Секвенирование промоторов генов U6 клещевины (Ricinus communis L.) и создание на их основе векторов для геномного редактирования с помощью системы CRISPR/CAS9
Автор: Александров О.С., Карлов Г.И.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Геномные технологии
Статья в выпуске: 1 т.56, 2021 года.
Бесплатный доступ
Клещевина - важная сельскохозяйственная культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла, широко применяемого в различных отраслях промышленности. Жмыхи и шроты, которые остаются после отжима масла, богаты белком и перспективны для использования в качестве протеиновых добавок при производстве кормов, однако содержат токсины - белок рицин и алкалоид рицинин. Одним из способов детоксификации клещевины может стать геномное редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9. Эта технология заключается в разрезании целевого участка интактной ДНК ферментом Cas9 при содействии короткого направляющего фрагмента РНК. Доставка в клетку редактируемого растения генов, кодирующих Cas9 и направляющую РНК, часто осуществляется с помощью плазмидных векторов. Для эффективного синтеза направляющей РНК в таких векторах обычно используют промоторы генов, кодирующих малые ядерные РНК. При редактировании двудольных растений чаще всего используют промотор U6 гена арабидопсиса, однако эффективность редактирования повышается, если использовать векторные конструкции с промотором редактируемого растения. В настоящей работе впервые проведена амплификация, секвенирование и анализ промоторов гена U6 клещевины. Найденные последовательности были проанализированы и использованы в конструировании CRISPR/Cas9 векторов для дальнейшего редактирования генов рицина. Нашей целью было изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины ( Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). ПЦР проводили на амплификаторе C-100 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI («Сибэнзим», Россия) и необходимые олигонуклеотиды. При вырезании продуктов рестрикции из геля их очищали с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Анализ полученных последовательностей ампликонов показал, что промоторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77 %. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64 %. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов, которые могут применяться для эффективного редактирования генов клещевины, участвующих в синтезе рицина и рицинина.
Клещевина, промотор, u6 гены, секвенирование, геномное редактирование, crispr/cas9, конструирование векторов
Короткий адрес: https://sciup.org/142229464
IDR: 142229464 | УДК: 633.853.55:575.1:577.21 | DOI: 10.15389/agrobiology.2021.1.20rus
Sequencing of the U6 promoters in castor beans and vector construction for CRISPR/CAS9 genomic editing on their basis
Castor bean is an important crop in many countries. It is mainly used to obtain the castor oil, which is widely applied in various industries. The rich protein cakes and meals are remains after the oil is pressed. They are promising for use as protein additives in the fodder production. However, it is limited due to the presence of toxins. These are ricin protein and ricinine alkaloid. One of such methods can be genomic editing using the CRISPR/Cas9 system. The technology consists in cutting the target region of the intact DNA by the Cas9 enzyme with the assistance of a short guide RNA fragment. The delivery of the Cas9 and guide RNA genes into the cell of the edited plant is often carried out by plasmid vectors. For efficient synthesis of the guide RNA in such vectors, the promoters of small nuclear RNA genes are usually used. In dicotyledonous plants editing, the promoter of the Arabidopsis U6 gene is most often used. In this work, the amplification, sequencing and analysis of the castor bean U6 promoters were carried out at the first time. The obtained sequences were analyzed and used in the construction of CRISPR/Cas9 vectors for the ricin gene editing. Our aim was to study castor bean U6 promoters with help by bioinformatics and molecular genetic approaches. Zanzibar Green and Gibzonskaya varieties of castor bean plants were used in this work. DNA was isolated from young leaves. The preparation of sequences, alignments and homology level calculation were carried out by GenDoc program (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Primers for amplification of castor bean U6 promoters were designed by Primer3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). PCR was performed using a C-100 PCR machine (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). PCR products were separated in 1.5 % agarose gel at 6 B/cm in the Sub-Cell GT electrophoresis camera (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). The amplicons were purified with the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The purified amplicons were cloned into the pAL2-T vector (Evrogen, Russia) according to protocol of manufacturer. In the CRISPR/Cas9 vector construction, the pRGE31, HindIII and SbfI restriction enzymes (Sibenzyme, Russia) and nucleotides were used. Purification of the digested products was carried out with the GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). Bioinformatic search were conducted in the GenBank base, and 12 scaffolds with the castor bean U6 gene were found. Six promoters with intact USE and TATA-box elements of regulation were used in the primer design for amplification with cv. Zanzibar Green and cv. Gibzonskaya DNA matrices. One fragment PCR products were cloned and sequenced. The analysis of the obtained amplicon sequences reveled that promoter regions of two studied varieties were similar. The level of promoter identity from different amplicons ranged within 51-77 %. In comparison of these promoters with ones from other plants, the level of homology was 42-64 %. The promoter sequences with intact USE and TATA-box motifs were used in construction of the CRISPR/Cas9 vectors which can be used for efficient editing of the castor bean genes involved in the ricin and ricinine synthesis
Список литературы Секвенирование промоторов генов U6 клещевины (Ricinus communis L.) и создание на их основе векторов для геномного редактирования с помощью системы CRISPR/CAS9
- Мошкин В.А. Клещевина. М., 1980.
