммунный ответ у жвачных и моногастричных животных, снижают заболеваемость маститом у молочных коров, преобразовываясь в молочной железе в витамин А, тем самым улучшая качество молока (11). В составе пищевых добавок каротиноиды обладают также антимикробной активностью (12). Обычно корма для животных бедны каротиноидами, поэтому их вносят дополнительно к основному рациону. Лекарственные препараты, а также пищевые и кормовые добавки, содержащие каротиноиды, нашли распространены во всем мире (13).

Извлечение из растительного сырья, химический и микробиологический синтез — распространенные методы промышленного получения каротиноидов. На сегодняшний день все больше возрастает спрос на каротиноиды, полученные из природного сырья, поскольку молекулы, синтезированные химическим путем, могут негативно влиять на организм животного (7). Микробиологическое производство в биореакторах не зависит от географических и сезонных колебаний, определяющих доступность растительного каротиноид-содержащего сырья. Кроме того, использование отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности в качестве сырья для микробиологического синтеза может значительно снизить затраты на производство (14). Так, микроводоросли Dunaliella salina служат крупнейшим коммерческим источником натурального β-каротина. Они способны накапливать в клетках от 10 до 14 % каротина, 57-69 % лютеина и 11-24 % ксантофиллов (15). Spirulina platensis содержит p-каротин в концентрации 700-1700 мг/кг (16). Водоросли D. salina совместно с Spirulina используют в рационах сельскохозяйственных животных и птицы для повышения продуктивности, укрепления иммунитета, улучшения функции почек и печени, липидного профиля и увеличения активности пищеварительных ферментов (17).

Еще одна известная группа продуцентов каротиноидов — каротин-синтезирующие дрожжи родов Phaffia , Rhodotorula , Rhodosporidium , Sporidi-obolus , Sporobolomyces , Cystofilobasidium , Kockovaella (18).

По результатам исследований N. Elfeky с соавт. (19), штамм Rhodot-orula glutinis JMT 21978 способен аккумулировать 1,6 мг/г клеточных каротиноидов с 30 % торулена при культивировании в среде, содержащей глюкозу и дрожжевой экстракт. Продукция торулародина (63 %, 50,5±3,0 мкг/г) из Rhodotorula mucilaginosa была оценена на среде, содержащей ксилозу и глицерин. В этом случае самое высокое содержание каротиноидов составило 121,3 мкг/г (20). Анализ данных литературы показывает значительную вариативность содержания каротиноидов как среди различных видов рода Rhodotorula , так и среди штаммов вида R. mucilaginosa (21). Однако следует отметить, что авторы использовали различные методы экстракции каротиноидов, а также культивирования (твердофазное либо глубинное в жидкой среде), что не позволяет достоверно сопоставить реальное содержание каротиноидов в штаммах.

Метод и условия культивирования оказывают значительное влияние на продукцию каротиноидов дрожжами, при изменении параметров культивирования выход этих метаболитов может заметно различаться (22, 23). J. Da Silva с соавт. (24) при культивировании R. mucilaginosa получили максимальный выход биомассы (12,87 г/л) при температуре 34 ° C и pH 5,0, но максимальный синтез каротиноидов (1,13 г/л) наблюдался при 22 ° C. S. Al-lahkarami с соавт. (25) показали, что повышение температуры до 28 ° C сопровождается ростом образования каротиноидов (2,43 мг/л) у R. mucil-aginosa , в то время как при 35 ° C оно снижается (0,60 мг/л).

S. Landolfo с соавт. (26) провели поиск генов, принимающих участие в биосинтезе каротиноидов у R. mucilaginosa . Было показано, что ключевая роль в этом процессе отводится генам HMG1 (кодирует HMG-CoA-редук-тазу для дальнейшего превращения HMG-CoA в мевалонат), ERG12 (участвует в биосинтезе изопентилпирофосвата — IPP из мевалоната), CAR2 (бифункциональный ген для синтеза фитоена из IPP и ликопина из фитоена), CAR1 (кодирует десатурацию фитоена, что приводит к образованию β -каро-тина), CAR0 (принимает участие в обмене и поддержании гомеостаза каротиноидов). Однако авторы отмечают, что количество каротиноидов, продуцируемых R. mucilaginosa , в большей степени зависит от активности ферментов, а не от транскрипции генов (26).

