Селекция Cucumis sativus L. на устойчивость к фузариозу с применением фильтрата культуральной жидкости гриба Fusarium oxysporum Schlectend

У щерб, наносимый сельскому хозяйству болезнями и вредителями, огромен, поэтому одна из наиболее актуальных проблем современной селекции – выведение устойчивых сортов. Широкое распространение и большая вредоносность болезней огурца объясняются трудностью химической защиты и наличием в производстве восприимчивых сортов. Возделывание сорта, устойчивого или слабо поражаемого патогенными организмами, позволяет значительно снизить количество химических обработок, что способствует получению экологически безопасной продукции [8].

Устойчивость растения определяется ритмом роста и развития, анатомическими особенностями листьев, стеблей, цветков, физиологическими и биохимическими особенностями и т.д. Фенотипическое проявление болезни определяется характером внешней среды, наличием условий для заражения и развития болезни. Зная условия можно создавать провокационные фоны для выявления и браковки поражаемых растений [3].

Применяя методы биотехнологии в условиях in vitro , можно задавать различные параметры, как адекватные тем, в каких позже придется расти и развиваться взрослым растениям, так и экстремальные условия выращивания. Особый интерес вызывают работы по получению растений-регенерантов из каллусных и суспензионных культур, прошедших отбор в стрессовых условиях. Культура растительных клеток и тканей представляет собой биологическую систему, в которой отсутствуют регуляторные механизмы, действующие на уровне целого организма. Исследования на однородном клеточном материале позволяют получить результаты по анализу действия абиотических и биотических стрессовых факторов на растительную клетку. Воздействие стрессора на культуру клеток приводит к частичной гибели популяции, но часть клеток выживает. Дальнейшее культивирование выживших клеток на питательной среде без селективного агента позволяет получать растения, толерантными к этому стрессору [3].

Целью наших исследований являлось получение устойчивых к фуза-риозу образцов C. sativus из каллус-ных культур, прошедших отбор в стрессовых условиях, используя в качестве селективного агента фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum .

Методика исследований

В исследованиях использовали линейный материал гибридов C. sativus селекции ВНИИО – филиала ФГБНУ ФНЦО и совместной селекции ВНИИО – филиала ФГБНУ ФНЦО с Агрохолдингом «Поиск», характеризующиеся различной полевой устойчивостью к фузариозу: высокоустойчивые - материнская линия ($) гибрида Активист F i , отцовская линия (j) гибрида Мегаполис F i , отцовская линия (j) гибрида Маленький принц F 1 ; среднеустойчивые - материнские линии ($) гибридов Есаул F 1 и Драгун F 1 , отцовская линия (j) гибрида Форвард F i , материнские линии ($) гибридов Авоська F 1 и Даша F 1 ; слабоустойчивый - отцовская линия (j) гибрида Корнет F 1 ; среднеустойчивые линии – L442/ Olivia, L421/Cupido и восприимчивая линия L417/Afia.

Материалом для исследования служили растения C. sativus , которые культивировали в вегетационных сосудах в условиях лабораторного помещения. В качестве эксплантов для получения пролиферирующей каллусной ткани, способной к морфогенезу, использовали гипокотильные сегменты размером 0,5-1 см, изолированные от молодых растений.

Рис.1. Культура гриба F. oxysporum

Fig. 1. Culture F. oxysporum

Рис. 2. Фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum

Fig. 2. The filtrate of the culture fluid of the F. oxysporum

Стерилизацию эксплантов проводили в ламинарном боксе непосредственно перед внесением на питательную среду. Режим стерилизации эксплантов в экспозициях: мыльный раствор – 1 час; этиловый спирт – 1 мин и концентрация 70%; раствор гипохлорита натрия – 15 мин и концентрации 10% + 2 капли «Твин»; трехкратная промывка стерильной дистиллированной водой [4]. Приготовление питательных сред, введение в культуру и субкультивирование проводили с применением рекомендаций Бутенко Р.Г «Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений» [2], методических рекомендаций «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro » [5]. Для индукции каллусообразо-вания и пассирования каллуса использовали питательную среду Мурасиге и Скуга [10], с добавлением бензиламинопурина (БАП) – 0,1 мг/л и нафтилуксусной кислотой (НУК) – 0,5 мг/л.

В качестве селективного фактора применяли фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum [6], который добавляли в питательные среды MS [10]. Культуральную жидкость (рис.2) получали путем посева суспензии макро- и микроконидий (рис.1) на жидкую питательную среду Чапека, которую культивировали в термостате при температуре 26°С в течение 30 суток.

