Сдвоенный оптический микроскоп для визуализации одиночных "прозрачных" наночастиц

Разработка новых и совершенствование существующих методов визуализации и характеризации нанообъектов различной природы является одним из актуальных направлений в развитии современной науки и техники. Это связано с возрастающими потребностями науки и практики, бурным развитием нанотехнологий, а также с растущими потребностями современной медицины, где нанотехнологии все более широко применяются при создании новых методов диагностики и лечения различных заболеваний.

Для получения информации об изучаемых нанообъектах на наноуровне традиционно используются методы электронной микроскопии, а в последние два десятилетия также методы атомносиловой и ближнепольной оптической микроскопии. Однако эти методы обладают рядом принципиальных недостатков. При использовании просвечивающего электронного микроскопа необходимо приготавливать образец в виде очень тонкой пленки и помещать в условия высокого вакуума, что сильно усложняет процедуру измерений и не всегда возможно. Поток высокоэнергетических электронов, создаваемых в электронном микроскопе, оказывает нежелательное воздействие на анализируемый объект. Не все подлежащие анализу среды обладают нужным поглощением электронов. Методы атомно-силовой микроскопии дают информацию лишь о поверхности и тонком приповерхностном слое образца. Сильное локальное поле наноострия зондовых микроскопов оказывает нежелательное возмущающее воздействие на исследуемую область образца. Информацию, получаемую при таких измерениях, не всегда удается однозначно связать с исследуемыми параметрами изучаемого объекта.

В последние годы для локальной диагностики нанообъектов различной природы были развиты методы оптической микроскопии сверхвысокого пространственного разрешения, основанные на дальнеполевой флуоресцентной микроскопии одиночных молекул (STORM, PALM) и нелинейной флуоресцентной микроскопии (STED). Однако указанные методы и их разновидности также обладают рядом существенных недостатков. Флуоресцентные молекулы, используемые в этих методах в качестве точечных меток, также могут оказывать нежелательное воздействие на образец. В частности, такое воздействие крайне нежелательно при исследованиях биологических объектов. Кроме того, указанные флуоресцентные метки подвержены эффектам фотонаведенного выжигания и мерцания, что также делает их использование проблематичным. Микроскопы, реализующие вышеперечисленные методы, имеют очень высокую стоимость, а операция измерения при их использовании весьма сложна.

Отмеченные недостатки рассмотренных методов диагностики наночастиц объясняют актуальность разработки новых, более оперативных и простых в использовании инструментов для визуализации и характеризации наночастиц и наноструктур. Методы дальнеполевой оптической микроскопии являются перспективным кандидатом для таких целей, т.к. они характеризуются более высокой оперативностью, более низкой ожидаемой стоимостью приборов на их основе, а также потенциально меньшей сложностью в использовании.

Одной из весьма актуальных задач в развитии методов диагностики наночастиц является разработка методов и методик, позволяющих осуществлять индивидуальную диагностику одиночных наночастиц, т.к. усредненные результаты измерений, выполненных с большим ансамблем наночастиц, могут давать сильно искаженную информацию об изучаемых объектах, что вызывается значительным разбросом индивидуальных параметров наночастиц. Кроме того, индивидуальные параметры наночастиц могут заметно изменяться при их взаимном контакте или слипании.

Другой не менее актуальной задачей является разработка методов и приборов для оптической визуализации практически прозрачных наночастиц. К таким частицам относятся частицы, слабо поглощающие свет в выбранном диапазоне длин волн и характеризующиеся коэффициентом преломления, близким к его величине в окружающей среде. Это, например, многие нано- и микрочастицы биологической природы, которые обычно на- ходятся в водных средах (многие белковые молекулы и комплексы, вирусы, внутриклеточные микровезикулы, липосомы, экзосомы и т.п.), а также широкий круг полимерных и других наночастиц органической природы, помещенных в жидкие среды.

Чрезвычайно актуальной задачей разработок в области нанодиагностики является также повышение достоверности разрабатываемых методов. Крайне низкий уровень регистрируемых сигналов и высокий вклад шумов и паразитных сигналов при таких измерениях, серьезные трудности с очисткой образца и удалением нежелательных примесей, а также трудности с проверкой, полученной при измерениях информации с применением альтернативных методов, например с применением электронного микроскопа, делают эту задачу особенно острой. В частности, это крайне важно во многих применениях (например, в задачах медицинской диагностики).