Перспективным направлением представляется использование дрожжей R. mucilaginosa в рационах сельскохозяйственных животных, что подтверждается рядом исследований. Штамм TZR2014, вводимый перорально поросятам-отъемышам, показал эффективность в улучшении роста, усилении антиоксидантной защиты, оптимизации пищеварения и поддержании кишечного микробиологического баланса (27). Добавление R. mucilaginosa совместно с Trichoderma longibrachiatum в кукурузный силос позволило улучшить качество корма и снизить его потребление без ущерба для продуктивности ягнят (28). Эксперименты in vitro также демонстрируют способность этого вида дрожжей в составе микробного консорциума значимо повышать усвояемость грубых кормов (29).

Результаты исследований подтверждают высокий пробиотический потенциал штамма R. mucilaginosa UFMGCB 18377. В опытах J.O.P.A. Coutinho с соавт. (30) продемонстрировано, что указанный штамм обеспечивает эффективную защиту мышей от сальмонеллеза, значимо повышая выживаемость и уменьшая потерю массы тела по сравнению с контрольной группой, получавшей S. cerevisiae . Терапия R. mucilaginosa также подавляла системное распространение инфекции (транслокация в печень) и снижала интенсивность воспалительного ответа, о чем свидетельствовало уменьшение активности миелопероксидазы и эозинофильной пероксидазы в тканях, а также содержания секреторного иммуноглобулина A (sIgA) в кишечнике (30). В дальнейшем J.O.P.A. Coutinho с соавт. (31) показали, что тот же штамм смягчает течение индуцированного 5-фторурацилом мукозита, предотвращая потерю массы тела, уменьшая повреждение и воспалительную инфильтрацию кишечной стенки, а также подавляя рост условно-патогенных энтеробактерий.

Два независимых исследования подтверждают иммуностимулирующие свойства штамма R. mucilaginosa ZTHY2. Первое исследование выявило его способность усиливать гуморальный и клеточный иммунитет, а также положительно модулировать состав микробиоты кишечника у здоровых мышей (32). Во второй работе было показано, что R. mucilaginosa ZTHY2 обладает терапевтическим потенциалом в условиях индуцированной иммуносупрессии. Его эффективность в ослаблении атрофии иммунных органов и усилении антиоксидантного статуса была сравнима с эффектом контрольного пробиотика Lactobacillus acidophilus (33). Эти результаты указывают на перспективность применения R. mucilaginosa в качестве пробиотика в пищевой промышленности и биотехнологии.

В настоящей работе мы впервые провели комплексное изучение дрожжей Rhodotorula mucilaginosa , выделенных из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. Была установлена их видовая принадлежность по 5.8S-ITS-фрагменту рДНК. Показано, что морфобиохимические свойства имеют высокую внутривидовую вариабельность. Определена оптимальная температура роста. Выявлены лидерные штаммы по продукции каротиноидов на среде без обогащения.

Целью работы было выделение из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы пигментированных дрожжей с последующей идентификацией до вида, культивированием, получением биомассы, оценкой суммарного содержания синтезируемых каротиноидов и их содержания в биомассе, а также выявление наиболее перспективных изолятов для дальнейшего использования в составе кормовой добавки.

Ìåòîäèêà . Работу проводили в 2023-2025 годах. Изоляты дрожжей были выделены из содержимого желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота черно-пестрой породы, помесных боровков F 2 (крупная белая ½ ландрас) ½ дюрок и бройлеров кросса Смена 9 (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста). Выделение проводили на декстрозном агаре Сабуро («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия). Изоляты хранились в бульоне YPD с 5 % глицерином («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия) при - 20 ° C. Для оценки жизнеспособности во время хранения дрожжевые клетки дважды субкультивировали на агаре Сабуро («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия) и среде YPD в течение 24 ч при 30 ° C. Концентрацию клеток определяли по OD 540 с помощью микробиологического анализатора Multiskan FC («ThermoFisher Scientific, Inc.», Финляндия), дрожжи культивировали в среде YPD до плотности суспензии приблизительно 1½10⁵ клеток/мл.