Суспензионную культуру штамма возбудителя готовили согласно методике Билай [1]. Путем замачивания семян огурца в фильтрате культуральной жидкости в течение 24 часов определяли фитотоксические свойства. Если отмечали угнетение и гибель более 40,0% проростков устойчивой к фузариозному увяданию материнской линии ($) гибрида Активист F i , фильтрат культуральной жидкости считался токсичным [7]. Питательные среды, дистиллированную воду, материалы и инструменты автоклавировали в течение 15 мин при температуре 121°С. Выращивание каллусных культур проводили при температуре 22...24°С, освещенности 2 тыс.люкс и 16-ти часовом фотопериоде.

Экспериментальная часть

Первые признаки индукции каллусо-образования при культивировании гипокотильных сегментов на питательных средах контрольного варианта, содержащих фильтрат культуральной жидкости патогена в концентрациях 2,5%; 5%; 7,5% и 10% в культуре in vitro, визуально обнаруживали на 12-17 сутки в зависимости от состава питательной

Таблица 1. Морфогенез in vitro тканевых культур C. sativus, 1 пассаж, n = 100

Table 1. In vitro morphogenesis of tissue cultures of C. sativus, 1 passage, n = 100

Концентрация фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum , %	Морфогенных эксплантов				почек
	всего		в т. ч. с почками		всего, шт.	на 1 эксплант, Х ср.
	шт.	%	шт.	%
0	96	96 + 2,2	76	79 + 4,1	125	1,3
2,5	81	81 + 4,0	62	76 + 4,3	109	1,3
5	74	74 + 4,3	54	73 + 4,4	92	1,2
7,5	71	71 + 4,6	39	55 + 4,9	74	1,0
10	33	33 + 4,7	9	27 + 4,5	28	0,8

Таблица 2. Морфогенез in vitro тканевых культур C. sativus 2 пассаж, n = 150

Table 2. In vitro morphogenesis of tissue cultures of C. sativus 2 passage, n = 150

Концентрация фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum, % Морфогенных эксплантов Почек 1 пассаж 2 пассаж всего в т. ч. с почками всего, шт. на 1 эксплант, Х ср. шт. % шт. % 0 0 149 99 141 95 + 1,7 164 1,1 10 59 39 + 4,0 32 54 + 4,1 35 0,6 5 0 146 97 + 1,1 140 96 + 1,7 161 1,1 10 95 63 + 3,9 70 74 + 3,4 76 0,8 10 0 146 97 + 1,1 139 95 + 1,7 160 1,1 10 116 77 + 3,4 61 53 + 4,1 69 0,6 среды. Образующийся каллус отличался невысокой интенсивностью роста, имел рыхлую консистенцию и желтозеленую окраску. Морфогенетический потенциал каллусной массы зависел от концентрации селективного агента в питательной среде.

Анализируя влияние различных концентраций фильтрата культуральной жидкости патогена в питательных средах на частоту каллусообразования, необходимо отметить, что по частоте образования почек и побегов в результате культивирования морфогенного каллуса на селективных средах, содержащих фильтрат культуральной жидкости в концентрации 2,5%; 5%; 7,5% и 10%, выявлены существенные различия. В вариантах 2,5%; 5,0% и 7,5% фильтрата культуральной жидкости морфогенетическая активность каллус-ных клеток существенно не снижалась. Интенсивность морфогенеза снижалась более чем в 2 раза (с 81% до 33%) при культивировании эксплантов на среде с 10% фильтратом культуральной жидкости (табл. 1).

Морфогенные каллусные экспланты, отобранные в ходе исследований, суб-культивировали на селективные и не селективные питательные среды, ступенчато увеличивая концентрацию фильтрата культуральной жидкости, для последующего отбора клеточных линий, устойчивых к фитопатогену.

Культивирование каллусных эксплантов, отобранных от первого пассажа на среде с фильтратом культуральной жидкости гриба F. oxysporum, привело к снижению пролиферирующей активности до 63-77%. При переносе морфогенных клеток на селективную среду наблюдали формирование в среднем 0,6-0,8 почек на эксплант. На восстановление пролиферирующей активности каллусных клеток влияло последующее культивирование каллус-ной ткани на среде без селектирующе- го фактора, что позволило получить 97% морфогенных эксплантов. При переносе морфогенных клеток на неселективную среду наблюдали формирование в среднем по 1,1 почки на эксплант. Используемая нами схема культивирования каллусных клеток C. sativus на питательной среде без селективного фактора позволила во втором пассаже повысить пролиферирующую активность до 97% (2 пассаж) (табл. 2).