В статье описывается разработанный авторами и испытанный на ряде реальных наночастиц экспериментальный оптический дальнеполевой микроскоп, предназначенный для оперативной визуализации одиночных наночастиц различной природы в жидких средах, включая частицы, слабо поглощающие свет в рабочей области прибора и характеризующиеся коэффициентом преломления, близким к его значению в окружающей частицы среде. Прибор представляет собой сдвоенный дальнеполевой лазерный микроскоп, в котором

Рис. 1. Оптическая схема сдвоенного микроскопа плазмонного резонанса.

Штриховыми линиями справа показаны для примера случаи совпадения результатов детектирования одних и тех же наночастиц двумя методами

совмещены два разных метода: метод плазмонного резонанса (модифицированная версия, позволяющая реализовать режим регистрации световых сигналов от одиночных наночастиц) и метод флуоресцентной микроскопии. Одновременная регистрация наночастиц двумя существенно различающимися методами, которые характеризуются ошибками разной природы, позволяет значительно повысить реальную достоверность обнаружения детектируемых наночастиц, что, в частности, имеет очень большое значение в медицинской диагностике.

ОПТИЧЕСКАЯ СХЕМА И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ПРИБОРА

Разработанный прибор для оптической визуализации одиночных наночастиц состоит из двух соединенных в единую конструкцию оптических лазерных микроскопов, которые реализуют одновременно два разных метода дальнеполевой микроскопии. Один из них представляет собой модифицированный темнопольный микроскоп поверхностного плазмонного резонанса, а другой — темнопольный флуоресцентный микроскоп с возбуждением наночастиц поверхностной плазмонной волной. Принципиальная оптическая схема созданного прибора приведена на рис. 1.

Микроскоп поверхностного плазмонного резонанса, также как и большинство традиционных микроскопов такого типа, построен по схеме Кречмана. Он состоит из призмы полного внутреннего отражения, на одну из плоскостей которой нанесен нанослой золота. Поверхностная плазмонная эванесцентная волна в этом нанослое возбуждается падающим на одну из граней призмы лазерным пучком, как показано на рис. 1. В нашем случае, в отличие от традиционной схемы, оптические сигналы, возникающие в результате взаимодействия плазмонной волны с осевшими на поверхность золота наночастицами, регистрируются не со стороны нанослоя золота, который расположен на рис. 1 "сверху", а в противоположном направлении, по которому распространяется отраженный от верхней грани призмы луч возбуждающего лазерного излучения (на рис. 1 это направление "вниз, вправо"). Указанное отличие носит принципиальный характер, т.к. оно позволяет использовать "незанятое" верхнее направление для одновременной регистрации исследуемых наночастиц с помощью расположенного сверху флуоресцентного микроскопа. Этот микроскоп позволяет детектировать наночастицы по свечению флуоресценции, которое может возбуждаться в них либо за счет взаимодействия частиц с эва-несцентной плазмонной волной, распространяющейся вдоль поверхности нанослоя золота, либо путем их освещения с применением дополнительного источника излучения, работающего на другой длине волны, чем лазер, возбуждающий плазмонную волну. Если исследуемые наночастицы не флуоресцируют в используемом диапазоне длин волн, их можно метить с применением флуоресцентных меток.

Важной отличительной чертой разработанного микроскопа является то, что при регистрации наночастиц в "плазмонном" канале прибора излучение направляется на нанослой золота не под углом падения, соответствующим точному поверхностному плазмонному резонансу, как это делается в традиционных микроскопах плазмонного резонанса, а при слегка меньшем угле падения (см. рис. 2) [1].

Рис. 2. Значение коэффициента отражения от слоя золота в зависимости от угла падения и величина угла падения лазерного излучения длиной волны 675 нм на нанослой золота, выбранного в проведенных экспериментах

Это позволило существенно повысить отношение сигнала к шуму при детектировании наночастиц, т.к. в таких измерениях указанное отношение определяется изменениями в величине сигнала, вызванного взаимодействием плазмонной волны с наночастицами, а не шумом излучения.