Для выделения ДНК одну колонию, предварительно выращенную на плотной среде ДАП (10 % пептона, 10 % глюкоза, 10 % дрожжевой экстракт, 15 % агар), переносили в 2 мл жидкой среды ДАП и культивировали 24 ч на качалке (Series 25 Incubator Shaker, «New Brunswick Scientific Co., Inc.», США) (120 об/мин) при 30 ° C. Дрожжевую биомассу для выделения ДНК получали центрифугированием на Beckman J2-21 («Beckman Coulter», США) при 4000 об/мин в течение 15 мин. ДНК выделяли с использованием набора D-Plants по протоколу фирмы-изготовителя (ООО «Биолабмикс», Россия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплифика-торе Mini Amp Plus («Thermo Fisher Scientific», Сингапур). Для амплификации 5.8S-ITS-фрагмента рДНК и определения его первичной нуклеотидной последовательности использовали олигонуклеотидные праймеры ITS1 (5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3´) и ITS4 (5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´). Синтез праймеров осуществляли в компании ООО «Биолаб-микс» (Россия). Условия ПЦР-амплификации были следующими: 1 мин при 94 ° C; 10 с при 94 ° C (денатурация), 10 с при 56 ° С (отжиг праймеров), 17 с при 72 ° С (синтез ДНК) (35 циклов); 5 мин при 72 ° C (финальная элонгация). Реакцию проводили при конечной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов 200 мкМ и 1,5 мМ MgCl 2 .

Электрофорез ДНК осуществляли в 1,0 % агарозном геле при 60 В в 0,5½TBE буфере (45 мМ Tris-HCl, 10 мМ EDTA, 45 мМ борной кислоты) в течение 1,5 ч. ДНК визуализировали окрашиванием геля в растворе бромистого этидия с просмотром в УФ-свете (система визуализации MaXidoc G2, «DAIHAN Scientific Co., Ltd.», Корея) для подтверждения присутствия полос фрагментов размером ~ 500-700 п.н. В качестве маркера молекулярных масс использовали Step50 plus и Step100 long (ООО «Биолабмикс», Россия).

Секвенирование образцов по методу Сэнгера проводилось в ЗАО «Евроген» (Россия) в соответствии с принятым в компании регламентом.

Сборку нуклеотидных последовательностей фрагмента рДНК, полученных с прямым и обратным праймерами, осуществляли с помощью программы Contig Express пакета Vector NTI 10.0 («Thermo Fisher Scientific», США). Идентификацию выделенных изолятов дрожжей проводили с использованием филогенетического подхода и нуклеотидного подобия. Анализ идентичности нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи программы BLASTN . Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы Clustal W программного пакета Unipro UGENE 49.0 (34). Анализ сходства нуклеотидов и построение филогенетического дерева выполняли в программе MEGA v.11.

Для микроскопического исследования проводили стандартное окрашивание метиленовым синим, чтобы определить форму клеток. Морфологические свойства и чистоту изолятов проверяли под световым микроскопом Nicon ECLIPSE Ci-L («Nicon», Япония) при увеличении 100½16. Полученные с помощью камеры микрофотографии, сделанных по завершении культивирования, анализировали с использованием программного обеспечения Basler PowerPack («Basler Vision Technologies», Германия). По микрофотографиям определяли линейные размеры клеток (длину и ширину). Для каждого изолята проанализировали по 17 клеток в 5 повторностях (всего 85 клеток).

Морфологическую характеристику и физиологические тесты, в частности рост штаммов на средах с высоким осмотическим давлением (50 % глюкозы, 60 % глюкозы, 10 % NaCl + 5 % глюкозы), рост при разных температурах (19, 25, 30, 35, 37, 40 и 45 °C) проводили по C.P. Kurtzman с соавт. (35).

Биохимический профиль определяли с использованием тест-системы KB009R HiCarbo («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия) и специфических сахаров (глюкоза, мальтоза, лактоза, манит, сахароза, ксилоза, рамноза, раффиноза, фруктоза, целлобиоза, манноза, трегалоза, L-арабиноза, мели-биоза, галактоза, мелицитоза, декстроза, инулин, натрия глюконат, глицерол, салицин, дульцит, инозит, адонит, арабитол, эритрит, a -метил-D-глю-козид, ксилитол, ONPG — орто-нитрофенил- в -D-галактопиранозид, эску-лин, D-арабиноза, цитрат, малонат, сорбоза, сорбит, L-рамноза салицин). Интерпретацию результатов проводили согласно «HiBio-ID Инструкция по применению — Наборы для идентификации микроорганизмов» (36).

