Симбиотическая эффективность генотипов гороха посевного (Pisum sativum L.) при моделировании в вегетационном эксперименте

Для минимизации химической нагрузки на окружающую среду (снижение использования химических удобрений и средств защиты от патогенов) (1, 2) и негативного действия факторов внешней среды (неблагоприятные погодные условия, влияние патогенов и др.) (3) целесообразно применение микробиологических препаратов, например на основе клу-

Работа финансово поддержана РНФ (грант ¹ 16-16-00118).

беньковых бактерий или арбускулярно-микоризных грибов, положительно влияющих на растения (4, 5). Существуют также препараты, содержащие комплекс полезных почвенных микроорганизмов (6, 7).

Бобовые растения — подходящие культуры для возделывания в рамках современной концепции адаптивного растениеводства, что продемонстрировано для чечевицы (8), сои (9), гороха (10, 11), фасоли (12, 13), нута (14) и других бобовых (15-17). Для успешного использования растительно-микробных систем на основе бобовых необходимо создавать принципиально новые сорта, способные эффективно взаимодействовать с полезными почвенными микроорганизмами (17, 18). Один из способов достижения этой цели состоит в мобилизации генетических ресурсов растений — поиске ценных аллелей генов, способных улучшить симбиотические свойства и ростовые параметры растения при введении в генотип.

Традиционно при селекции бобовых культур на повышение симбиотического потенциала используют признак эффективность азотфик-сации (19-21). Также предложено рассматривать интегральный признак эффективность взаимодействия с полезными почвенными микроорганизмами (ЭВППМ, EIBSM, effectiveness of interactions with beneficial soil microorganisms) (17, 22), который рассчитывается как прибавка по экономически значимым параметрам (биомасса растений, число и общая биомасса семян, а также масса 1000 семян) при обработке микробиологическими препаратами по сравнению с необработанным контролем. Ранее для 25 генотипов гороха в полевых экспериментах была оценена вариабельность проявления признака ЭВППМ и идентифицированы контрастные генотипы (высокоэффективные и низкоэффективные при взаимодействии с полезными почвенными микроорганизмами) (10, 12).

В настоящей работе мы впервые рассмотрели возможность моделирования ЭВППМ в условиях вегетационного эксперимента, а также оценили степень влияния увлажненности почвы на проявление этого признака.

Целью исследования была оценка эффективности взаимодействия двух генотипов гороха (высокоэффективного и низкоэффективного в условиях полевого опыта) с полезными почвенными микроорганизмами в модельном вегетационном эксперименте.

Методика. В работе использовали высокоэффективный в симбиозе с клубеньковыми бактериями генотип к-8274 (Франция, сорт Vendevil) и низкоэффективный к-3358 (Саратовская обл., Россия) гороха посевного ( Pisum sativum L.) из коллекции культурного гороха ВИР (Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова, г. Санкт-Петербург) (23). Растения выращивали в летний сезон 2012 года в вегетационных домиках в сосудах объемом 5 л (по 3 растения на сосуд). Почва — дерново-подзолистая легкосуглинистая (Ленинградская обл., территория НПО «Белогорка») с содержанием С_гум. 1,27 % и N_общ. 0,11 %, рН_сол. 4,92. Агрохимические исследования почвы проводили общепринятыми методами (24). Почву известковали карбонатом кальция.

Применяли следующие варианты обработки: контроль (необработанная почва); клубеньковые бактерии + арбускулярно-микоризные грибы (КБ + АМГ); КБ; минеральные удобрения (NPK). Также сравнивали эффект низкой (30 % от полной влагоемкости, ПВ) и оптимальной (60 % от ПВ) увлажненности (повторность опыта 6-кратная для оптимального полива и 3-кратная — для варианта 30 % от ПВ). Минеральные удобрения (NPK) вносили в виде чистых солей в дозе 0,1 мг д.в. на 1 кг почвы (N0,1P0,1K0,1). Применяли азотнокислый аммоний NH4NO3, фосфорнокислый однозамещенный кальций Са(H2PO4)2•H2O и хлористый калий 608

KCl. Для инокуляции КБ использовали эффективный штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM1026 из коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) (25, 26). Бактерии выращивали в жидкой среде ¹ 79 (K₂HPO₄ — 0,5 г/л; MgSO₄•7H₂O — 0,2 г/л; NaCl — 0,1 г/л; CaCO₃ — следы; маннит — 10 г/л; дрожжевой экстракт — 0,4 г/л) с аэрацией в течение 3 сут. Затем в суспензию бактерий с титром 10⁷-10⁸ клеток помещали стерилизованные семена гороха посевного и выдерживали 12 ч на шейкере (27, 28). Микоризные грибы для инокуляции выращивали на корнях сорго ( Sorghum sp.) в субстрате, состоящем из почвенной смеси с фильтрационно-моечным осадком (ФМО) (6, 29). Использовали смешанный инокулюм, содержащий три изолята АМГ из коллекции ВНИИСХМ: Rhizophagus irregularis (syn. Glomus intraradices ) RCAM8 (= BEG144), R. irregularis BEG53 и Glomus sp. ST3. Перед посадкой иноку-люм АМГ смешивали с почвой из расчета 20 г на сосуд и дополнительно вносили по 1,5 г инокулюма под каждое семя гороха.