Для возбуждения плазмонной волны использовалось излучение непрерывного диодного лазера с длиной волны 675 нм, мощность излучения варьировалась в пределах 3–8 мВт. Призма изготовлена из стекла SF-10, характеризующегося значением коэффициента преломления 1.725 на выбранной длине волны. Для удобства работы нанослой золота наносился не на призму, а на вспомогательную стеклянную пластинку толщиной 1 мм, изготовленную из того же материала, что и призма. Пластинка устанавливалась на призме с помощью иммерсионной эмульсии, характеризующейся практически тем же значением коэффициента преломления, что и материал призмы ( n = 1.72). Перед покрытием золотом на пластинку наносился промежуточный сверхтонкий слой титана толщиной 5 нм, и после этого наносился слой золота так, что суммарная толщина слоя титан + золото составляла 45 нм. Применение комбинированного нанослоя из двух металлов позволило увеличить контраст наблюдаемого резонанса. Согласно проведенным измерениям, уменьшение интенсивности отраженного сигнала при отражении от такого слоя в условиях точного резонанса доходило до десятых долей процента. С помощью светосильного фотообъектива (относительное отверстие — 1 : 2, фокусное расстояние — 50 мм) отраженное от нанослоя оптическое излучение и излучение, возникающее при взаимодействии наночастиц с плазмонной волной, фокусировались на приемной площадке КМОП-камеры (КМОП — комплементарная структура металл—оксид— полупроводник; на английском CMOS — complementary metal-oxide-semiconductor) с размерами пикселя 2.2 × 2.2 мкм и общей площадью (5.7 × 4.28) мм² (2600 × 1900 пикселей). Камера работала с частотой от 10 до 20 кадров/с. Использование КМОП-камеры вместо обычно применяемой в высокочувствительных оптических микроскопах ПЗС-камеры связано с тем, что в разработанном приборе предельная чувствительность обнаружения анализируемых наночастиц определяется не шумами камеры, а шумами фоновой засветки. Кроме того, при выборе типа камеры были учтены такие факторы, как большее число пикселей и их меньший размер, а также более высокая скорость считывания сигналов.

Флуоресцентное свечение меток в первых опытах возбуждалось тем же диодным лазером с длиной волны 675 нм, который создавал на измерительной поверхности призмы пятно с суммарной мощностью не более 5 мВт. Оно собиралось с помощью светосильного иммерсионного микрообъектива (NA = 1.2, увеличение 60×) и регистрировалось с помощью высокочувствительной охлаждаемой ПЗС-камеры с размерами светочувствительной площадки 8 × 8 мм, состоящей из 1002 × 1004 пикселей размерами 8 × 8 мкм. Возбуждающее излучение подавлялось с помощью набора отрезающих светофильтров, обеспечивающих подавление на уровне до 108.

Измерительная поверхность призмы с покрытой нанослоем золота пластинкой помещена в специально сконструированную проточную кювету с толщиной слоя 1 мм. Через этот объем непрерывно с малой скоростью прокачивалась жидкость, в качестве которой использовалась деионизованная вода или специально приготовленный солевой раствор, а в случае работы с наночастицами биологической природы — физраствор или буферный раствор. Одиночные наночастицы вводились в жидкость после проверки на отсутствие агрегатов. Это достигалось использованием свежеприготовленных образцов в случае липосом и экзосом и предварительной обработкой в ультразвуковой ванне — в случае полистироловых наношариков. Регистрировались те частицы, которые осаждались на поверхность золотого нанослоя. Контроль на отсутствие или малость числа агрегатов осуществлялся непосредственно перед измерением с применением специального лазерного ультрамикроскопа, который позволял наблюдать и анализировать броуновское движение измеряемых наночастиц и таким образом определять их индивидуальные размеры.

РЕГИСТРАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ

С ПОМОЩЬЮ СОЗДАННОГО МИКРОСКОПА

Методики детектирования наночастиц на микроскопе поверхностного плазмонного резонанса отрабатывались в экспериментах по регистрации полистироловых наношариков дискретного ряда размеров 40, 80 и 300 нм и искусственных липосом, размеры которых находились в пределах 40– 100 нм. Отработка методик детектирования на флуоресцентном микроскопе осуществлялась с применением искусственных липосом тех же размеров, что и в предыдущем случае, но меченых флуоресцентными метками на основе молекул красителя Cy 5.5. В обоих каналах — как в канале для измерений на основе плазмонного резонанса, так и в канале для флуоресцентных измерений — была достигнута чувствительность, достаточная для уверенной визуализации одиночных наночастиц всех испытанных типов и размеров. Рассмотрим полученные результаты более подробно.

а

б

Рис. 3. Первый (а) и последний (б) видеокад ры, и з меренные с помощью КМОП-камеры в серии и змере н ий общей длительностью 7.5 с (150 кадров).