Пигменты экстрагировали из образцов, каждый из которых содержал замороженную сырую биомассу дрожжей одного из изолятов (от 5 до 20 г). Навеску сырой биомассы размораживали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем ее заливали 2-кратным избытком (масса/объем) 1 М соляной кислоты, переносили в пробирку объемом 50 мл. Далее клеточную биомассу разрушали на водяной бане («IKA-Werke GmbH & Co. KG», Германия) при 90 ° С в течение 15 мин, периодически перемешивая. Затем все содержимое пробирки переливали в стеклянный лабораторный стакан подходящего объема и добавляли охлажденный ацетон (ЧДА, ООО ТД «Химмед», Россия) в соотношении 1:10 (объем/объем). Экстракцию вторичных метаболитов проводили в течение 40 мин при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего экстракт выдерживали при температуре 4-6 ° С в течение ночи для достижения эффективного осаждения белков. После этого переносили экстракт в пробирки объемом 50 мл и центрифугировали (Beckman J2-21, «Beckman Coulter», США) 10 мин при 5000 об/мин. Аккуратно отбирали супернатант и концентрировали его в роторном испарителе («IKA-Werke GmbH & Co. KG», Германия) до объема приблизительно 30-45 мл, далее переносили в пробирки объемом 15 мл и выдерживали при 4-6 ° С в течение ночи для разделения полярной (слабо окрашенной нижней) и неполярной (интенсивно окрашенной верхней) фаз. Аккуратно отбирали полярную фазу и перерастворяли неполярный остаток в смеси гексан:этилацетат (ХЧ, ООО ТД «Химмед», Россия) в соотношении растворителей 2:1 (объем/объем), доводя суммарный объем до 10 мл, затем перемешивали переворачиванием. Содержание каротиноидов в экстракте определяли спектрофотометрически на спектрофотометре UV-1800 («Shim-adzu Corp.», Япония). Спектры поглощения измеряли в диапазоне X = 300600 нм. Длина оптического пути составляла 1 см.

Количественное содержание пигментов определяли по методике, описанной О.П. Червяковой с соавт. (37), с использованием следующих формул: С 1 = 3,9D 450 + 1,8D 537 - 3,6D 509 (мкг/мл) (для пигментов в -каротино-идной природы); С 2 = 5,3D 509 - 6,7 D 537 (мкг/мл) (для торулина и его ана-логов/гомологов); С з = 6,7D 537 - 1,1D 509 (мкг/мл) (для пигментов группы ретинола).

Для статистической обработки морфологических и биохимических данных применяли программу STATISTICA v.13 («StatSoft, Inc.», США, 2011; . Данные представлены как средние арифметические и стандартные ошибки средних (M±SEM).

Результаты. Идентификация изолятов на основе анализа последовательности 5.8S-ITS рДНК показала, что выделенные красные дрожжи относятся к виду R. mucilaginosa .

С использованием праймеров ITS1/ITS4 для области гена 5.8-S рДНК была выполнена амплификация соответствующих фрагментов ДНК изоля-тов. Эти праймеры позволяют получить ПЦР-продукт размером 500-700 п.н. (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации области гена 5.8S-ITS рДНК изолятов, выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы: 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14 — изоляты, идентифицированные как дрожжи Rhodotorula mucilaginosa , 19 — ДНК маркер Step100 long (ООО «Биолабмикс», Россия), 20 — ДНК маркер Step50 plus (ООО «Биолабмикс», Россия). Остальные образцы (дорожки) при идентификации не были отнесены к R. mucilaginosa (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2024 год).

Секвенирование ампликона для региона ITS1-5.8S-ITS4 позволило получить нуклеотидные последовательности длиной 608-640 п.н. Анализ полученных и доступных в базе данных NCBI нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLASTN показал 99 % гомологию участка рДНК изолятов Cm 17, Pf 11, Chc 2, Sr 9, Sr 18, Sr 16, Chc 6, Pf 26 Pf 39, Sr 24, Chc 8, Cr 32, Sr 89, Sr 14 Pf 10 и Pf 77 с соответствующими фрагментами штаммов и изолятов R. mucilaginosa PMM08-3684L, 120051ZA, CBS 316, ASPSP121 и R. affinis mucilaginosa 3142.2A37 (GenBank-номера соответственно KP132584.1:39-659, PV330530.1, NR_073296.1, PQ248788.1, MW620056.1). Анализ нуклеотидных последовательностей изолятов Chc 60, Chli 32, Chli 49, Chc 65, Cm 70 Chc 7 и Sr 40 показал 99 % гомологию участка рДНК с соответствующими фрагментами у штаммов и изолятов R. mucilaginosa T159, PMM08-1716L, AM25 (GenBank-номера PV244485.1, KP132583.1:8-682, KM246181.1). Нуклеотидная последовательность изолята Chc 12 показала 99 % гомологию участка рДНК с соответствующими фрагментами у изолятов R. mucilaginosa B10S1030CL2F и B10S10030CL1F (GenBank-номера PV240725.1, PV240734.1), а нуклеотидная последовательность изолятов Pf 13 и Pf 22 — 99 % гомологию с фрагментами нуклеотидных последовательностей штамма R. mucilaginosa strain JCM 8169 (GenBank-номер AB038074.1) .