Образцы отбирали на стадии бутонизации—цветения через 1 мес после посадки (для подсчета клубеньков и определения сухой биомассы растений) и в конце вегетации примерно через 3 мес после посадки (для определения сухой биомассы растений, биомассы и числа семян).

Статистическую обработку результатов проводили в программе SigmaPlot 12.0 («Systat Software», США). Действие факторов «степень увлажненности» и «обработка» на проявление признаков оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа для каждого из генотипов. Для сравнения вариантов обработки между собой использовали t -критерий Стьюдента. Для оценки массы 1000 семян, рассчитанной по формуле (масса семян с растения/число семян с растения) ½ 1000, применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Результаты. Двухфакторный дисперсионный анализ выявил статистически достоверное негативное влияние низкой увлажненности почвы на все исследованные показатели у низкоэффективного генотипа к-3358 и на большинство — у высокоэффективного к-8274 (табл., рис.).

Влияние различных факторов и их взаимодействия на показатели продуктивности у генотипов гороха ( Pisum sativum L.) в условиях оптимальной и недостаточной увлажненности при обработке (КБ, КБ + АМГ, NPK) и без обработки, выявленное с помощью двухфакторного дисперсионного анализа

Генотип	Фактор	Сухая биомасса надземной части по срокам вегетации		Семена		Число клубеньков
		1 мес	3 мес	число	масса
к-8274	Увлажненность	0,347	< 0,001*	< 0,001*	< 0,001*	0,107
	Обработка	0,004*	0,010*	0,005*	0,034*	< 0,001*
	Взаимодействие двух факторов	0,809	0,090	0,354	0,073	0,002*
к-3358	Увлажненность	< 0,001*	< 0,001*	< 0,001*	< 0,001*	0,011*
	Обработка	< 0,001*	0,0770	0,243	0,291	< 0,001*
	Взаимодействие двух факторов	0,118	0,076	0,212	0,248	0,025*

П р и м е ч а н и е. Оптимальная и недостаточная увлажненность — соответственно 60 и 30 % полной влагоемкости; КБ — клубеньковые бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM1026; АМГ — ар-бускулярно-микоризные грибы, смешанный инокулюм Rhizophagus irregularis (syn. Glomus intraradices ) RCAM8 (= BEG144), R. irregularis BEG53 и Glomus sp. ST3; NPK — N 0,1 P 0,1 K 0,1 . Приведены значения P-value, отражающие степень достоверности действия каждого из факторов и их взаимодействия.

* P < 0,05.

В то же время вариант обработки не оказывал ярко выраженного действия (см. табл., рис.). Следовательно, проявление признака ЭВППМ в сосудах ограниченного объема находилось под сильным влиянием увлажненности почвы, которое превосходило действие симбиотических микроорганизмов и минеральных удобрений.

Cухая биомасса надземной части растений, собранных через 1 (А) и 3 мес вегетации (Б) , г; число семян с растения, шт. (В) ; масса семян с растения, г (Г) ; масса 1000 семян, г (Д) ; число клубеньков, шт. (Е) у генотипов гороха ( Pisum sativum L.) к-8274 (высокоэффективный при взаимодействии с полезными почвенными микроорганизмами в условиях полевого опыта) и к3358 (низкоэффективный) при различной увлажненности почвы и разных вариантах обработки: 1 — контроль (необработанная почва), 2 — клубеньковые бактерии + арбускулярно-мико-ризные грибы (КБ + АМГ), 3 — КБ, 4 — минеральные удобрения (NPK). З — недостаточная увлажненность почвы, Н — оптимальная увлажненность. Данные по варианту КБ + АМГ для к-3358 в условиях недостаточной увлажненности отсутствуют. Значения, обозначенные разными буквами (a, b, c, d), различаются статистически достоверно (P < 0,05) в пределах одного варианта обработки (a отличается от b, при этом ab не отличается от a и не отличается от b).

У к-8274 при низкой увлажненности сухая биомасса надземной части растений, собранных после 1 мес вегетации, не изменялась в зависимости от варианта обработки (см. рис., А). В условиях оптимальной увлажненности была обнаружена достоверная прибавка биомассы в вариантах КБ и NPK по отношению к контролю. У к-3358 изучаемый показатель не изменялся при недостатке влаги, а на фоне оптимальной увлажненности достоверной оказалась прибавка под действием минеральных удобрений, но не клубеньковых бактерий.