П ервый ка др п о л уче н д о ос а жд е ни я н а из мерите ль ну ю п ов е р хн ос ть п олис ти роло вы х на но шари к ов размерами 80 н м . На па нели (в) при ве д е н резу л ь та т вы чита ни я пос л едне г о вид е о ка д ра из пе р в ого. Яркие точ ки соотве тс тв у ю т п о л ож ен ию ос ев ши х н а из м е рительную поверхность призмы наношариков

в

Измерения на микроскопе поверхностного плазмонного резонанса

О дной из гл ав ных экспе р име нт альных т рудно ст ей пр и и з м ер ениях н а со зд анном пл азмонно м м ик ро скопе я вл яется нал ичи е б ол ьшого чи сла м ик ро - и нанодефе кт ов на пов ерхности нанослоя з ол от а, кот ор ые опр ед еляются качеством нанослоя и кот о рые прак т ически нев озмо жн о пол ность ю уд ал ит ь. О н и прив од ят к нежелательным паразит ным сиг нала м , меш ающ им д е т ект иро вать сигна л ы о т исс л еду ем ых нано час т иц. На рис. 3 приведены р езуль т ат ы из м ерения с игна лов о т пов ерх ност и з ол от ого наносл оя (вид е окадры, з ар ег ист риров а н ные с пом о щ ью КМО П - к ам еры) для д вух слу чаев : пр и от сут ст вии на из мер ител ьно й пов ерхно ст и иссл ед у емых наноч астиц — рис 3, а, и при нали ч ии на поверх ност и б ол ь ш ог о чис л а так их час т иц — рис 3 , б . В качестве наночастиц в эт их из м ер ения х и спо льз ов а л и сь пол и ст ирол ов ые на но ш ар ики разм ера м и ~ 80 нм, осаждающиеся на по в ерхно ст ь на носл оя з ол от а из пот о ка п р от екающей жид к ост и, в ко тору ю о ни б ыл и предв ар ител ь но в вед ены. П р иведен ы п ер вы й и по сл едний к адр в серии и зм ерений об щ ей длит ель ност ь ю 7.5 с ( 150 кадров) . Они с в ид ете л ьствуют, что из-за на л ичия в ысо к ог о уровня неж елат ельных оптиче ск их сигналов по лез н ые сигналы п р актиче ск и н е в ид ны.

Для уменьшения влияния дефектов поверхности на результаты измерений программа обработ- ки регистрируемых видеосигналов построена таким образом, что сигналы от первого кадра, полученные при отсутствии на измеряемой поверхности искомых наночастиц, вычитаются из всех последующих кадров. Если за время между первым и любым последующим кадром на измерительную золотую поверхность осела из протекающей вдоль поверхности жидкости хотя бы одна исследуемая наночастица, сигналы во всех кадрах, измеренных после осаждения частицы, изменятся. Изменения будут наблюдаться для тех точек (пикселей), которые соответствуют положению осевшей на измерительную площадку наночастицы. Таким образом, разностный сигнал, полученный при вычитании первого кадра из всех последующих, содержит информацию об осевших за время измерения наночастицах. Сказанное поясняется рис. 3, в, на котором изображены разностные сигналы, соответствующие тем же двум, что и выше, видеокадрам: первому, измеренному до оседания полистироловых наношариков, и последнему, содержащему информацию обо всех осажденных в ходе измерений наночастицах. Рис. 4 демонстрирует форму видеосигналов, получаемых при детектировании полистироловых наношариков, и величину регистрируемых при этом шумов.

С испо льз ованием у к аз анной пр оцедур ы были в ыпол не ны э к сперим ент ы по рег и с т рации оди ноч ных сф еричес ких нано пу з ырь ков ( нанов е з икул), размеры которых находились в пред ел а х

Из об раже н ие

б2

в1

а2

в2

Рис. 4. При ме р ре гистра ци и п ол и с т и р о ловог о на ноша рика ди а метро м 80 нм с п ом ощью с оз да н ного м ик р оскопа пла з м он ного ре з онанс а .

а1, б1 — ф рагменты двух видеока д ро в , из мере н ных с оответ с твен н о д о (рис. 3, а) и п осле (ри с. 3, б ) оса ж д е ни я п ол и с тиролового нан ош арика н а измерител ьн ую поверхн ос ть; в1 — их разность ( ри с . 3, в ) .

а2, б2 — форма сигна л ов в один а ковой д ля всех ка д р о в в и д еостроке, котора я п о м е чена горизонта л ьн ой ч ерной л и нией; в2 — их разность.