На основании этих результатов 26 дрожжевых изолятов были идентифицированы как R. mucilaginosa. Филогенетическое дерево было построено для всех выделенных штаммов и показано на рисунке 2.

Колонии всех изолятов, выращенных на среде ДАП, имели оттенок оранжево-красного цвета, были круглыми, выпуклыми, поверхность колоний была гладкой, края ровными, структура однородной (рис. 3). В бульоне Сабуро культивирование сопровождалось присутствием пленки, взвеси и помутнением среды. По отношению к кислороду изоляты были факультативными анаэробами. Наблюдались одноклеточные бластоконидии шаровидной или удлиненной формы. Гифы и псевдогифы отсутствовали. Оптимальная температура роста составляла 19-30 ° С, слабый рост наблюдался при 35 ° С, отсутствие роста — при 37-45 ° С. Присутствие 50 и 60 % глюкозы, 10 % NaCl + 5 % глюкозы в среде оказало ингибирующее действие на рост штаммов.

Дрожжи были охарактеризованы в отношении ассимиляции сахаров — источников углерода. Все 26 изолятов R. mucilaginosa утилизировали глюкозу, декстрозу, маннозу, раффинозу, сахарозу и фруктозу, 21 изолят — галактозу и цитрат, 18 — эскулин, 16 — инулин и сорбозу, 14 — глицерол, 13 — ксилозу, 12 — мелецитозу и салицин, 11 — трегалозу, 10 — L-арабинозу и мальтозу, 9 — D-арабинозу и целлобиозу, 5 — α-метил-D-глюкозид, маннит и рамнозу (табл. 1).

R. mucilaginosa KPI32584.1:39-659

R. mucilaginosa Pf 11

R. mucilaginosa Sr 18

R. mucilaginosa Sr 16

R. mucilaginosa Pf 77

R. mucilaginosa Cm 17

R. mucilaginosa PQ248788.1

R. mucilaginosa Pf 39

R. mucilaginosa Pf 26

R. mucilaginosa PV330530.1

R. mucilaginosa Sr 32

R. mucilaginosa NR 073296.1

R. mucilaginosa Sr 14

R. mucilaginosa Pf 10

R. mucilaginosa Che 2

R. mucilaginosa Sr 9

R. mucilaginosa Che 8

R. mucilaginosa Che 6

R. mucilaginosa Sr 24

R. mucilaginosa Sr 89

R. aff. mucilaginosa MW620O56.1

R. mucilaginosa Che 60

R mucilaginosa Che 32

R. mucilaginosa Chli 49

R. mucilaginosa PV244485.1

R. mucilaginosa KP132583.1:8-682

R. mucilaginosa Sr 40

R. mucilaginosa Che 7

R. mucilaginosa Che 65

R mucilaginosa Cm 70

5J

R. mucilaginosa KM246181.1

• -R. mucilaginosa Pf 13

R. mucilaginosa Che 12

R. mucilaginosa Pf 22

R. mucilaginosa PV24O731.1

R. mucilaginosa PV240730.1

— R. mucilaginosa ABO38O74.1

R. aff. pacifica OR064136.1

R. taiwanensis NR 157462.1

----R sphaerocarpa NR 073269.1

R toruloides t4R 153295.1

ИгА araucariae NR 073277.1

I— R. kralochvilovae NR 073282.1

99 I-------- R. diobovata NR 073271.1

r-R glutinis NR 073294.1

JHj— R. graminis NR 073273.1 521-R babjevae NR 077096.1

R paludigena NR 073265.1

S. para rosens NR 155770.1

0,020

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS4, демонстрирует положение изолятов, изученных в настоящей работе, среди референсных штаммов рода Rhodotorula из базы данных GenBank NCBI (программа MEGA v.11) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2024 год) .