В третьем пассаже при повторном культивировании каллусных клеток на среде с селектирующим фактором наблюдали гибель каллусной ткани и формирование рыхлой обводненной ткани. Пролиферацию каллусной ткани значительно ингибировало присутствие в питательной среде фильтрата культуральной жидкости патогена в различных концентрациях. Морфогенез уменьшался на 13-55% с повышением концентрации фильтрата культуральной жидкости (табл. 3).

Таким образом, в результате проведенных исследований показана принципиальная возможность адаптации каллусных культур C. sativus к фитопатогену при культивировании на пита-

Рис. 3. Каллусная ткань C. sativus на селективной среде, содержащей фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum Fig. 3. Callus tissue of C. sativus in a selective medium containing the filtrate of the culture fluid of the F. oxysporum

тельной среде с увеличением концентрации фильтрата культуральной жидкости, чередуя культивирование на среде с селективным и без селективного фактора.

В ходе эксперимента у эксплантов, культивируемых в течение трех пассажей на питательной среде, содержащей фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10% (рис. 3), были отобраны устойчивые клетки и получены на их основе побеги и регенеранты (рис.4).

Полученные в 2017 году от устойчивых клеток растения-регенеранты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фильтрату культуральной жидкости гриба F. oxysporum , в последующем оценивали в условиях инфекционного бокса, селекционного центра ВНИИО – филиала ФГБНУ ФНЦО. Инфекционный фон создавали согласно «Методическим указаниям по селекции огурца [9]. Инокулюм F. oxysporum, размноженный на овсе, вносили по 30-40 г на 1 погонный метр в поверхностный слой почвы (5-7 см). На растениях проводили опыление методом инцухта. В результате скре-

Таблица 3. Морфогенез in vitro тканевых культур C. sativus 3 пассаж, n = 150

Table 3. In vitro morphogenesis of tissue cultures of C. sativus 3 passage, n = 150

Концентрация фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum , %			Морфогенных эксплантов				Почек
1 пассаж	2 пассаж	3 пассаж	всего		в т. ч. с почками		всего, шт.	в т. ч. с почками на 1 экспл., Х ср.
			шт.	%	шт.	%
	0	0	150	100	144	96 + 1,8	165	1,1
0		10	68	45 + 4,1	59	86 + 2,8	58	0,8
	10	0	146	97 + 1,1	137	94 + 1,9	148	1,0
		10	109	73+ 3,6	54	50 + 4,1	60	0,6
	0	0	146	97 + 1,1	139	95 + 1,8	148	1,0
5		10	107	71 + 3,7	45	42 + 4,0	66	0,6
	10	0	135	90 + 2,4	128	95 + 1,9	138	1,0
		10	104	69 + 3,7	89	86 + 2,8	75	0,7
	0	0	143	95 + 1,6	134	94 + 1,9	144	1,0
10		10	91	61 + 4,0	80	88 + 2,7	78	0,8
	10	0	138	92 + 2,2	132	95 + 1,8	143	1,0
		10	119	79 + 3,3	83	70 + 3,7	86	0,7

Рис. 4. Побег C. sativus, полученный из каллусной ткани на селективной среде, содержащей фильтрат культуральной жидкости F. oxysporum Fig. 4. Escape of C. sativus obtained from callus tissue in selective medium containing filtrate of culture fluid F. oxysporum щиваний были получены семена, которые в 2018 году также оценивали в условиях инфекционного бокса.

При оценке растений огурца в условиях инфекционного бокса наблюдали увеличение числа устойчивых растений: высокоустойчивые – материнская линия ($) гибрида Активист F i , отцовские линии (J) гибридов Мегаполис F 1 и Маленький принц F 1 ; среднеустойчивые – материнские линии ($) гибридов Есаул F i и Драгун F i , отцовская линия (J) гибрида Форвард F i , материнские линии ($) гибридов Авоська F 1 и Даша F 1 и линии – L442/ Olivia, L421/Cupido; слабоустойчивый – отцовская линия (J) гибрида Корнет; восприимчивая L417/Afia.

Полученные формы C. sativus характеризуются повышенной устойчивостью к фузариозу, так как средний балл поражения снизился с 2,8 до 2,1 (по 4-х балльной шкале) (табл. 4).

Селекция C. sativus на устойчивость к болезням с применением методов биотехнологии в условиях in vitro должна, на наш взгляд, вестись ступенчато, путем постепенного придания селекционному материалу устойчивости к фитопатогену. Получение устойчивых к фильтрату культуральной жидкости гриба F. oxysporum каллусных культур C. sativus методом прямой клеточной селекции, несомненно, открывает широкие перспективы для совершенствования селекционной работы по созданию сортов и гибридов, устойчивых к фузариозу.