Д е м онстрационная строка в ыб ра н а про х од ящ ей по изображ е н и ю н а н оша рик а , в и зуа л ьн о наблюд а е м ому н а в1; е м у н а раз н ост н о м сигн а ле в2 с оотв е т с твует пик >20 у. е., что заметно выше уровня шумов в ви де осигнал е

40–100 нм. В качестве таких нанопузырьков были взяты искусственные липосомы и выделенные из крови человека экзосомы. Липосомы представляют собой наполненные водой нанопузырьки, оболочка которых состоит из одного или нескольких липидных слоев. Экзосомы — это выделяемые клетками в окружающую жидкость нанопузырьки, имеющие гораздо более сложное строение, чем липосомы. Оболочка экзосом (мембрана) состоит из двух липидных слоев, на поверхности и внутри которых имеются белки и углеводы. Внутри экзо- сом содержится большое количество белков, молекул РНК и липидов. Липосомы в зависимости от их размера и числа липидных слоев, характеризуются коэффициентом преломления в пределах 1.36–1.39 [2], а экзосомы ~ 1.37 [3], что очень близко к значению коэффициента преломления воды (1.33) и физраствора для той же длины волны. Учитывая, что указанные наночастицы практически прозрачны в используемой в данных экспериментах области спектра, указанное обстоятельство делало визуализацию таких частиц

Рис. 5. Пример регистрации изображений единичных экзосом на микроскопе плазмонного резонанса.

Поле зрения ~ 800 × 800 мкм

а                                б

Рис. 6. Пример регистрации флуоресцентных изображений одиночных экзо-сом (а) и липосом (б), помеченных флуоресцентными метками красителя Сy 5.5. Поле зрения ~ 300 × 300 мкм сложной задачей. Тем не менее в наших экспериментах нам удавалось наблюдать достаточно достоверно как отдельные липосомы, так и одиночные экзосомы. Пример регистрации изображений одиночных экзосом приведен на рис. 5.

Измерения на флуоресцентном микроскопе

Липосомы и экзосомы, используемые в экспериментах в качестве измеряемых наночастиц, были функционализированы флуоресцентными молекулами цианинового красителя Cy 5.5. Специальных мер для того, чтобы липосомы или экзосо-мы прилипали к поверхности золотой нанопленки не предпринималось. При скорости прокачки водной жидкости через кювету, равной ~ 0.3 мл/мин, на рабочей поверхности призмы размерами 300 × × 300 мкм наблюдалось появление флуоресцентных сигналов от прилипших к измерительной поверхности одиночных наночастиц со скоростью примерно несколько частиц в мин. Чувствительность созданного флуоресцентного микроскопа была достаточна для надежной регистрации практически каждой одиночной наночастицы, меченой молекулами красителя Сy 5.5. Примеры регистра- ции флуоресцентных изображений одиночных липосом и экзосом приведены на рис. 6.

Существенной особенностью меченых флуоресцентными молекулами наночастиц в наших экспериментах был заметный эффект уменьшения интенсивности их флуоресцентного свечения во времени под действием интенсивного возбуждающего лазерного излучения (фотовыжигание). В результате этого эффекта флуоресцентное свечение детектируемых наночастиц практически пропадало за время порядка 1 мин и более после попадания частицы под лазерное излучение. В наших измерениях указанный эффект практически не влиял на их результаты, т. к. сразу после попадания частицы под лазерное излучение, как только она начинала флуоресцировать, ее флуоресцентное изображение детектировалось и запоминалось в памяти компьютера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создан экспериментальный макет сдвоенного оптического дальнеполевого темнопольного мик- роскопа, реализующий одновременное измерение одних и тех же наночастиц, помещенных в водную среду, двумя разными методами: методом, основанном на модифицированной версии микроскопа поверхностного плазмонного резонанса, и методом флуоресцентной микроскопии.

Достигнута чувствительность, позволяющая визуализировать одиночные, прозрачные в рабочей области наночастицы, характеризуемые коэффициентом преломления, близким к его значению в окружающей среде, размерами 40 и более нм.

Работа микроскопа продемонстрирована на примере детектирования одиночных полистироловых наносфер диаметром 80 нм, искусственных липосом, а также выделенных из плазмы крови человека внеклеточных везикул (экзосом), размеры которых варьировали в пределах 40–100 нм.

Работа выполнена в ИСАН в рамках НИР "Развитие методов высокочувствительной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии сверхвысокого разрешения и спектроскопии комбинационного рассеяния для характеризации и изучения точечных нанообъектов и наноструктур".