Семафорин Sema4D в регуляции TFH-подобных клеток

Фолликулярные хелперные Т-клетки (Т follicular helper cells. Tfli) - субпопуляция CD4'T-лимфоцигов, ответственная за формирование эффективного гуморального иммунного ответа, предполагающего клональную экспансию В-лимфоцитов, переключение классов иммуноглобулинов и «созревание» их аффинности к антигену [Oi. 2016]. Эти процессы протекают в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов и завершаются образованием плазмобластов - активно пролиферирующих и продуцирующих иммуноглобулины клеток, которые, покидая зародышевые центры, финально дифференцируются в плазматические клетки или В-клетки памяти. Маркеры Tfh тесно связаны с функциями этих клеток: хемокиновый рецептор CXCR5 нужен для хоминга Т-лимфоцитов в В-клеточные фолликулы, а функциональная молекула PD-1 регулирует формирование зародышевых центров, выживание В-лимфоцитов и селекцию высокоаффинных плазматических клеток, а также продукцию интерлейкина 21 (IL-21) [Good-Jacobson el ah, 2010: Oi, 2016]. Циркулирующие Till, так называемые ТДь подобные клетки, имеют общие черты с фолликулярными Т-хелперами зародышевых центров [Feng el ah. 201L Morita el ah, 2011]3 поэтому анализ Tlh-подобных клеток периферической крови рассматривается как эффективный альтернативный подход к изучению их аналогов в зародышевых центрах [Т follicular . 2015].

Семафорин Seina4D - многофункциональная молекула, играющая важную роль в процессах аксонального наведения, а также в ангиогенезе и иммунорегуляции [Zhang el al.♦ 2013]. В иммунной системе основным источником Sema4D являются Т-лимфоциты [Kumanogoh el ah, 2002]. Они экс-

(С Куклина Е. М., Некрасова И. В> Валиева Ю. В.3 2016

прессируют семафорив на мембране и частично «сбрасывают» его в ответ на активацию [Wang et al., 2001]* При этом растворимый Sema4D сохраняет функции мембранной молекулы [Wang et aL 2001]* Основной рецептор для Sema4D в иммунной системе* CD72* экспрессируется преимущественно В-лимфоцитами и играет важную роль в ответе этих клеток на антиген [Kumanogoh et aL 2000], поэтому⁷ особый интерес вызывает роль семафори-на в Т-ТВ-клсточных взаимодействиях* В первую очередь* это относится к Tfh-зависимой дифференцировке В-лимфоцитов* Цель настоящей работы -определить вклад эндогенного Sema4D в регуляцию активности Tlh-подобных клеток in vitro, в совместной Т-/В-клеточной культуре на фоне поликлональной активации Т-лимфоцитов* В частности* мы оценили экспрессию функционального маркера PD-1 ТП1-подобными клетками в культуре и эффективность Tlh-зависимой дифференцировки В-лимфоцитов на фоне блокады семафорина.

Материал и методы исследования

Результаты и их обсуждение

Процессы Т-зависимой В-клеточной активации исследовали на модели in vitro. предполагающей совместное культивирование Т-лимфоцитов с аутологичными В-клетками в условиях поликлональной активации Т-лимфоцитов [Т follicular ..** 2015J. При этом активность Tfh-подобных клеток оценивали как косвенно* по экспрессии молекулы PD-L участвующей в реализации функций этих клеток* так и напрямую, по дифференцировке В-лимфоцитов* индуцируемой фолликулярными Т-хелперами*

Культивирование CD41 Т-лимфоцитов в присутствии В-клеток не приводило к статистически значимым изменениям содержания Tfh-подобных (CD4CXCR5 -) клеток ни в спонтанном варианте* ни в случае активации* и блокада Sema4D не оказывала влияния на эти процессы (рис* 1). Анализ функциональной молекулы PD-1 выявил повышение ее экспрессии на мембране CD4'CXCR5'T-лимфоцитов в ответ на активацию, причем на фоне блокады семафорина повышение было недостоверным (рис. I), указывая на участие Sema4D в реализации данного эффекта.

Одновременно с экспрессией PD-1 оценивали непосредственную хелперную активность Tfh-подобных клеток, а именно - способность индуцировать дифференцировку' В-лимфоцитов в плаз-мобласты, которая сопровождается характерными фенотипическими изменениями - появлением и последовательным усилением экспрессии на мембране гликопротеина CD3S. а также утратой В-клеточного маркера CD20 [Jourdan et al . 2011].

Совместное культивирование Т-/В-лимфоцитов сопровождалось значительным увеличением количества плазмобластов (С019'С020 С038'-клеток) в ответ на поликлональную активацию Т-лимфоцитов (рис. 2). причем на фоне блокады Sema4D этот показатель статистически значимо снижался.

Полученные данные свидетельствуют об участии Sema4D в ключевом этапе Т-зависимой дифференцировки В-л им фоцитов. форм ирова НИИ плазмобластов* и о том. что одним из механизмов реализации эффекта семафорина является регуляция активности Tfh-подобных клеток* в частности, повышение экспрессии этими клетками функциональной молекулы PD-L которая защищает В-лимфоциты от апоптоза, поддерживает селекцию высокоаффинных плазматических клеток; а также 2016].

Рис. I* Характеристика Tfh-подобных CD4¹ Т-лимфоцитов ex vivo и в совместной Т-/В-клеточной культуре на фоне поликлональной активации Т-лимфоцитов:

а) содержание СХСК5⁺-клеток в популяции СГМ⁺Т-лимфощтгов; 6) экспрессия PD-1 СХСК5⁺С1)4"^ьТ-лимфощ1таьш. Незапприхованные столбцы - пробы без блокатора; заштрихованные столбцы - на фоне блокады Sema4D. * - р < 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем без активации)

aHni

Рис. 2. Уровень плазмобластов ex vivo и в Т-/В-клеточной культуре.

Незапприхованные столбцы - пробы без блокатора; заштрихованные столбцы - на фоне блокады Sema4D, * -р < 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем без активации); ** -р <0.05 (сопоставление с соответствующим показателем без блокады Seina4l))

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-04-05694.