SDS-ПААГ электрофорез запасных белков семян смородины чёрной

Материалы и методика исследований

Для исследования были подобраны 7 сортообразцов смородины чёрной из коллекции ВНИИСПК (3 сорта – Искушение , Кипиана , Минай Шмырёв и 4 формы – 3268-4-36, 2091-39-32, 3190-44-57, 322-47-30). Среди подобранных сортообразцов есть сортообразцы близкие по данным родословных и имеющие различное происхождение .

Для оценки генетического разнообразия проводили посемянной анализ ( по 50 семян каждого сорта , полученных от самоопыления ). Для анализа использовали водно - солевые экстракты семян , а присутствие высоких концентраций додецилсульфат натрия и меркаптоэтанола обеспечило получение наиболее многокомпонентных спектров . SDS- ПААГ электрофорез проводили в 12,5 % ПААГ [8].

Результаты электрофореза фиксировали путём консервирования пластин или сканирования с последующей записью белковых формул .

В качестве эталонного спектра использовали спектр сои , поскольку белки семян большинства сортов сои идентичны и содержат стабильные и легко идентифицирумые компоненты . Реперные компоненты белков семян сои расположены в зоне медленных компонентов , компонентов со средней подвижностью и в зоне быстрых компонентов . Белки семян сои были успешно использованы для нумерации белков гороха , овощных культур ( огурца , кабачка , перца и моркови ) [2, 9]. Белки семян сои наносили на гелевые пластиды рядом с белками семян смородины чёрной .

Для проверки различий между сортообразцами на существенность был проведён анализ частот типов белкового спектра при помощи критерия χ ² квадрат – определение достоверности различия двух распределений с одинаковой системой классов , с одинаковыми границами [10].

Результаты и их обсуждение

На полученных нами спектрах можно выделить четыре зоны с подвижностью компонентов : 10-40 (I), 4367 (II), 85-100 и 105-110 ( рис . 1).

к 3

Рисунок 1 – Электрофореграмма сортообразца Искушение (цифрами справа отмечены зоны спектра, на спектре сои отмечена подвижность реперных компоненты)

При идентификации по всему спектру нами было выявлено большое многообразие типов спектров . Для уменьшения гетерогенности и увеличения частоты встречаемости отдельных генотипов целесообразным оказалось проводить оценку по части спектра или зоне . В связи с тем , что зоны 2 и 3 наиболее гетерогенны и характеризуются присутствием мажорных , интенсивно окрашенных компонентов , идентификацию генотипов проводили с учётом компонентов этих зон .

При учёте мажорных компонентов и их интенсивности в зонах 2 и 3 было выявлено соответственно 9 и 4 типа спектров ( таб . 1).

Таблица 1 – Полипептидный состав белков семян исследованных сортообразцов в зонах 2 и 3

Зона 2
Тип спектра	Подвижность и интенсивность окрашивания полипептидов, балл
	46	48	50	52	53
1		1	2	1
2	1	1	1	1	1
3		1	1	1	1
4	1	1		1
5	1	1		2	1
6		1		1	1
7	2	2	1	1
8	2		2	2
9	1		2	1
Зона 3
Тип спектра	Подвижность и интенсивность окрашивания полипептидов, балл
	85	86	88	90	92
1	1			2	2
2	1			2	1
3				2	1
4		2	2	1

При посемянном анализе электрофорез выявляет две категории сортов : монотипные по данному белку и политипные . Первые дают лишь один тип спектра маркерного белка , в то время как политипные сорта состоят из двух и более белковых типов [8]. Среди исследованных сортообразцов политипными оказалось большинство ( Искушение , 3268-4-36, Минай Шмырёв , 2091-39-32, Кипиана , 3190-44-57), а монотипным только один сортообразец (322-47-29) ( таб . 2).