А

Б

В

Г

Д

Е

Рис. 3. Морфология колоний (А, Г) и клеток (Б, В, Д, Е, Nicon ECLIPSE Ci-L, «Nicon», Япония, увеличение 100½16) изолятов Rhodotorula mucilaginosa Chli 49 (верхний ряд) и R. mucilaginosa Chc 65 (нижний ряд) , выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы и культивируемых на среде ДАП (температура 30±1 ° C) (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2023 год) .

1. Способность дрожжей Rhodotorula mucilaginosa , выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы, утилизировать источники углерода ( n = 26; ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2024 год)

Источник углерода	Число изолятов		Источник углерода	Число изолятов
	« - »	«+»		« - »	«+»
Адонит	26	0	L-арабиноза	16	10
Арабитол	26	0	Мальтоза	16	10
Дульцит	26	0	Трегалоза	15	11
Инозит	26	0	Мелецитоза	14	12
Ксилитол	26	0	Салицин	14	12
Лактоза	26	0	Ксилоза	13	13
Мелибиоза	26	0	Глицерол	12	14
Натрия глюконат	26	0	Инулин	10	16
ONPG	26	0	Сорбоза	10	16
Сорбит	26	0	Гидролиз эскулина	8	18
Малонат	26	0	Галактоза	5	21
Эритрит	26	0	Цитрат	5	21
L-рамноза	26	0	Глюкоза	0	26
a -Метил-D-глюкозид	21	5	Декстроза	0	26
Маннит	21	5	Манноза	0	26
Рамноза	21	5	Раффиноза	0	26
D-Арабиноза	17	9	Сахароза	0	26
Целлобиоза	17	9	Фруктоза	0	26

Примечание. ONPG — орто-нитрофенил- p -D-галактопиранозид.

Наши данные свидетельствуют, что штаммы R. mucilaginosa могут использовать простые сахара, при этом D. Torres-Alvarez с соавт. (38) сообщали, что R. mucilaginosa может использовать и сложные сахара в качестве предшественников своего центрального метаболизма. Rhodotorula отличается от Cryptococcus неспособностью усваивать инозитол (38). Мы проанализировали способность выделенных изолятов утилизировать широкий спектр субстратов. В наших опытах штаммы R. mucilaginosa дали положительный результат в тесте на ассимиляцию таких сахаров, как глюкоза, сахароза, фруктоза, лактоза, что согласуется с данными, полученными К. Begum с соавт. (39).

Размер клеток чаще всего характеризуют длинной и короткой осью, однако более объективно определять площадь эллипса. Также для характеристики формы определяли коэффициент удлиненности К у — отношение длинной оси к короткой (40). Были определены размеры клеток, площадь и коэффициент удлиненности, которые зависят от штамма, возраста клеток, физиологического состояния и условий их культивирования. Клетки дрожжей были субшаровидными или яйцевидными, без спор. Размножение происходило многосторонним или полярным почкованием. Максимальную площадь клетки имели штаммы Chli 32 (4,364 мкм²) и Sr 16 (4,714 мкм²), наибольший коэффициент удлиненности — штаммы Pf 22 (1,821 при длине клетки 3,069±0,100 мкм и ширине 1,685±0,033 мкм) и Chc 8 (1,685 при длине 2,727±0,098 мкм и ширине 1,619±0,034 мкм). Штаммы Chc 65 и Pf 13 имели площадь клетки 4,121 и 4,298 мкм², при этом К у у них составлял 1,414; 1,520, соответственно форма клеток у этих штаммов была более вытянутой. Минимальную площадь клеток отмечали у штамма Chc 6 (1,786 мкм²). Штамм Chli 49 имел площадь клетки 2,37 мкм², коэффициент удлиненности 1,13, длину и ширину соответственно 1,846±0,056 и 1,634±0,057 мкм (табл. 2).