Низкая увлажненность усиливала негативное действие обработки КБ + АМГ на сухую биомассу надземной части у растений генотипа к8274, собранных после завершения вегетации (см. рис., Б). Для к-3358 данные по этому варианту обработки отсутствовали. Возможно, образование и поддержание арбускулярно-микоризного симбиоза в условиях де- фицита влаги в ограниченном по размеру сосуде становились для растений энергетически невыгодными. Обработка КБ на фоне низкой увлажненности приводила к уменьшению биомассы у генотипа к-3358, что свидетельствовало о проявлении его низкой эффективности при взаимодействии с симбионтами. В условиях оптимальной увлажненности статистически значимым было действие минеральных удобрений, но не обработки микроорганизмами. Вероятно, в течение длительной вегетации положительный эффект микроорганизмов нивелировалось вследствие стресса, который растения испытывали из-за ограниченного объема сосудов.

Число семян у к-8274 (см. рис., В) снижалось в варианте КБ + АМГ при низкой увлажненности. Обработка только КБ не оказывала значимого влияния на этот показатель у обоих генотипов в условиях как оптимальной, так и низкой увлажненности. Положительное действие минеральных удобрений отмечали для к-8274 и к-3358 при оптимальной влажности, но не при недостатке влаги.

В условиях низкой увлажненности обработка КБ + АМГ негативно влияла на массу семян у генотипа к-8274 (см. рис., Г). Тот же эффект наблюдался при обработке КБ семян к-3358 при недостаточном увлажнении. Повышало массу семян только применение минеральных удобрений при оптимальной увлажненности почвы.

Масса 1000 семян у генотипа к-8274 не зависела от увлажненности в контроле, однако возрастала при обработке КБ (статистически значимо лишь в условиях оптимальной увлажненности) (см. рис., Д). У генотипа к3358 масса 1000 семян, напротив, несколько снижалась при обработке КБ (статистически значимо в условиях недостатка влаги). Это согласуется с результатами полевых испытаний, в которых масса 1000 семян повышалась при обработке микробиологическими препаратами у высокоэффективных генотипов и не изменялась или несколько снижалась у низкоэффективных (10, 22).

Внесение минеральных удобрений отрицательно сказалось на числе клубеньков (см. рис., Е), что было связано с активацией систем авторегуляции (негативного контроля энергозатратного процесса клубенькообразо-вания при достаточном количестве связанного азота в почве) (30, 31). Недостаток влаги приводил к снижению числа клубеньков у генотипа к-3358 при любых вариантах обработки. У обоих генотипов инокуляция КБ (в том числе в варианте КБ + АМГ) на фоне недостатка влаги вызывала подавление клубенькообразования вследствие авторегуляции. В варианте с оптимальным увлажнением наблюдалось уменьшение числа клубеньков у генотипа к-8274 при сочетании КБ + АМГ, что, вероятно, было связано с работой единой системы авторегуляции клубенькового и арбускулярно-микоризного симбиозов (30-32). Число клубеньков при применении только КБ у к-8274 оказалось выше, чем без обработки, что может отражать генетически обусловленную сниженную способность к клубенькообразо-ванию у этого генотипа.

Таким образом, генотипы гороха, у которых в полевых экспериментах проявлялась высокая и низкая эффективность при взаимодействии с клубеньковыми бактериями, в условиях вегетационного опыта демонстрировали аналогичные различия. Например, статистически значимая прибавка биомассы растений через 1 мес после посадки и массы 1000 семян под воздействием инокуляции клубеньковыми бактериями (по отношению к неинокулированному контролю) наблюдалась только у высокоэффективного генотипа к-8274, в то время как у низкоэффективного к3358 по этим показателям положительной связи с инокуляцией не выяви- ли. Напротив, масса семян с растения при инокуляции клубеньковыми бактериями в условиях недостаточной увлажненности достоверно снижалась по сравнению с контролем (без инокуляции). Следовательно, неизвестные пока генетические программы, лежащие в основе проявления признака ЭВППМ, реализуются в вегетационных экспериментах и в полевых условиях сходным образом. Материал, выращенный в вегетационном эксперименте, эквивалентен полученному в полевых условиях и может использоваться для идентификации молекулярных основ генетического контроля признака ЭВППМ при помощи транскриптомного секвенирования.

Итак, для моделирования интегрального признака ЭВППМ (эффективность взаимодействия с полезными почвенными микроорганизмами) на горохе в условиях вегетационных экспериментов рекомендуется использовать не менее 6 повторностей для каждого генотипа. Необходимо тщательно контролировать увлажненность почвы, поскольку стресс, вызванный засухой, маскирует полезное действие микроорганизмов, нивелируя различия между высокоэффективными и низкоэффективными генотипами. Стадия бутонизации—цветения, на которой отмечаются первые различия между генотипами, может быть рекомендована для сбора материала, предназначенного для анализа дифференциальной экспрессии генов, ферментативной активности и определения других физиолого-биохимических маркеров функционирования симбиотических систем.