- Азнаурьян М.П., Елошвили Н.Г., Назаров Н.В., Якубович H.H., Мещеряков C.B., Гир-син Ю.А. Использование отходов масложирового производства для приготовления пластичных смазок. Известия вузов, Пищевая технология, 1993, 1-2(212-213): 87-89.
- Naughton F.C. Production, chemistry and commercial applications of various chemicals from castor oil. Journal of the American Oil Chemists' Society, 1974, 51(3): 65-71 (doi: 10.1007/BF00000015).
- Шульпекова Ю.О. Запор и методы его лечения. Приложение РМЖ «Болезни органов пищеварения», 2006, 8(2): 90-96.
- Anandan S., Kumar G.K.A., Ghosh J., Ramachandra K.S. Effect of different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and Technology, 2005, 120(1-2): 159-168 (doi: 10.1016/j.anifeedsci.2004.10.002).
- Гусынин И.А. Токсикология ядовитых растений. М., 1962.
- Ishino Y., Krupovic M., Forterre P. History of CRISPR-Cas from encounter with a mysterious repeated sequence to genome editing technology. Journal of Bacteriology, 2018, 200(7): e00580-17 (doi: 10.1128/JB.00580-17).
- Злобин Н.Е., Терновой В.В., Гребенкина Н.А., Таранов В.В. Сделать сложное проще: современный инструментарий для редактирования генома растений. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2017, 21(1): 104-111 (doi: 10.18699/VJ17.228).
- Andersson M., Turesson H., Nicolia A., Falt A.S., Samuelsson M., Hofvander P. Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Reports, 2017, 36(1): 117-128 (doi: 10.1007/s00299-016-2062-3).
- Sun X., Hu Z., Chen R., Jiang Q., Song G., Zhang H., Xi Y. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Scientific Reports, 2015, 5: 10342 (doi: 10.1038/srep10342).
- Long L., Guo D.D., Gao W., Yang W.W., Hou L.P., Ma X.N., Miao Y.C., Botella J.R., Song C.P. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing in cotton by improved sgRNA expression. Plant Methods, 2018, 14: 85 (doi: 10.1186/s13007-018-0353-0).
- Yan P.U., Chao L.I.U., JiYang L.I., TaShi А., Yan H.U., XiaoDong L.I.U. Different SlU6 promoters cloning and establishment of CRISPR/Cas9 mediated gene editing system in tomato. Scientia Agricultura Sinica, 51(2): 315-326.
- Bernard G., Gagneul D., Dos Santos H.A., Etienne A., Hilbert J.-L., Rambaud C. Efficient genome editing using CRISPR/Cas9 technology in chicory. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(5): 1155 (doi: 10.3390/ijms20051155).
- Marshallsay C., Kiss T., Filipowicz W. Amplification of plant U3 and U6 snRNA gene sequences
- using primers specific for an upstream promoter element and conserved intragenic regions. Nucleic Acids Research, l990, l8(l2): 3459-3466 (doi: l0.l093/nar/l8.l2.3459).
- Chan A.P., Crabtree J., Zhao Q., Lorenzi H., Orvis J., Puiu D., Melake-Berhan A., Jones K.M., Redman J., Chen G., Cahoon E.B., Gedil M., Stanke M., Haas B.J., Wortman J.R., Fraser-Liggett C.M., Ravel J., Rabinowicz P.D. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nature Biotechnology, 20l0, 28: 95l-956 (doi: l0.l038/nbt.l674).
- Horvath D.P., Patel S., Dogramaci M., Chao W.S., Anderson J.V., Foley M.E., Scheffler B., Lazo G., Dorn K., Yan C., Childers A., Schatz M., Marcus S. Gene space and transcriptome assemblies of leafy spurge (Euphorbia esula) identify promoter sequences, repetitive elements, high-quality markers, and a full-length chloroplast genome. Weed Science, 20l8, 66(3): 355-367 (doi: l0.l0l7/wsc.20l8.2).
- Rahman A.Y., Usharraj A.O., Misra B.B., Thottathil G.P., Jayasekaran K., Feng Y., Hou S., Ong S.Y., Ng F.L., Lee L.S., Tan H.S., Sakaff M.K., Teh B.S., Khoo B.F., Badai S.S., Aziz N.A., Yuryev A., Knudsen B., Dionne-Laporte A., Mchunu N.P., Yu Q., Langston B.J., Freitas T.A., Young A.G., Chen R., Wang L., Najimudin N., Saito J.A., Alam M. Draft genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis. BMC Genomics, 20l3, l4: 75 (doi: l0.ll86/l47l-2l64-l4-75).