2. Морфологическая характеристика изолятов дрожжей Rhodotorula mucilaginosa , выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы ( n = 85, M ±SEM; ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2024 год)

Изолят	Длина клетки, мкм	1 Ширина клетки, мкм	K y	7 Площадь клетки, мкм2
Chli 32	2,748±0,216	2,022±0,218	1,359	4,364
Chli 49	1,846±0,056	1,634±0,057	1,130	2,370
Chc 65	2,724±0,075	1,926±0,051	1,414	4,121
Cm 17	1,944±0,035	1,843±0,038	1,055	2,814
Cr 32	1,982±0,054	1,321±0,027	1,501	2,056
Sr 40	2,630±0,166	1,660±0,078	1,584	3,429
Cm 70	2,642±0,135	1,676±0,085	1,576	3,478
Chc 60	2,767±0,085	1,696±0,063	1,632	3,685
Pf 10	1,788±0,046	1,678±0,041	1,065	2,356
Sr 18	2,069±0,051	1,588±0,038	1,303	2,580
Sr 89	1,944±0,035	1,554±0,066	1,251	2,373
Pf 26	1,798±0,094	1,506±0,062	1,194	2,127
Chc 6	1,847±0,063	1,231±0,049	1,500	1,786
Pf 11	2,223±0,048	1,476±0,035	1,506	2,577
Pf 77	2,251±0,054	1,806±0,052	1,246	3,193
Pf 39	2,226±0,087	1,644±0,077	1,354	2,875
Pf 13	2,884±0,076	1,897±0,044	1,520	4,298
Pf 22	3,069±0,100	1,685±0,033	1,821	4,062
Sr 16	2,794±0,116	2,148±0,053	1,301	4,714
Sr 24	2,383±0,124	1,862±0,137	1,279	3,485
Sr 9	2,117±0,086	2,025±0,086	1,045	3,367
Chc 12	2,034±0,103	2,077±0,116	0,980	3,319
Chc 2	2,621±0,084	1,678±0,054	1,562	3,453
Sr 14	1,893±0,046	1,394±0,040	1,357	2,073
Chc 8	2,727±0,098	1,619±0,034	1,685	3,466
Chc 7 Примечан	1,501±0,034              1,736±0,051 ие. K y — коэффициент удлиненности.		0,864	2,046

Образцы биомассы изолятов были проанализированы на содержание каротиноидов для оценки целесообразности их использования в биотехнологическом процессе и кормлении сельскохозяйственных животных и птицы. После разрушения дрожжевых клеток окрашенная фракция была связана с клеточным осадком. При дальнейшей экстракции ацетоном происходил выход окрашенных соединений (в том числе каротиноидов различной природы) в супернатант. На рисунке 4 приведены спектры УФ-види-мого поглощения растворов с контрастным содержанием вторичных метаболитов каротиноидной природы.

Рис. 4. Спектры поглощения раствора вторичных метаболитов в смеси гексан-этилацетат (50:50, о/о) для образцов изолята Rhodotorula mucilaginosa Chc 65 (А) и изолята Sr 16 (Б) , выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы (ФГБНУ

ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2025 год) .

В дальнейшем при анализе концентрации экстрагированных пигментов учитывали следующие характеристики: сырая биомасса (г); общий объем кислотно-ацетонового экстракта (мл); поглощение при λ = 450 нм (опт. ед.) (наличие соединений β -каротиноидной природы); поглощение при λ = 509 нм (опт. ед.) (наличие соединений группы торулина); поглощение при λ = 537 нм (опт. ед.) (наличие соединений ретинола). Пример расчета суммарного содержания каротиноидов c учетом экспериментальных значений поглощения на реперных длинах волн приведен в таблице 3.

• 3.    Расчет суммарного содержания каротиноидов в клеточной биомассе дрожжей изолята Rhodotorula mucilaginosa Pf 39, выделенного из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы (ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2025 год)

  Показатель	Значение
  Масса, г	15,28
  Объем экстракта, мл	30,00
  Поглощение при длинах волн, опт.ед.:
  λ = 450 нм	0,461
  λ = 537 нм	0,187
  λ = 509 нм	0,251
  С1, мкг/мл	3,9 0,461 + 1,8 0,187 - 3,6 0,251 = 1,23
  С2, мкг/мл	5,3 0,254 - 6,7 0,187 = 0,07
  С3, мкг/мл	6,7 0,187 - 1,1 0,251 = 0,98
  Общая концентрация каротиноидов (С1 + С2 + С3), мкг/мл	2,28

• 4.    Содержание каротиноидов в сырой биомассе изолятов дрожжей Rhodotorula mucilaginosa , выделенных из содержимого желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы ( n = 5, M ±SEM ; ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 2025 год)