Таблица 2 – Частоты встречаемости типов спектров белков семян зоны 2 и 3 у исследованных сортообразцов смородины чёрной

сортообразцы	типы спектров зоны 2
	1	2	3		4		5	6	7	8	9
Искушение	55	29	9		2		4	2
3268-4-36	44	6	15		10		21	4
Минай Шмырёв	98								2
2091-39-32	25						6			66	3
Кипиана										70	30
3190-44-57										39	61
322-47-29										100
сортообразцы	типы спект			ров зоны 3
	1	2		3			4
Искушение	54	30		17
3268-4-36	48	31		21
Минай Шмырёв	7	91		2
2091-39-32						100
Кипиана						100
3190-44-57						100
322-47-29						100

Количество типов спектра в пределах сортообразца колеблется от 1 (322-47-29) до 6 ( Искушение ) в зоне 2 и от 1 ( Кипиана , 322-47-29 и др .) до 3 ( Искушение и др .) в зоне 3. Отсутствие гетерогенности обнаружили у сортообразца 322-4729. У него белковые спектры состоят из одного типа как в зоне 2, так и в зоне 3.

Как правило , у политипных сортов определяющими являются 1…3 биотипа , на которые приходиться 80-90% сорта [8]. У сортообразца Минай Шмырёв ( рис . 2) более 90% встречающихся типов спектров представлены одним спектром ( тип спектра № 1 в зоне 2 и № 2 в зоне 3). У сортообразца Искушение более 80% приходиться на 2 типа спектра ( № 1 и 2 в зоне 2 и в зоне 3). У сортообразца 3268-4-36 80% составляют 3 типа спектра ( № 1, 3, 5 в зоне 2 и № 1, 2 и 3 в зоне 3). Сортообразцы 2091-39-32, Кипиана , 3190-44-57 характеризуются сочетанием двух типов спектров в зоне 2 ( №№ 1 и 8, №№ 8 и 9, №№ 8 и 9, соответственно ), в то время как в зоне 3 имеют только один тип спектра ( № 4). Сортообразцы Кипиана и 3190-44-57 имеют одинаковое сочетание типов спектров , но частота встречаемости данных спектров различна : у Кипианы 70% приходиться на тип спектра № 8 и 30% на № 9, в то время как у сортообразца 3190-44-57 тип спектра № 9 преобладает (61%).

Спектры семян сорта Минаи Шмырёв

Спектры семян сорта Минаи Шмырёв

Рисунок 2 – Электрофореграмма сортообразца Минай Шмырёв

Таким образом, все исследованные сортообразцы характеризуются уникальным соотношением частот типов спектров зоны 2. Анализ частот встречаемости типов белкового спектра зоны 2 при помощи критерия χ2 – определение достоверности различия двух распределений с одинаковой системой классов, с одинаковыми границами [9] – показал наличие достоверных различий между всеми сортообразцами. Аналогичный анализ частот типов белкового спектра зоны 3 показал наличие достоверных различий между сортообразцами за исключением ряда сортообразцов, имеющих одинаковую (2091-39-32, Кипиана, 3190-4457, 322-47-39) или близкую (3268-4-36 и Искушение) структуру белкового спектра в зоне 3. Несмотря на наличие очевидных визуальных различий спектров зоны 3 у ряда сортообразцов (рис. 3), использование этой зоны не позволяет различить все исследованные сортообразцы в отличие от зоны 2, характеризующейся более разнообразными спектрами и их сочетанием, индивидуальным для всех сортообразцов.

Спектр сои

Рисунок 3 – Электрофореграмма сортообразцов 322-47-29 и Искушение

- Зона 3

Таким образом , результаты анализа электрофоретических спектров белка показали , что полипептиды белков семян изученных сортообразцов смородины чёрной полиморфны . Аналогичные выводы получены при анализе белков семян красной и малоцветковой смородин [7, 4].

Большинство изученных сортообразцов характеризуются сочетанием определённых типов спектров с различной частотой , проявляя значительный полиморфизм генотипов , за исключением сортообразца 322-47-29, у которого белковый спектр состоит из одного типа . По данным Арсеньевой (1995), у 86% изученных сортов красной смородины выявлен значительный полиморфизм генотипов , у оставшихся 4 сортов обнаружили отсутствие гетерогенности .

Выводы

Полипептиды глобулинов семян у большинства исследованных сортообразцов смородины чёрной полиморфны .

При проверке различий между сортообразцами чёрной смородины по зоне 2 на существенность с помощью критерия χ ² обнаружено наличие достоверных различий .

В результате SDS- ПААГ электрофореза белков семян смородины чёрной обнаружено , что каждый из изученных сортообразцов достоверно характеризуется определённым сочетанием частот типов спектров .

Таким образом , SDS- ПААГ электрофорез белков семян может быть использован для генетической характеристики смородины чёрной .