- Wang W., Feng B., Xiao J., Xia Z., Zhou X., Li P., Zhang W., Wang Y., Meller B.L., Zhang P., Luo M.C., Xiao G., Liu J., Yang J., Chen S., Rabinowicz P.D., Chen X., Zhang H.B., Ce-ballos H., Lou Q., Zou M., Carvalho L.J., Zeng C., Xia J., Sun S., Fu Y., Wang H., Lu C., Ruan M., Zhou S., Wu Z., Liu H., Kannangara R.M., Jergensen K., Neale R.L., Bonde M., Heinz N., Zhu W., Wang S., Zhang Y., Pan K., Wen M., Ma P.A., Li Z., Hu M., Liao W., Hu W., Zhang S., Pei J., Guo A., Guo J., Zhang J., Zhang Z., Ye J., Ou W., Ma Y., Liu X., Tallon L.J., Galens K., Ott S., Huang J., Xue J., An F., Yao Q., Lu X., Fregene M., Lopez-Lavalle L.A., Wu J., You F.M., Chen M., Hu S., Wu G., Zhong S., Ling P., Chen Y., Wang Q., Liu G., Liu B., Li K., Peng M. Cassava genome from a wild ancestor to cultivated varieties. Nature Communications, 20l4, 5: 5ll0 (doi: l0.l038/ncomms6ll0).
- Wu P., Zhou C., Cheng S., Wu Z., Lu W., Han J., Chen Y., Chen Y., Ni P., Wang Y., Xu X., Huang Y., Song C., Wang Z., Shi N., Zhang X., Fang X., Yang Q., Jiang H., Chen Y., Li M., Wang Y., Chen F., Wang J., Wu G. Integrated genome sequence and linkage map of physic nut (Jatropha curcas L.), a biodiesel plant. Plant Journal, 20l5, 8l(5): 8l0-82l (doi: l0.ll ll/tpj. l276l).
- Halling K.C., Halling A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. Nucleic Acids Research, l985, l3(22): 80l9-8033 (doi: l0.l093/nar/l3.22.80l9).
- Tregear J.W., Roberts L.M. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Molecular Biology, l992, l8(3): 5l5-525 (doi: l0.l007/BF00040667).
- Ladin B.F., Murray E.E., Halling A.C., Halling K.C., Tilakaratne N., Long G.L., Houston L.L., Weaver R.F. Characterization of a cDNA encoding ricin E, a hybrid ricin-Ricinus communis agglutinin gene from the castor plant Ricinus communis. Plant Molecular Biology, l987, 9(3): 287295 (doi: l0.l007/BF00l66464).
- Alexandrov O. Study of the upstream ricin gene sequences in different castor (Ricinus communis) varieties as a preliminary step in CRISPR/Cas9 editing. Research on Crops, 2020, 2l(2): 344-348 (doi: l0.3l830/2348-7542.2020.058).
- Александров О.С. Биоинформатический анализ гена рицина Ricinus communis L. и поиск участков-мишеней для его редактирования с помощью технологии CRISPR/Cas9. Актуальная биотехнология, 20l8, 3(26): l6l-l62.
- Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, l990, l2(l): l3-l5.
- Razumova O.V., Alexandrov O.S., Divashuk M.G., Sukhorada T.I., Karlov G.I. Molecular cytogenetic analysis of monoecious hemp (Cannabis sativa L.) cultivars reveals its karyotype variations and sex chromosomes constitution. Protoplasma, 20l6, 253(3): 895-90l (doi: 10.1007/s00709-0l5-085l-0).
- Wang M.B., Helliwell C.A., Wu L.M., Waterhouse P.M., Peacock W.J., Dennis E.S. Hairpin RNAs derived from RNA polymerase II and polymerase III promoter-directed transgenes are processed differently in plants. RNA, 2008, 14(5): 903-913 (doi: l0.l26l/rna.760908).
- Mikami M., Toki S., Endo M. Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice. Plant Molecular Biology, 2015, 88(6): 561-572 (doi: 10.1007/s11103-015-0342-x).
- Domitrovich A.M., Kunkel G.R. Multiple, dispersed human U6 small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies. Nucleic Acids Research, 2003, 3l(9): 2344-2352 (doi: l0.l093/nar/gkg33l).
- Wang P., Zhang J., Sun L., Ma Y., Xu J., Liang S., Deng J., Tan J., Zhang Q., Tu L., Daniell H., Jin S., Zhang X. High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(1): 137-150 (doi: l0.llll/pbi.l2755).