  Изолят	Содержание каротиноидов,	мкг/г Изолят	Содержание каротиноидов, мкг/г
  Chli 32*	22,86 ± 0,11	Pf 11	4,81 ±0,05
  Chli 49*	21,71 ±0,09	Pf 77	4,24 ±0,05
  Chc 65*	18,05 ±0,08	Pf 39	3,50 ±0,05
  Cm 17*	15,08 ±0,08	Pf 13	3,35 ±0,04
  Cr 32*	11,74 ±0,09	Pf 22	3,32 ±0,04
  Sr 40*	11,24 ±0,10	Sr 16	3,00 ±0,04
  Cm 70	9,61 ±0,09	Sr 24	2,66 ±0,03
  Chc 60	7,25 ±0,07	Sr 9	1,95 ±0,03
  Pf 10	6,33 ±0,08	Chc 12	1,90 ±0,02
  Sr 18	6,28 ±0,07	Chc 2	1,77 ±0,01
  Sr 89	6,19 ±0,08	Sr 14	1,74 ±0,02
  Pf 26	5,89 ±0,07	Chc 8	0,81 ±0,02
  Chc 6	5,03 ±0,05	Chc 7	0,24 ±0,01
  Примечан	ие. Зв¸здочкой (*) выделены образцы с наибольшим содержанием каротиноидов в сырой
  биомассе (более 10 мкг/г).

На основании представленных расчетов было определено общее содержание каротиноидов, выделенных из разрушенной биомассы дрожжей Rhodotorula sp. (см. табл. 3). У всех проанализированных образцов преобладала p-каротиноидная природа соединений в целевой фракции экстракта (табл. 4). Ряд образцов содержал крайне мало каротиноидов (Chc 2, Chc 7, Chc 8). Были определены изоляты с максимальным содержанием каротиноидов — Chli 32, Chli 49, Chc 65, Cm 17, Cr 32, Sr 40.

Для вида R. mucilagenosa был ранее описан ряд штаммов с различной продуктивностью по каротиноидам. Например, в исследованиях R. Sharma (41) — 819,23 мкг/г; D. Torres-Alvarez с соавт. (38) — 317 мкг/г; Y.-T. Cheng и C.-F. Yang (42) — 376,3 мкг/г; T.V.D. Rodrigues с соавт. (43) — 121.3 мкг/г; K. Chreptowicz с соавт. (44) — 0,25-10,33 мг/л. Особенность вида состоит в существенной зависимости продукции как дрожжевой биомассы, так и каротиноидов, от метода культивирования (45). Данные по продуктивности каротиноидов штаммами R. mucilagenosa дают основания рассматривать полученные в настоящей работе изоляты как перспективный источник каротиноидов при оптимизации условий культивирования.

Таким образом, на основе молекулярно-генетического анализа (секвенирование региона 5.8S-ITS рДНК) 26 изолятов дрожжей, выделенных из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птицы, были идентифицированы как Rhodotorula mucilaginosa , что подтверждено высокой (99 %) гомологией с референсными последовательностями из базы данных NCBI. Морфобиохимическая характеристика изолятов выявила значительную внутривидовую вариабельность. Все штаммы проявили способность к утилизации широкого спектра углеводов (глюкоза, сахароза, фруктоза и др.), демонстрируя метаболическую пластичность. Оптимальный температурный диапазон для роста составил 19-30 ° C, что соответствует мезофильным условиям. Морфометрический анализ показал разнообразие размеров и формы клеток: площадь клеток варьировала от 1,786 мкм² (штамм Chc 6) до 4,714 мкм² (штамм Sr 16), а коэффициент удлинtнности — от 0,864 (штамм Chc 7) до 1,821 (штамм Pf 22). Спектрофотометрический анализ экстрактов из биомассы дрожжей, культивируемых в контролируемых условиях, позволил количественно определить содержание каротиноидов. Среди всех изолятов были выявлены шесть наиболее продуктивных штаммов: Chli 32 (22,86 мкг/г сырой биомассы), Chli 49 (21,71 мкг/г), Chc 65 (18,05 мкг/г), Cm 17 (15,08 мкг/г), Cr 32 (11,74 мкг/г) и Sr 40 (11,24 мкг/г). В экстрактах преобладали соединения в -каротиноидной природы. Эти 6 изолятов (Chli 32, Chli 49, Chc 65, Cm 17, Cr 32, Sr 40) отобраны для дальнейшего подбора условий культивирования и использования в составе кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птицы.